Abstract
Verminderde ruggenmerg bloedstroom (SCBF) (dwz ischemie) speelt een belangrijke rol in de traumatische dwarslaesie (SCI) pathofysiologie en is daarom een belangrijk doelwit voor neuroprotectieve therapieën. Hoewel diverse technieken zijn beschreven SCBF beoordelen, hebben allemaal belangrijke beperkingen. Om dat laatste te overwinnen, stellen wij het gebruik van real-time contrast versterkte echografie (CEU). Hier beschrijven we de toepassing van deze techniek in een rat kneuzing model van SCI. Een halsader katheter eerst geïmplanteerd voor herhaalde injectie van contrastmiddel, een natrium- chlorideoplossing van zwavelhexafluoride ingekapselde microbellen. De wervelkolom wordt vervolgens gestabiliseerd met een op maat gemaakte 3D-frame en het ruggenmerg dura mater wordt blootgesteld door een laminectomie bij Thix-ThXII. De ultrasone sonde wordt vervolgens geplaatst op het achterste deel van de dura mater (bedekt met echografie gel). Om basislijn SCBF, een enkele intraveneuze injectie (400 pl) van contra beoordelenst middel wordt toegepast op zijn passage op te nemen door de intacte ruggenmerg microvasculatuur. Een gewicht-drop-apparaat wordt vervolgens gebruikt om een reproduceerbare experimentele kneuzing model van SCI te genereren. Contrastmiddel wordt opnieuw geïnjecteerd 15 min na de verwonding aan post-SCI SCBF veranderingen te beoordelen. CEU zorgt voor real-time en in-vivo evaluatie van SCBF veranderingen na SCI. In de niet gewonde dier, echografie toonde ongelijkmatige doorbloeding langs de intacte ruggenmerg. Bovendien 15 min na SCI, was kritisch ischemie op het niveau van het epicentrum terwijl SCBF bewaard gebleven in de meer afgelegen gebieden intact. In de gebieden naast het epicentrum (zowel rostraal en caudaal) werd SCBF aanzienlijk verminderd. Dit komt overeen met de eerder beschreven "ischemische penumbra zone". Deze tool is van groot belang voor het beoordelen van de effecten van therapieën die gericht zijn op het beperken van ischemie en de resulterende weefselnecrose na SCI.
Introduction
Traumatisch ruggenmergletsel (SCI) is een verwoestende aandoening die leidt tot significante verslechtering in de motorische, sensorische en autonome functies. Tot op heden is er geen therapie zijn efficiëntie patiënten aangetoond. Om die redenen is het van belang om nieuwe technieken die de evaluatie van mogelijke behandelingen zal verbeteren en verder verhelderen schade pathiophysiology 1 te identificeren.
SCI is verdeeld in twee opeenvolgende fasen, aangeduid als primaire en secundaire verwondingen. Het primaire letsel komt overeen met de oorspronkelijke mechanische insult. Dat het secondaire verwonding groepen een cascade van verschillende biologische gebeurtenissen (zoals ontsteking, oxidatieve stress en hypoxie) die verder bijdragen tot de geleidelijke uitbreiding van het oorspronkelijke letsel, weefselschade en daarom 2,3 neurologische uitval.
Bij de acute fase van SCI, worden neuroprotectieve therapieën die gericht zijn op het verminderen van de secundaire verwondingen pathologie en shOuld dienovereenkomstig verbeteren neurologische uitkomsten. Onder de vele secundaire schade events, ischemie speelt een cruciale rol 4,5. Op het niveau van de SCI epicentrum, de beschadigde parenchymale microvessels belemmert effectieve ruggenmerg bloedstroom (SCBF). Bovendien SCBF is ook significant in de regio rond het letsel epicentrum, een gebied bepaald zogenaamde "ischemische penumbra zone" verminderd. Als SCBF niet snel kan worden hersteld binnen deze regio, kan ischemie leiden tot aanvullende parenchymale necrose en verder zenuwweefsel schade. Als zelfs de geringste weefsel behoud substantiële effecten van de functie kan hebben, is het van groot belang zijn voor geneesmiddelen en therapieën die kunnen verminderen ischemie post-SCI ontwikkelen. Om dit fenomeen te markeren heeft voorgaand werk aangetoond dat het behoud van slechts 10% van gemyeliniseerde axonen was genoeg voor het lopen mogelijk bij katten na SCI 6.
