Abstract
Réduction du flux sanguin de la moelle épinière (SCBF) (c.-à-ischémie) joue un rôle clé dans une lésion traumatique de la moelle épinière (SCI) pathophysiologie et est donc une cible importante pour les thérapies neuroprotectrices. Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, ils ont tous des limitations importantes. Pour surmonter ce dernier, nous proposons l'utilisation du temps réel contraste amélioré échographie (CEU). Ici, nous décrivons l'application de cette technique dans un modèle de contusion de rat de SCI. Un cathéter jugulaire est d'abord implanté pour l'injection répétée d'agent de contraste, une solution de chlorure de sodium de l'hexafluorure de soufre microbulles encapsulées. La colonne vertébrale est alors stabilisé avec un 3D-cadre sur mesure et de la moelle épinière dure-mère est exposée par une laminectomie au THIX-ThXII. La sonde à ultrasons est ensuite positionné à la partie postérieure de la dure-mère (revêtue de gel d'ultrasons). Pour évaluer SCBF base, une seule injection intraveineuse (400 pi) de contrest agent est appliqué pour enregistrer son passage dans le système microvasculaire de la moelle épinière intacte. Un dispositif à chute de poids est ensuite utilisé pour générer un modèle de contusion expérimentale reproductible de SCI. agent de contraste est ré-injecté 15 minutes après la blessure pour évaluer les changements post-SCI SCBF. CEU permet en temps réel et in vivo évaluation des changements de SCBF suivante SCI. Chez l'animal indemne, échographie a montré le flux sanguin inégale le long de la moelle épinière intacte. En outre, 15 min post-SCI, il y avait ischémie critique au niveau de l'épicentre tandis SCBF resté conservé dans les zones les plus reculées intacte. Dans les régions voisines de l'épicentre (à la fois rostrale et caudale), SCBF a été significativement réduite. Cela correspond à la «zone de pénombre ischémique» décrit précédemment. Cet outil est d'un intérêt majeur pour évaluer les effets des thérapies visant à limiter l'ischémie et la nécrose tissulaire résultant à la suite de SCI.
Introduction
Lésion de la moelle épinière (SCI) est une maladie dévastatrice qui conduit à une altération significative du moteur, sensoriel et les fonctions autonomes. À ce jour, aucun traitement a démontré son efficacité chez les patients. Pour cette raison, il est important d'identifier de nouvelles techniques qui permettront d'améliorer l'évaluation des traitements potentiels et peut encore élucider blessures pathiophysiology 1.
SCI est divisé en deux phases successives, dénommé blessures primaires et secondaires. La blessure primaire correspond à l'insulte mécanique initiale. Alors que les groupes de blessures secondaires une cascade d'événements biologiques différents (tels que l'inflammation, le stress oxydatif et l'hypoxie) qui contribuent à la suite de l'expansion progressive de la lésion initiale, des lésions tissulaires et donc le déficit neurologique 2,3.
A la phase aiguë de la SCI, thérapies neuroprotectrices visent à réduire la pathologie de la lésion secondaire et should conséquence d'améliorer les résultats neurologiques. Parmi les nombreux événements de blessures secondaires, l'ischémie joue un rôle essentiel de 4,5. Au niveau de l'épicentre SCI, les microvaisseaux du parenchyme endommagés entravent le flux sanguin de la moelle épinière efficaces (FERC). En outre, SCBF est également significativement réduite dans la région entourant l'épicentre de blessure, une zone spécifiquement connu comme la «zone de pénombre ischémique». Si SCBF ne peut pas être rapidement rétablie dans ces régions, l'ischémie peut conduire à une nécrose parenchymateuse supplémentaires et des dommages aux tissus plus nerveux. Comme même la préservation des tissus moindre peut avoir des effets importants de la fonction, il est d'un intérêt majeur pour développer des médicaments et des thérapies qui peuvent réduire l'ischémie post-SCI. Pour mettre en évidence ce phénomène, travaux antérieurs ont montré que la préservation de seulement 10% des axones myélinisés était suffisant pour permettre la marche chez les chats post-SCI 6.