Hoewel diverse technieken zijn beschreven SCBF het beoordeleny hebben allemaal aanzienlijke beperkingen. Bijvoorbeeld, het gebruik van radioactieve microsferen 7,8 en C14-iodopyrine autoradiografie 9 vereist daaropvolgende offeren van dieren en kunnen niet worden herhaald op latere tijdstippen. De waterstof wordt gezuiverd 10 afhankelijk van de invoeging van intraspinale elektroden die het ruggenmerg verder beschadigen. Terwijl laser Doppler imaging, plethysmografie 14,15 en in vivo lichtmicroscopie 16 een bijzonder beperkte diepte / meetgebied 11-13.
Ons team heeft eerder aangetoond dat contrastversterkte ultrasoon (CEU) beeldvorming kan worden gebruikt voor het real time beoordelen en in vivo de SCBF veranderingen in de rat ruggemerg parenchym 17. Het is belangrijk op te merken dat een soortgelijke techniek Huang et al toegepast. In een varkensmodel van SCI 18. CEU geldt een specifieke vorm van echografie, die het mogelijk maakt om grijswaarden morfologische im associërenleeftijden (verkregen door de conventionele B-mode) met ruimtelijke verdeling van de bloedstroom 19. De SCBF beeldvorming en kwantificatie vertrouwt op intravasculaire injectie van echo-contrastmiddelen. Het contrastmiddel bestaat uit zwavelhexafluoride microbellen (gemiddelde diameter van ongeveer 2,5 pm en 90% een diameter kleiner dan 6 um) gestabiliseerd door fosfolipiden. De microbellen tijdens de ultrasone bundel uitgezonden door de probe zo bloed-echogeniciteit verbeterd en wordt het contrast van de weefsels volgens de bloedstroom. Het is derhalve mogelijk om de bloedstroom te evalueren in een bepaalde regio van belang volgens de intensiteit van het gereflecteerde signaal. De microbellen zijn ook veilig en ze zijn klinisch toegepast bij de mens. Het zwavelhexafluoride snel geklaard (gemiddelde terminale halfwaardetijd is 12 min) en meer dan 80% van de toegediende zwavelhexafluoride wordt teruggevonden in de uitgeademde lucht binnen 2 min na injectie. Dit protocol voorziet in een eenvoudige manier om CEU im gebruikenaging te SCBF veranderingen in de rat te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: De in dit manuscript beschreven methoden werden goedgekeurd door de bio-ethiek commissie van de Lariboisière School of Medicine, Parijs, Frankrijk (CEEALV / 2011-08-01).
1. Instrument Voorbereiding
- Voorbereiden en reinigen van de volgende instrumenten voor het inbrengen van de katheter: micro-tang, micro-schaar, micro-vasculaire klem, grote schaar, chirurgische draad (zwart gevlochten zijde 4-0) en een 14 G katheter. Heparinize de katheter met een heparineoplossing (5000 U / ml).
- Voorbereiden en reinigen van de volgende instrumenten voor de laminectomie: grote schaar, scalpel en een bot mes. Voer laminectomie met een op maat gemaakte bot mes ontworpen om het risico van nadelige gevolgen voor het ruggenmerg in de laminectomie (figuur 1) te verminderen.
- Opstelling 3D-frametype voor de positionering en stabilisatie van het dier. De op maat gemaakte frame is gebouwd met de elementen van een externe Fixator Hoffman 3 in samenwerking met een pincet, which zijn gekromd teneinde de lumbale wervelkolom van het dier past.
- Bereid de gewicht-drop-apparaat (impactor) gebruikt voor het ruggenmerg biomechanisch letsel.
OPMERKING: De op maat gemaakte impaction apparaat is ontworpen met een 3D-software en afgedrukt in 3D. - Zet op de echo machine.
- Bereid de kit voor reconstitutie van het contrastmiddel.
LET OP: De kit bevat 1 flacon met 25 mg gevriesdroogd poeder, 1 voorgevulde injectiespuit met 5 ml natriumchloride en één mini-spike transfersysteem (figuur 2). De stappen voor het oplossen van het contrastmiddel worden hieronder (in hoofdstuk 5).
2. halsader catheterisatie (figuur 3)
- Verdoven van het dier met 4% isofluraan. Plaats het dier in rugligging. Ga na verdoving door ervoor te zorgen dat het dier niet reageert wanneer de poten worden geknepen met een pincet. Breng vet zalf op de ogen tot droog terwijl und voorkomener anesthesie.
- Scheer de nek en het reinigen van de huid. Maak een incisie op de middellijn van de nek. Trek de sternocleidomastoidian spier in om de interne halsader vinden. Draai een ligatuur bij de rostrale deel van de ader.