Bien que plusieurs techniques ont été décrites pour évaluer SCBF, lay ont tous des limitations importantes. Par exemple, l'utilisation de microsphères radioactives 7,8 et C14-iodopyrine autoradiographie 9 nécessite ultérieure sacrifice animal et ne peut être répétée à plus tard points de temps. La technique de dégagement d'hydrogène 10 dépend de l'insertion d'électrodes intraspinales, qui peut en outre endommager la moelle épinière. Alors que l'imagerie laser Doppler, photopléthysmographie 14,15 et in vivo microscopie optique 16 ont une profondeur / zone très limitée de la mesure 11-13.
Notre équipe a déjà montré que contraste amélioré ultrasons (CEU) imagerie peut être utilisée pour évaluer en temps réel et in vivo les changements de SCBF dans le parenchyme rat de la moelle épinière 17. Il est important de noter que une technique similaire a été appliquée par Huang et al., Dans un modèle porcin de 18 SCI. CEU applique un mode spécifique d'imagerie par ultrasons qui permet d'associer im morphologique niveaux de grisâges (obtenus par le mode B classique) avec la distribution spatiale du flux sanguin 19. L'imagerie de SCBF et la quantification repose sur l'injection intravasculaire de produits de contraste pour échographie. L'agent de contraste est constitué de microbulles d'hexafluorure de soufre (de diamètre moyen d'environ 2,5 pm et 90% d'un diamètre inférieur à 6 pm) stabilisées par des phospholipides. Les microbulles reflètent le faisceau d'ultrasons émis par la sonde améliorant ainsi l'échogénicité de sang et augmentant le contraste des tissus en fonction de leur flux sanguin. Il est donc possible d'évaluer le débit sanguin dans une région d'intérêt donnée fonction de l'intensité du signal réfléchi. Les microbulles sont également sans danger et elles ont été appliquées cliniquement chez l'homme. L'hexafluorure de soufre est rapidement effacé (la demi-vie terminale est de 12 min) et plus de 80% de l'hexafluorure de soufre administrée sont retrouvés dans l'air expiré dans les 2 minutes après l'injection. Ce protocole fournit un moyen simple d'utiliser CEU imvieillissement à évaluer les changements SCBF chez le rat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont été approuvés par le comité de bioéthique de l'École de médecine Lariboisière, Paris, France (CEEALV / 2011-08-01).
1. Instrument Préparation
- Préparer et nettoyer les instruments suivants pour l'insertion du cathéter: micro-pinces, des ciseaux, des micro-micro-vasculaire, pince grands ciseaux, fils chirurgicaux (noir tressé de soie 4-0) et un cathéter 14 G. Hépariner le cathéter avec une solution d'héparine (5000 U / ml).
- Préparer et nettoyer les instruments suivants pour la laminectomie: grands ciseaux, scalpel et d'un coupe-os. Effectuer laminectomie avec un coupe-os-mesure visant à réduire le risque de nuire à la moelle épinière au cours de la laminectomie (Figure 1).
- Mise en place du cadre 3D utilisé pour le positionnement et la stabilisation de l'animal. Le cadre fait sur mesure est construit avec les éléments d'un fixateur externe Hoffman 3 en association avec forceps, which ont été courbé afin d'adapter la colonne lombaire de l'animal.
- Préparez l'appareil à chute de poids (impacteur) utilisé pour la moelle épinière des blessures biomécanique.
REMARQUE: Le dispositif d'impaction sur mesure a été conçu avec un logiciel 3D et imprimé en 3D. - Mettez la machine à ultrasons.
- Préparation du kit pour la reconstitution de l'agent de contraste.
NOTE: Le kit comprend 1 flacon contenant 25 mg de poudre lyophilisée, la seringue pré-remplie 1 contenant 5 ml de chlorure de sodium et un système de transfert mini-pic (Figure 2). Les étapes pour la reconstitution de l'agent de contraste sont détaillées ci-dessous (dans la section 5).