- Breng een microvasculaire klem op de ader, 1 cm onder de ligatuur. Leid andere draad rond de ader, juist onder de klem met de knoop klaar te zijn scherpen wanneer de klem wordt vrijgegeven.
- Open de wand van de ader (venotomie) tussen de klem en de rostrale ligatuur. Introduceer een 14 G katheter in het lumen van de vene en duw in de richting van het hart.
- Als het gaat tegen de klem, laat de laatste en verder te duwen de katheter. Zet de katheter in de ader, door stevig aandraaien van de knoop op de ader met de catheter binnen.
- Beoordelen doorgankelijkheid van de catheter door het onttrekken van een kleine hoeveelheid van veneus bloed in de katheter en vervolgens daarna spoelen met gehepariniseerde zoutoplossing. Dit voorkomt verstopping van de catheter door een potentiële bloedstolsel.
- Verbinding flexibele slang aan de katheter voor verdere injectie van contrastvloeistof (microbellen). Houd het gesloten (gesloten) tot klaar voor gebruik.
3. Toegang tot de Spine, Laminectomie en Rat Positioning (in de 3D-beeld)
- Plaats het dier in een flat vatbaar horizontale positie. Scheren en reinigen van de rug (thoracale regio) van het dier.
- Identificeer de laatste rib (de dertiende in de rat) door palpatie (figuur 4). Dit maakt het mogelijk om de locatie van de dertiende borstwervel (ThXIII) te schatten.
- Maak een 4 cm huidincisie op de middellijn, gecentreerd op ThXIII. Open de huid incisie en de onderliggende bursa. Let op de aponeurosis van rugspieren, alsmede de uiteinden van de wervels wervelkolom processen.
- Zorgvuldig lokaliseren de ruggengraat proces van ThXIII door palperende de XIIIe ribben.
OPMERKING: De dertiende rib is verbonden met ThXIII en dus staat voor een eenvoudig te locate anatomische mijlpaal voor de identificatie van ThXIII. Deze stap maakt de lokalisatie van de ThXII te processus spinosus en L1 en L2 (eerste en tweede lumbale wervels) Thix. - Snijd de gespierde aponeurose en losmaken van de spieren aan weerszijden van de doornuitsteeksels, de lamellen en de facetgewrichten van Thix bloot aan L2. Expose de laterale aspecten van L1 en L2 door losmaken van de spieren van de transversale processen.
- Haak snijtanden van het dier op de 3D-frame naar de positie (figuur 5) garanderen. Klem de L1 en L2 wervels de gewijzigde forceps. Sluit de gewijzigde forceps om de 3D-frame om het dier te stabiliseren.
- Trek caudaal de tang met de lumbale ruggengraat om de hele ruggengraat draai en de thorax van de bank verhogen.
OPMERKING: Bij de beschreven inrichting het dier moet kunnen ademen. Bovendien, ondanks de ademhalingsbewegingen van de borstkas, de wervelkolom en de wervelkolomkoord moet ook onbeweeglijk blijven. - Verwijder de doornuitsteeksels processess van Thix naar ThXII. Steek voorzichtig de inferieure blad van het bot mes onder de linker lamina van ThXII en sluit het bot mes om de lamina (Figuur 6) te snijden.
- Herhaal dezelfde manoeuvre op de juiste lamina en achtereenvolgens verwijderen van de achterste boog. Herhaal de vorige stappen voor de wervels ThXI om Thix om een vier-niveau laminectomie bereiken. Verwijder beide facetgewrichten voor elke wervel.
OPMERKING: Gedurende de procedure, het reinigen van de operatieve gebied van de lokale bloeden. Daarvoor gebruiken wattenstaafjes en irrigatie met lauw zoutoplossing. Hemostasis systematisch gebeurt binnen enkele minuten.
4. CEU Probe Positioning
- Bedek de dura mater met echografie gel. Aldus wordt een effectieve overdracht van de ultrasone golven tussen de probe en het ruggenmerg (figuur 7).
- Stabiliseren van de ultrasone sonde witha klem die vervolgens kan worden verbonden met de 3D-frame een gelede arm. Handmatig de positie van de sonde. Zorg ervoor dat de sonde is gericht op een schuine longitudinale sagittale slice verkrijgen. In een juiste positie, het ruggenmerg strikt horizontaal op het beeld en het centrale kanaal van het ruggenmerg zichtbaar over de volle segment van het ruggenmerg.