2. Veine jugulaire cathétérisme (Figure 3)
- Anesthésier l'animal avec 4% d'isoflurane. Placez l'animal en position couchée. Confirmez anesthésie appropriée en veillant à ce que l'animal ne répond pas lorsque les pattes sont pincées avec une pince. Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis under anesthésie.
- Rasez le cou et nettoyer la peau. Faire une incision sur la ligne médiane du cou. Rétracter le muscle sternocleidomastoidian afin de trouver la veine jugulaire interne. Serrer une ligature à la partie rostrale de la veine.
- Appliquer une pince microvasculaire sur la veine, 1 cm en dessous de la ligature. Passez un autre thread autour de la veine, juste en dessous de la pince avec le noeud prêt à être serrés lorsque la pince est libéré.
- Ouvrez la paroi de la veine (veinotomie) entre la pince et la ligature rostrale. Introduire un cathéter 14 G dans la lumière de la veine et le pousser vers le cœur.
- Quand il se heurte à la pince, libérer ce dernier et pousser le cathéter plus loin. Fixez le cathéter dans la veine, en serrant fermement le noeud sur la veine avec le cathéter à l'intérieur.
- Évaluer la perméabilité du cathéter en retirant une petite quantité de sang veineux dans le cathéter et par la suite puis rinçage avec une solution saline héparinée. Cela empêche l'obstruction de la catheter par un caillot de sang potentiel.
- Connectez tube flexible au cathéter pour injection supplémentaire d'agent de contraste (microbulles). Garder fermée (scellée) avant d'être prêt à l'emploi.
3. Accès à la colonne vertébrale, laminectomie et Rat de positionnement (dans le cadre de la 3D)
- Placez l'animal dans une position horizontale sujettes plat. Rasage et nettoyer le dos (région thoracique) de l'animal.
- Identifier la dernière côte (XIIIe chez le rat) par palpation (Figure 4). Ceci permet d'estimer la position de la vertèbre thoracique XIII (ThXIII).
- Faire un 4 cm incision de la peau sur la ligne médiane, centrée sur ThXIII. Ouvrez l'incision de la peau ainsi que la bourse sous-jacent. Observez l'aponévrose des muscles du dos ainsi que les conseils des processus de colonne vertébrale.
- Localiser attentivement le processus de la colonne vertébrale de ThXIII en palpant les nervures de XIIIe.
NOTE: La nervure XIIIe est connecté à ThXIII et représente donc un outil facile à locarepère anatomique te pour l'identification des ThXIII. Cette étape permet la localisation de l'ThXII à THIX apophyse épineuse ainsi que L1 et L2 (première et deuxième vertèbres lombaires). - Couper l'aponévrose musculaire et détacher les muscles de chaque côté pour exposer les apophyses épineuses, les lames et les joints de facette de THIX à L2. Exposer les aspects latéraux de L1 et L2 en détachant les muscles des apophyses transverses.
- Accrocher les incisives de l'animal sur le 3D-cadre pour fixer la position (Figure 5). Fixer les vertèbres L1 et L2 avec la pince modifiés. Branchez la pince modifiées au-cadre 3D afin de stabiliser l'animal.
- Tirez doucement caudale la pince de fixation du rachis lombaire afin de resserrer l'ensemble colonne vertébrale et d'élever le thorax du banc.
NOTE: Avec l'agencement décrit l'animal doit être capable de respirer. En outre, malgré les mouvements respiratoires de la cage thoracique, la colonne vertébrale et de la moellecordon devrait également rester immobile. - Retirez le processess épineuse de THIX à ThXII. Insérez délicatement la lame inférieure de la coupe de l'os sous la lame gauche de ThXII puis fermez la coupe osseuse afin de couper la lame (Figure 6).
- Répéter la même manœuvre pour la lame droite et retirer successivement l'arc postérieur. Répétez les étapes précédentes pour la vertèbres ThXI à THIX afin de parvenir à une laminectomie à quatre niveaux. Retirez les deux joints de facette pour chaque vertèbre.
REMARQUE: Tout au long de la procédure, nettoyer le champ opératoire d'une hémorragie locale. Pour cela, utilisez des tampons de coton et de l'irrigation avec une solution saline tiède. Hémostase se produit systématiquement quelques minutes.
4. CEU Probe Positionnement
- Couvrir la dure-mère avec un gel à ultrasons. Ceci permet une transmission efficace des ondes ultrasonores entre la sonde et la moelle épinière (figure 7).
- Stabiliser l'esprit de la sonde à ultrasonsha pince qui peut être connecté par la suite à la trame 3D par un bras articulé. Positionner manuellement la sonde. Assurez-vous que la sonde est orienté pour obtenir une coupe sagittale longitudinale oblique. En position correcte, la moelle épinière est strictement horizontal sur l'image et le canal central de la moelle épinière est visible le long du segment complet de la moelle épinière.
NOTE: Positionnement devrait être guidée par l'image en temps réel en mode B affichée sur l'écran de la machine à ultrasons. La distance focale de la sonde à ultrasons doit être aligné avec le canal central de la moelle épinière. A ce moment, la face postérieure de la moelle épinière est accessible ce qui en fin de compte pour permettre le positionnement de l'élément de frappe. - Lorsque optimale, bloquer le bras articulé pour stabiliser la position.
5. Préparation de l'agent de contraste - Reconstitution de microbulles
- En utilisant le contenu d'un kit de reconstitution commerciale et connecter la tige de piston en l'attachant tightly dans la seringue (sens horaire). Ouvrez le blister du système de transfert et enlever le capuchon de la seringue. Ouvrez le bouchon du système de transfert et connecter la seringue pour le système de transfert (fixer hermétiquement).
- Retirez le disque de protection du flacon. Faites glisser le flacon dans le manchon transparent du
- système de transfert et appuyez fermement pour verrouiller le flacon en place.
- Vider le contenu de la seringue dans le flacon en poussant sur la tige de piston. Agiter vigoureusement pendant 20 secondes pour mélanger tous les contenus dans le flacon pour obtenir un liquide homogène d'un blanc laiteux.
- Retourner le système et retirer soigneusement l'agent de contraste dans la seringue. Dévissez la seringue du système de transfert. Après reconstitution (comme indiqué), 1 ml de la dispersion obtenue contient de 8 pi de l'hexafluorure de soufre dans les microbulles. Dessinez la suspension de microbulles dans une seringue de 100 ml. Insérez le 100 ml seringue dans la pompe électrique. Fermez le couvercle.
- Lancer une agitation constante de la rémicrobulles constitué. Obtenu sous agitation constante par rotation lente de la seringue, qui maintient la suspension de microbulles. Brancher la pompe au cathéter jugulaire à travers le tube flexible. Régler la machine à ultrasons pour "mode harmonique".
REMARQUE: Cette dernière correspond à la manière dont les microbulles peuvent être spécifiquement détectées et visualisées. Ce mode a un faible indice mécanique, qui ne détruit pas les micro-bulles par rapport à la B-mode. - Purger le cathéter de perfusion de la première dose (400 pi) de l'agent de contraste. Au cours de cette première perfusion, vérifier que les microbulles ne apparaissent sur l'écran de l'échographie. Ceci confirme que l'ensemble du circuit (à partir de la seringue à la circulation sanguine du rat) est intacte et ouverte.
- Réglez l'appareil à ultrasons à "mode B" pour visualiser le parenchyme de la moelle épinière et la destruction de ces microbulles restant dans la circulation sanguine. La fréquence élevée de la «B-Mode" tranhaute énergie smits les microbulles, qui leur permet de panne.
- Laissez l'animal était encore environ 30 min. Cette période permet la stabilisation des paramètres hémodynamiques.
6. Évaluation du SCBF dans la moelle épinière Intact
- Régler la machine à ultrasons pour le mode "Harmonic". Lancer la fois (1) la perfusion d'agent de contraste (400 ul) et (2) le chronomètre.