OPMERKING: Positionering moeten worden geleid door het beeld real-time B-mode weergegeven op het scherm van de echo machine. De brandpuntsafstand van de ultrasone sonde moet worden afgestemd op het centrale kanaal van het ruggenmerg. Op dat moment, het achterste deel van het ruggenmerg te boeken die uiteindelijk zal zorgen voor positionering van het botslichaam. - Wanneer een optimale, sluit de scharnierarm om de positie te stabiliseren.
5. Voorbereiding van de Contrast Agent - microbellen Reconstitutie
- Met behulp van de inhoud van een commerciële bereiding kit en sluit de zuigerstang door de bevestiging van deze tigHTLV in de spuit (met de klok mee). Open het transfersysteem blister en verwijder het dopje. Open het transfersysteem dop en sluit de spuit aan het transfersysteem (vast stevig).
- Verwijder de beschermende schijf uit de flacon. Schuif de flacon in de doorzichtige huls van de
- transfersysteem en druk stevig op de flacon te vergrendelen.
- Leeg de inhoud van de injectiespuit in de flacon door de zuigerstang. Schud krachtig gedurende 20 seconden om alle inhoud van de flacon te mengen tot een witte melkachtige homogene vloeistof te verkrijgen.
- Keer het systeem voorzichtig terugtrekken contrastmiddel in de spuit. Schroef de spuit los van het transfersysteem. Na reconstitutie (zoals aangegeven), 1 ml van de bereide suspensie 8 pl zwavelhexafluoride in de microbellen. Teken de schorsing van microbellen in een spuit van 100 ml. Plaats de spuit 100 ml in de elektrische pomp. Sluit het deksel.
- Begin constante agitatie van de resamengestelde microbellen. Verkregen constante agitatie door trage rotatie van de injectiespuit, waarin de microbellen schorsing onderhoudt. Sluit de pomp aan het jugularis katheter door de flexibele buis. Stel de echo machine "Harmonic Mode".
Opmerking: Het laatste komt overeen met de wijze waarop de microbelletjes specifiek kunnen worden gedetecteerd en gevisualiseerd. Deze modus heeft een lage mechanische index, die de microbelletjes niet vernietigt tegenstelling tot de B-modus. - Spoel de katheter door het inbrengen van een eerste dosis (400 pl) van contrastmiddel. Tijdens deze eerste infusie, controleren of de microbellen lijken op de echo scherm. Dit bevestigt dat het gehele circuit (van de spuit naar de bloedstroom van de rat) intact is en geopend.
- Stel de ultrasone machine "B-mode" naar het ruggenmerg parenchym en de vernietiging van de weinige microbellen nog in de bloedstroom te visualiseren. De hoge frequentie van de 'B-Mode "transmits hoge energie aan de microbellen, die hen in staat stelt om afbraak.
- Laat het dier lag nog ongeveer 30 min. Dit is lang genoeg voor het stabiliseren van de hemodynamische parameters.
6. Beoordeling van SCBF in de Intact Spinal Cord
- Stel de echo machine om de "Harmonic Mode". Start gelijktijdig (1) infusie van contrastmiddel (400 pl) en (2) de chronometer.
OPMERKING: Bij de infusie moet de concentratie microbellen in de bloedbaan, waardoor het contrast verbeelding van het ruggenmerg (Figuur 8). Aangezien de microbellen snel vernietigd, de bloedconcentratie van microbellen begint terug nadat de injectie is voltooid met een geleidelijke afname contrast visualisatie van het ruggenmerg levert. - Na 1 min, kies (druk) de "Clip Store" knop op de echo machine. Hierdoor wordt één staat tot 1 min r slaanaw echografie gegevens en de imaging-video-opname (dat was eerder getoond op de echo scherm).
- Stel de echo machine om "B-Mode". Dit zal de resterende microbellen elimineren.
7. Experimentele SCI
- De micromanipulator verbonden met de 3D-frames met het gewichtsgemiddelde onderstaande impactinrichting zodat het uiteinde van het botslichaam komt in contact met de dura mater (op het ruggenmerg middellijn), op de kruising tussen ThX en ThXI (figuur 9) .
Opmerking: Dit niveau moet overeenkomen met het midden van het segment van het ruggenmerg waargenomen met het ultrasone apparaat. De spits en het lichaam van het botslichaam 8 mm in diameter. De punt van de impactor die de schade zal genereren, is 3 mm in diameter. - Plaats de spits van de impactie apparaat bij een 10 cm hoge positie. Induceren de experimentele SCI door het vrijgeven van de spits van de impactie apparaat. De aanvaller valt en releases the impactor, verwonden het ruggenmerg. De op maat gemaakte impactie levert een effect overeenkomend met een 10 g gewicht van een hoogte van 10 cm.