Remarque: Au cours de la perfusion, la concentration de microbulles dans la circulation sanguine doit augmenter, ce qui permet l'imagination de contraste de la moelle épinière (figure 8). Etant donné que les microbulles sont rapidement détruites, la concentration sanguine de microbulles commence à diminuer dès que l'injection est terminée ce qui génère une diminution progressive de contraste visualisation de la moelle épinière. - Après le bouton "Clip Store" sur la machine à ultrasons 1 min, sélectionnez (de presse). Cela permettra un pour sauver 1 min de raw données de l'échographie et l'enregistrement vidéo d'imagerie (qui a été précédemment affiché sur l'écran de l'échographie).
- Régler la machine à ultrasons pour "B-Mode". Cela permettra d'éliminer les microbulles restants.
7. expérimentale SCI
- Utilisation du micromanipulateur relié à la trame 3D, positionner le dispositif de l'impaction de poids-goutte de sorte que la pointe de l'impacteur entre en contact avec la dure-mère (sur la ligne médiane de la moelle épinière), à la jonction entre THX et ThXI (Figure 9) .
Remarque: Ce niveau doit correspondre au milieu du segment de la moelle épinière observée avec le dispositif à ultrasons. Le percuteur et le corps de l'élément de frappe sont de 8 mm de diamètre. La pointe de l'impacteur, qui va générer la blessure, est de 3 mm de diamètre. - Placez la baguette du dispositif de l'impaction à une position de 10 cm de haut. Induire la SCI expérimentale en libérant l'attaquant du dispositif de l'impaction. L'attaquant tombe et libère ee impacteur, blessant la moelle épinière. L'impaction sur mesure offre un impact équivalent à un poids de 10 g tombant d'une hauteur de 10 cm.
8. Évaluation des SCBF 5 min post-SCI
- Répétez les étapes décrites dans la section 6 (Évaluation des SCBF). Les microbulles seront incapables de passer à travers la microvascularisation endommagé et l'épicentre de blessure restera sombre (Figure 10).
9. Sacrifice d'Animaux
- Euthanasier l'animal avec une injection intraperitoneale létale de pentobarbital (100 mg).
10. Quantification des SCBF par Analyse Offline
- Démarrez le logiciel Ultra-Extend utilisée pour la quantification (sur machine à ultrasons). Sélectionnez "Fichier" puis sélectionnez les données brutes préalablement enregistrés et ouvrir les fichiers associés. Activez le mode «quantification» en appuyant sur le bouton "Chi Q" (sélection). Select "Set ROI" (bouton) et de choisir la forme circulaire.
- Sélectionnez "Dessiner ROI" (bouton) et d'en tirer sept régions adjacentes circulaires d'intérêt (ROI) sur la moelle épinière (Figure 11). Ouvrez le menu "Montage" et choisissez la "valeur de la courbe" de fonction. Observez le logiciel affichant plusieurs courbes, correspondant chacun à des changements de concentration de microbulles l'intérieur d'un retour sur investissement.
NOTE: Chaque courbe a une "perfusion deperfusion" profil. La première phase de la courbe est plate et correspond à la période avant l'arrivée des microbulles. Dans la deuxième phase, la concentration de microbulles augmente rapidement par suite de la perfusion. Dans la troisième phase, qui commence lorsque la perfusion est terminée, la concentration de microbulles diminue progressivement car ils disintegratse dans la circulation sanguine. - Placer la première ligne verticale au début de la deuxième phase de la cUrve et sélectionnez «SET». Ceci indique au logiciel où commencer analyse.
- Placez la deuxième ligne verticale à la fin de l'enregistrement et sélectionnez à nouveau "SET". Ceci indique au logiciel où pour arrêter analyse.
- Regardez le menu «Cv» et enregistrer la valeur "AUC", qui correspond à la "aire sous la courbe" analysé. Cette valeur est proportionnelle à la SCBF à l'intérieur de la ROI correspondant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avec le protocole décrit ci-dessus, il est possible de mapper le SCBF le long d'un segment de la moelle épinière sagittal longitudinal.
Dans la moelle épinière intacte, il semble y avoir des irrégularités de SCBF au sein du parenchyme (Figure 12). Ceci peut être expliqué par la répartition variable des artères radiculo-médullaire (RMA) d'un animal à l'autre. RMA se réfère à segmentaire artères qui atteignent l'artère spinale antérieure (ASA) et donc fournissent l'approvisionnement en sang au parenchyme de la moelle épinière. Au contraire, les artères radiculaires correspondent à segmentaire artères, qui ne parviennent pas au ASA et donc ne fournit pas d'alimentation de la colonne vertébrale de sang de cordon. Par conséquent, dans les segments de la moelle épinière, où la RAM anastomose avec l'ASA, il n'y a plus d'écoulement de sang (comme montré dans les résultats).
Après SCI, CEU imagerie en temps réel montre une carence en circulation à l'épicentre de blessure. L'épicentre reste sombre (pas de signal d'agent de contraste),car il n'y a pas de flux sanguin actif. Une analyse plus détaillée de l'écoulement de sang à l'aide de plusieurs ROI montre trois territoires du flux sanguin uniques. Tout d'abord, au niveau de l'épicentre, le flux sanguin est le plus faible avec une diminution moyenne de l'ordre de -90%. Deuxièmement, dans les territoires adjacents de l'épicentre (à la fois rostrale et caudale), SCBF a également diminué de manière significative (allant de -50% à -80%). Troisièmement, dans les zones les plus reculées correspondant au tissu intact, SCBF est préservée. La deuxième région correspond à la «zone de pénombre ischémique», qui devrait être la cible de thérapies potentiellement neuroprotecteurs. Être en mesure de visualiser et de quantifier facilement SCBF change post-SCI est utile pour évaluer l'efficacité de thérapies visant à réduire l'ischémie tissulaire, et souligne donc l'importance de cette technique (Figure 13).
Figure 2. Représentation schématique du kit pour microbulles reconstitution et l'Vueject ° pompe utilisée pour microbulles perfusion. Le système de transfert permet la délivrance de microbulles et saline entre le flacon et la seringue. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. jugulaire cathéter. Le cathéter doit être inséré dans la veine jugulaire, puis poussé vers le cœur et enfin fixer avec un nœud. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Méthode pour l'identification correcte des niveaux vertébraux. Chez le rat, la dernière côte est fixé à la vertèbre XIIIe. Ce dernier peut être palpé à travers la peau comme un point de repère pour la dernière vertèbre thoracique, XIIIe. Les muscles sont détachés de chaque côté des apophyses épineuses. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Stabilisation de l'animal dans le cadre 3D. (1) Les incisives sont accrochés sur le cadre alors que les première et deuxième vertèbres lombaires (L1 et L2) sont serrés avec des pinces sur mesure. (2) La colonne lombaire est légèrement serré qui stabilise l'animal et élève le thorax du banc, permettant ainsi des mouvements respiratoires gratuitement et sans mouvements de la colonne vertébrale. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Les détails techniques de la laminectomie. Premièrement, la fine lame du couteau d'os sur mesure est passé sous la lame sans endommager la moelle épinière. Ensuite, l'outil de coupe d'os est fermé, qui cuts et supprime une partie de la lame. La procédure est répétée sur les deux côtés et à partir ThXII TxIX afin d'obtenir une laminectomie à quatre niveaux. Enfin, les facettes articulaires sont également supprimés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Le positionnement de la sonde à ultrasons et le dispositif d'impaction. La sonde est parallèle à la moelle épinière et légèrement oblique (20-30 °), de sorte que l'élément de frappe poids-goutte peut être placée contre la face postérieure de la dure-mère. La moelle épinière doit être visible avec le canal central présente dans le segment du milieu de la échographie "B-Mode". S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.