8. Beoordeling van SCBF 5 min Post-SCI
- Herhaal de stappen in hoofdstuk 6 (Beoordeling van SCBF) beschreven. De microbellen zal niet door de beschadigde microvasculatuur en de schade epicentrum te passeren zal donker blijven (Figuur 10) zijn.
9. Animal Sacrifice
- Euthanaseren het dier met intraperitoneale injectie van dodelijke pentobarbital (100 mg).
10. Kwantificering van SCBF door Offline Analyse
- Start de Ultra-Extend Software gebruikt voor kwantificering (op ultrasound machine). Selecteer "file" en selecteer eerder opgeslagen ruwe gegevens en de bijbehorende bestanden te openen. Activeer de "kwantificering mode" door op (selecteren) de "Chi Q" knop. Select "Set ROI" (knop) en kies de ronde vorm.
- Selecteer "Trek ROI" (toets) en trek zeven aangrenzende cirkelvormige gebieden van belang (ROI) op het ruggenmerg (Figuur 11). Open het menu "Fitting" en kies de functie "Curve waarde". Let op de software de weergave van een aantal bochten, die elk overeenkomen met de veranderingen van de microbellen concentratie in een ROI.
OPMERKING: Elke curve heeft een "perfusie-deperfusion" profiel. De eerste fase van de curve vlak en komt overeen met de periode vóór de komst van microbelletjes. In de tweede fase, de concentratie microbellen snel toeneemt als gevolg van de infusie. In de derde fase, die begint bij voltooiing van de infusie, de concentratie microbellen progressief af naarmate ze disintegratse in de bloedbaan. - Plaats de eerste verticale lijn aan het begin van de tweede fase van de cUrve en selecteer "SET". Dit stelt de software waarin de analyse beginnen.
- Plaats de tweede verticale lijn aan het einde van de opname- en opnieuw selecteer "SET". Deze informeert de software waar te analyseren stoppen.
- Kijk naar het menu "Cv" en noteer de "AUC" waarde, die overeenkomt met de "Area Under the Curve" geanalyseerd. Deze waarde is evenredig met de SCBF in de overeenkomstige ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met de hierboven beschreven protocol, is het mogelijk om de SCBF langs een longitudinale ruggengraat sagittale segment kaart.
In het intacte ruggenmerg, blijkt er SCBF onregelmatigheden in het parenchym (figuur 12) zijn. Dit kan worden verklaard door de verschillen in verdeling radiculo-medullaire slagaders (RMA) van het ene dier op het andere. RMA verwijst naar slagaders die de anterior spinale arterie (ASA) te bereiken en daarom voorzien bloedtoevoer naar het ruggenmerg parenchym segmentale. In tegenstelling, de radiculaire bloedvaten corresponderen met aders, die het ASA niet halen en derhalve geen ruggenmerg bloedtoevoer segmentale. Daarom is in ruggenmergsegmenten waar de RMA anastomosen met ASA, er meer bloedstroom (zie de resultaten).
Na SCI, real-time CEU beeldvorming toont een tekort in omloop op de schade epicentrum. Het epicentrum blijft donker (geen contrastmiddel signaal),aangezien er geen actieve bloedstroom. Meer gedetailleerde analyse van de bloedstroom met behulp van verschillende ROI toont drie unieke bloedstroom gebieden. Ten eerste, ter hoogte van het epicentrum, de bloedstroom tarieven met een gemiddelde afname van ongeveer -90%. Ten tweede, in de gebieden nabij het epicentrum (zowel rostraal en caudaal), SCBF was significant verlaagd (van -50% tot -80%). Ten derde, in de meest afgelegen gebieden die overeenkomen met intact weefsel, SCBF wordt bewaard. Het tweede gebied komt overeen met het "ischemische penumbra zone", die het doelwit van potentiële neurobeschermende therapie moet worden. In staat zijn om gemakkelijk te visualiseren en te kwantificeren SCBF verandert post-SCI is nuttig voor de beoordeling van de efficiëntie van de therapieën die gericht zijn op het verminderen van weefsel ischemie, en wijst daarom op het belang van deze techniek (Figuur 13).