Figure 8. Contraste imagerie de la moelle épinière intacte. Les chiffres successifs en mode de contraste (images couleur orange) montrent comment l'agent de contraste (microbulles) apparaît progressivement après la perfusion, améliorant ainsi le contraste de la moelle épinière. perfusion de bolus dure environ 10 secondes et les données de contraste a été enregistré pendant 1 min. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 9. Les changements dans le mode B-suivantes expérimentale SCI. Une lésion hyperéchogène apparaît à l'intérieur du parenchyme, correspondant au parenchyme initial h emorrhage post-SCI. Histologie (coloration H & E): Les résultats de l'hémorragie de rupture traumatique massive de petits vaisseaux sanguins conduisant à une extravasation de sang dans le parenchyme (échelle jaune bar = 2,000 um). Le dispositif d'impaction est affiché sur la droite. L'attaquant est libéré d'une hauteur de 10 cm et entre en collision avec l'impacteur qui génère ensuite la blessure de la moelle épinière. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 10. de formation d'image de contraste 15 min post-SCI. Similaire à la figure 8, les microbulles sont visibles lors de leur passage à travers le système microvasculaire de la moelle épinière. À l'épicentre (astérisque), le flux sanguin est obstrué par une perturbation microvasculaire.10large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 11. Protocole pour SCBF quantification. Avec le logiciel Ultra-Extend, sept régions adjacentes et circulaires d'intérêt (ROI) sont dessinés sur l'image longitudinale de la moelle épinière. Le premier retour sur investissement est placé sur l'épicentre des blessures. Dans chaque ROI, le logiciel génère une courbe perfusion deperfusion et calcule l'aire sous la courbe. Cette valeur est en corrélation avec le flux sanguin dans ce domaine. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 12. L'hétérogénéité de l'écoulement de sang le long dela moelle épinière. Ces graphiques afficher l'hétérogénéité de la circulation sanguine de la moelle épinière, ainsi que la variabilité entre les animaux. Ceci peut être expliqué en grande partie par l'anatomie vasculaire de la moelle épinière. Toutefois, en raison de l'hétérogénéité et de l'anatomie vasculaire variable, on doit utiliser les mesures d'écoulement de sang (de chaque ROI) avant l'accident que la ligne de base. Les mesures effectuées aux points de temps suivants (post-SCI) sont exprimés en pourcentages changement de la ligne de base. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 13. Changements dans la moelle flux de sang de cordon (SCBF) induite par la blessure de la moelle épinière expérimentale (SCI). 15 min après la SCI il ya ischémie critique au niveau de l'épicentre tandis SCBF resté préservé dans les zones intactes les plus reculées. Dans les régions adjacentes de l'épicentre (à la fois rostrale et caudale), SCBF est considérablement réduite. Cela correspond à la «zone de pénombre ischémique» décrit précédemment. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien que nous avons décrit comment utiliser CEU chez un rat SCI modèle de contusion, ce protocole peut être modifié pour tenir d'autres objectifs expérimentaux ou modèles SCI. Nous avons choisi de mesurer SCBF à seulement deux points dans le temps (avant la lésion et 15 min post-SCI), mais le nombre de points dans le temps et le retard entre les mesures de SCBF peuvent être adaptés pour répondre aux besoins d'autres études. Par exemple, dans notre travail précédent 17, nous avons mesuré SCBF à cinq points de temps successifs tout au long de la première heure post-SCI. Il est important de noter que dans le groupe témoin (pas SCI), nous avons été surpris d'observer une diminution progressive de la FERC. Alors que nous avons d'abord craint que la perfusion de microbulles répétée pourrait nuire à la vascularisation de la moelle épinière, une expérimentation plus poussée (données non publiées) a confirmé que ces changements ont été provoqués par des altérations progressives de tissu locale des conditions physiologiques (température, hydratation) induits par la laminectomie, ainsi que l'prolongé exposition de til dure-mère et le tissu environnant de l'air ambiant et le gel à ultrasons. Ces problèmes sont communs dans toutes les expériences portant sur la microcirculation, que la circulation est extrêmement sensible à de nombreux paramètres et donc sujettes à vascoconstriction ou vasodilatation. Par conséquent, nous recommandons que la période pendant laquelle la plaie chirurgicale reste ouverte est aussi courte que possible. Si plusieurs mesures de SCBF sont nécessaires sur une période prolongée, il serait préférable de fermer l'incision des animaux entre les acquisitions afin de rétablir des conditions physiologiques dans et autour de la moelle épinière.