Figuur 2. Schematische weergave van de kit voor microbellen reconstitutie en Vueject ° pomp voor microbellen infusie. De transfer systeem maakt het mogelijk voor de levering van microbellen en zout tussen de flacon en de spuit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Jugular catheter. De katheter in de halsader te worden gestoken, dan geduwd in de richting van het hart en tenslotte vast met een knoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Methode voor de correcte identificatie van de vertebrale niveaus. In de rat, is de laatste rib tot de XIIIe wervel bevestigd. De laatste kan worden gepalpeerd door de huid als landmark voor de laatste borstwervel, de XIIIe. Spieren zijn vrijstaand aan beide zijden van de doornuitsteeksels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Stabilisatie van het dier in de 3D-beeld. (1) De snijtanden zijn verslaafd aan het frame, terwijl de eerste en tweede lumbale wervels (L1 en L2) worden geklemd met op maat gemaakte tang. (2) De lumbale wervelkolom is licht aangescherpt waar het dier stabiliseert en verheft de thorax van de bank, waardoor vrije luchtwegen bewegingen zonder ruggengraat bewegingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Technische gegevens van de laminectomie. Eerst wordt de dunne strook van de op maat gemaakte bone mes onder de lamina verstreken zonder schade aan het ruggenmerg. Vervolgens wordt de bot mes is gesloten, met het kuts en verwijdert een deel van de lamina. De procedure wordt herhaald aan beide zijden van ThXII tot TxIX om vier niveaus laminectomie bereiken. Ten slotte is de facet gewrichten zijn ook verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Positionering van de ultrasone sonde en het impactinrichting. De sonde is parallel aan het ruggenmerg en iets schuin (20-30 °), zodat het gewicht neerzetten impactor tegen de dorsale zijde van het dura worden geplaatst. Het ruggenmerg moet zichtbaar met het centrale kanaal aanwezig gedurende het middensegment op de echografie "B-Mode" zijn. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 8. Contrast beeldvorming van het intacte ruggenmerg. De opeenvolgende cijfers contrastmodus (oranje gekleurde beelden) tonen hoe het contrastmiddel (microbellen) wordt geleidelijk na de infusie, waardoor het contrast van het ruggenmerg verbeteren. Bolus infusie duurt ongeveer 10 sec en het contrast data werd opgenomen gedurende 1 min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Veranderingen in de B-modus volgende experimentele SCI. Hyperechoic een laesie verschijnt in het parenchym, overeenkomend met een eerste parenchymale h emorrhage post-SCI. Histologie (H & E-kleuring): De bloeding resultaten van massale traumatische verstoring van de kleine bloedvaten leidt tot bloed extravasatie in het parenchym (gele schaal bar = 2000 pm). De impactie apparaat wordt weergegeven aan de rechterkant. De spits is vrijgelaten uit een 10 cm hoogte en botst met de impactor die vervolgens genereert de dwarslaesie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. Contrast imaging 15 min na SCI. Vergelijkbaar met figuur 8, de microbelletjes zichtbaar als ze door het ruggenmerg microvasculatuur. Aan het epicentrum (asterisk), wordt de bloedstroom belemmerd door microvasculaire verstoring.10large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11. Protocol voor SCBF kwantificeren. Met Ultra-Extend Software, zeven ronde en aangrenzende regio's van belang (ROI) zijn getekend op het longitudinale ruggenmerg. De eerste ROI wordt geplaatst op de schade epicentrum. In elk ROI, genereert de software een perfusie-deperfusion curve en berekent het gebied onder deze curve. Deze waarde correleert met de bloedstroom in dit gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12. Heterogeniteit van de bloedstroom langshet ruggenmerg. Deze grafieken geven de heterogeniteit van het ruggenmerg bloedstroom en de variabiliteit tussen de dieren. Dit kan grotendeels worden verklaard door de vasculaire anatomie van het ruggenmerg. Vanwege de heterogeniteit en variabele vasculaire anatomie, moet men de metingen van de bloedstroming (van elk ROI) te gebruiken vóór schade als uitgangspunt. De metingen op de volgende tijdstippen (post-SCI) worden uitgedrukt als het percentage verandering van de basislijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13. Veranderingen in ruggenmerg bloedstroom (SCBF) geïnduceerd door de experimentele ruggenmergletsel (SCI). 15 minuten na SCI is kritisch ischemie op het niveau van het epicentrum terwijl SCBF bleef pgereserveerd in de meer afgelegen gebieden intact. In de regio's die grenzen aan het epicentrum (zowel rostraal en caudale), wordt SCBF aanzienlijk verminderd. Dit komt overeen met de eerder beschreven "ischemische penumbra zone". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel we hebben beschreven hoe CEU gebruiken in een rat SCI kneuzing model, kan dit protocol worden aangepast om andere experimentele doelstellingen of SCI modellen passen. Wij hebben besloten om SCBF op twee tijdstippen te meten (vóór letsel en 15 min na SCI), maar het aantal tijdstippen en de vertraging tussen SCBF metingen kunnen worden aangepast aan de behoeften van andere studies voldoen. Bijvoorbeeld, in ons eerdere werk 17, hebben we gemeten SCBF op vijf achtereenvolgende tijdstippen gedurende het eerste uur na SCI. Het is belangrijk op te merken dat in de sham-groep (geen SCI), waren we verrast om een progressieve afname in SCBF observeren. Hoewel we aanvankelijk gevreesd dat herhaalde infusie microbelletje het ruggenmerg vasculatuur verdere experimenten (ongepubliceerde gegevens) geschaad bevestigd dat deze veranderingen veroorzaakt door progressieve veranderingen in weefselbeschadiging fysiologische omstandigheden (temperatuur, hydratatie) geïnduceerd door de laminectomie, alsmede de verlengde expositie van tHij dura en omringend weefsel in de omgevingslucht en de ultrasone gel. Deze problemen komen vaak voor bij alle experimenten behandeling van microcirculatie, voor het verkeer is zeer gevoelig voor verschillende parameters en derhalve gevoelig voor vasoconstrictie en vasodilatatie. Daarom adviseren wij dat de periode waarin de operatiewond blijft open is zo kort mogelijk. Indien meerdere SCBF metingen nodig gedurende een langere periode, zou het beter zijn om het dier incisie tussen de acquisities sluiten om fysiologische omstandigheden rond te herstellen en in het ruggenmerg.
Het is ook mogelijk om de vorm, grootte, locatie en het aantal ROI voor SCBF analyse wijzigen. Een van de grote voordelen van CEU is dat de metingen op elk moment kan worden uitgevoerd na afloop van experimentele verwerking van de opgenomen data offline. Het is ook mogelijk om de metingen te herhalen of de meetinstellingen / normen zonodig wijzigen.
Ruimtelijke resolutie van ultrageluid beeldvorming evenredig met de frequentie van de ultrasone golven. Hoe hoger de ultrasone frequentie, hoe beter de ruimtelijke resolutie. We hebben gebruik gemaakt van een hoge-frequentie (12-14 MHz) probe, die een beeld verschaft met een pixelresolutie van ongeveer 100 urn. Bij zeer-systemen met hoge resolutie, de frequentie toeneemt tot 55 MHz en elke pixel is ongeveer 20 urn 20. Dergelijke inrichtingen kunnen ook worden gebruikt voor CEU, die veel nauwkeuriger de verdeling van SCBF in het parenchym tonen. De zeer hoge resolutie systemen zijn veel duurder.
Verscheidene andere technieken zijn voorgesteld om SCBF meten SCI, maar ze hebben allemaal andere beperkingen. Sommigen, zoals radioactieve microsferen 7,8 of de C14-jood-antipyrine autoradiografie 9, vereisen het offeren van dieren. In deze gevallen moet het ruggenmerg worden geoogst voor analyse. Anderzijds, de waterstof wordt gezuiverd 10, vereist intraspinale elektrodeplaatsingsinstrument die SCBF daadwerkelijk kan beïnvloeden. Bovendien kan de meting alleen worden gemaakt in een zeer beperkte gebied van het ruggenmerg parenchym. Lichtmicroscopiedoor een spinale venster biedt ook een manier om de microcirculatie te beoordelen, maar deze aanpak heeft een zeer beperkte diepte van observatie. Dit laat alleen de circulatie observeren in de oppervlakkige pia materiaal en niet in de parenchym 16.
In de literatuur worden real time in-vivo evaluatie van SCBF meestal uitgevoerd door laser Doppler imaging 11-13. Zelfs Deze techniek heeft een aantal beperkingen. Ten eerste omdat de laser minder dan 1 mm in diameter, SCBF kan alleen worden beoordeeld in een zeer beperkt gebied corresponderend met een halve bol van ongeveer 1 mm in diameter. Sinds het ruggenmerg van de rat is ongeveer 3 mm in diameter, de beperkte ruimte van analyse is een belangrijke beperking. Zoals wij hebben aangetoond dat SCBF in de intacte ruggenmerg niet homogeen is, is het belangrijk om SCBF meten in groter gebied voor een goede vertegenwoordiging weefsel microcirculatie. Ten tweede, de laser heeft een beperkte indringdiepte en daardoor detects oppervlakkige SCBF. Bijgevolg meet niet alleen parenchymale SCBF maar ook die van de pia mater (die rond het parenchym). Omdat de pia mater heeft een unieke vasculaire systeem en is niet onderworpen aan dezelfde auto-regulerende mechanismen als parenchymaal schepen, kan deze informatie misleidend zijn. Tenslotte werkt de laser-Doppler geen enkele morfologische informatie. CEU overwint deze beperkingen door het weergeven van morfologische beelden van de kabel (B-modus), terwijl een unieke presentatie van het contrastmiddel, dat duidelijk kan worden geïdentificeerd binnen de parenchym.
Ondanks de vele voordelen aan andere benaderingen CEU heeft ook enkele duidelijke beperkingen. Omdat metingen worden uitgevoerd op een tweedimensionale sagittale slice (meestal parallel aan het centrale kanaal), SCBF uit andere gebieden van het parenchym niet toegankelijk. Verder kan de door een tweedimensionale sagittal spinal cord segmentinformatie niet representatief voor het gehele koord. Nevertheless Deze kan door verschillende voorzorgsmaatregelen. Ten eerste door herhaling metingen op dezelfde locatie, de eerste meting gedaan (intact ruggenmerg) kunnen worden gebruikt als een basislijn waarde. Ten tweede, door verwonden bij het ruggenmerg middellijn (bilateraal letsel), de SCBF veranderingen moeten symmetrisch tussen links en rechts (ongepubliceerde gegevens) zijn. Deze voorzorgsmaatregelen ervoor te zorgen dat de analyse van enkele sagittale slice is genoeg om de globale longitudinale verdeling van SCBF weerspiegelen.
De hoge kosten van ultrageluid machines is een beperking. Echter verschillende oplossingen bestaan voor dit probleem gericht. Ten eerste kan een aantal laboratoria een tijdelijke lening te onderhandelen door de fabrikant voor hun experimenten. Echografie machines zijn vervoerbare, tijdelijke leningen zijn mogelijk. Dit heeft de aanpak van ons lab geweest. Als alternatief kan een groep van laboratoria middelen om de machine te kopen bundelen en verdelen de kosten. Anders, veel universitaire instellingen imaging faciliteiten en echografie machines kan worden aanbevolen als essentiële instrumenten. Zo kunnen de dieren worden vervoerd de imaging faciliteit voor CEU evaluatie en vervolgens bracht terug voor andere experimenten.
Vasculaire veranderingen, contrastvloeistof (microbellen) te beoordelen moet intraveneus worden geïnjecteerd. Hoewel catheterisatie van de halsader of dijader is invasief en risicovol, de aders zijn gemakkelijk toegankelijk en duidelijk herkenbaar. In tegenstelling, staartader injectie is veel minder invasief, maar het schip is slecht onderscheiden / toegankelijk voor de juiste catheterisatie. Derhalve bestaat het risico dat de naaldpunt niet correct in de ader gebracht of dat het kan bewegen tijdens het injecteren, ten koste het gehele experiment. Voor dergelijke reden, we de voorkeur aan de halsader gebruik en de invoering van een katheter voor een consistente microbellen infusie.
Wervel botten rondom het ruggenmerg. Zoals ultrasone golven worden gereflecteerd door het bot en kan niet door het ruggenmerg lamellen, imaging vereistbotverwijdering (laminectomie) om een akoestisch venster. De gemakkelijkste manier om het wervelkanaal te openen is met het achterste boog van de wervel verwijderd door een laminectomie. In dit protocol hebben we een vier-niveau laminectomie om een lange segment van het ruggenmerg, met inbegrip van het epicentrum, de penumbra zone en afgelegen gebieden van intacte ruggenmerg te visualiseren. Hoewel een meerderheid van de experimentele SCI modellen vereisen een laminectomie (voor clip aanvraag of impactor kneuzing), deze bestaan meestal uit het verwijderen van 1-2 lamina. De uitgebreide 4-niveau laminectomie is een andere beperking van onze studie. Echter, als men hoeft alleen het epicentrum en halfschaduw zone te bestuderen, een minder uitgebreid laminectomie kan worden gemaakt en wordt aanbevolen.
Concluderend, ondanks verscheidene limieten hierboven beschreven CEU is nuttig om te beoordelen SCBF veranderingen en het effect van verschillende therapieën (onderzoeksdoeleinden). Deze betrouwbare real-time, in-vivo benadering is geschikt voor het bekijken behandelingen te verminderenischemie en de daaropvolgende weefselnecrose post-SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