Il est également possible de modifier la forme, la taille, l'emplacement et le nombre de ROI pour l'analyse de SCBF. L'un des principaux avantages de la CEU est que les mesures peuvent être effectuées à tout moment après la fin expérimentale en traitant les données hors ligne enregistrée. Il est également possible de répéter les mesures ou à modifier les paramètres de mesure / normes si nécessaire.
La résolution spatiale d'imagerie par ultrasons est proportionnelle à la fréquence des ondes ultrasonores. Plus la fréquence des ultrasons, meilleure est la résolution spatiale. Nous avons utilisé une hautefréquentielle (12-14 MHz) sonde, qui fournit une image avec une résolution de pixels d'environ 100 um. Avec les systèmes à très haute résolution, la fréquence augmente jusqu'à 55 MHz et chaque pixel est d'environ 20 um 20. De tels dispositifs peuvent également être utilisés pour CEU, qui représentent plus précisément la distribution du SCBF dans le parenchyme. Cependant, les systèmes à très haute résolution sont beaucoup plus chers.
Plusieurs autres techniques ont été proposées pour mesurer SCBF dans la SCI, mais ils ont tous des limitations uniques. Certains, comme microsphères radioactives 7,8 ou l'autoradiographie C14-iodo-antipyrine 9, nécessitent le sacrifice animal. Dans ces cas, la moelle épinière doivent être récoltées pour analyse. D'autre part, la technique de dégagement d'hydrogène 10, exige l'insertion d'électrode intraspinal qui peut effectivement modifier le SCBF. De plus, la mesure ne peut être effectuée dans une région très limitée du parenchyme de la moelle épinière. Microscopie optiqueà travers une fenêtre moelle fournit également un moyen d'évaluer la microcirculation, mais cette approche a une profondeur très restreint d'observation. Il ne permet d'observer la circulation dans l'affaire de pia superficielle et non au sein du parenchyme 16.
Dans la littérature, en temps réel des évaluations in vivo de SCBF sont généralement effectuées par laser Doppler imagerie 11-13. Cependant, même cette technique présente plusieurs limitations. Tout d'abord, étant donné que le laser est inférieure à 1 mm de diamètre, SCBF ne peut être évalué dans un espace très restreint correspondant à une demi-sphère d'environ 1 mm de diamètre. Étant donné que la moelle épinière du rat est d'environ 3 mm de diamètre, la zone limitée de l'analyse est une contrainte majeure. En outre, comme nous l'avons montré que SCBF dans la moelle épinière intacte est pas homogène, il est important de mesurer SCBF dans une zone plus grande pour une représentation adéquate de la microcirculation des tissus. En second lieu, le laser a une profondeur de pénétration limitée et donc detects SCBF superficielle. En conséquence, il ne mesure pas parenchymateuse SCBF mais aussi celle de la pie-mère (qui entoure le parenchyme). Depuis la pie-mère a un système vasculaire unique et ne sont pas soumis aux mêmes mécanismes d'auto-régulation que les navires du parenchyme, cette information peut être trompeur. Enfin, le laser-Doppler ne fournit aucune information morphologique. CEU surmonte ces limitations en affichant des images morphologiques du cordon (mode B), tout en présentant uniquement l'agent de contraste qui peut être clairement identifiée dans le parenchyme.
Malgré ses nombreux avantages à d'autres approches, CEU a aussi quelques limitations distinctes. Etant donné que les mesures sont effectuées sur une coupe sagittale bi-dimensionnelle (généralement parallèle au canal central), SCBF d'autres régions du parenchyme sont inaccessibles. En outre, l'information générée par un seul segment bi-dimensionnelle sagittale moelle épinière peut ne pas être représentative de l'ensemble du cordon. TOUTEFOISss, ce qui peut être contrôlé par plusieurs précautions. Tout d'abord, en répétant les mesures au même emplacement, la première mesure effectuée (de la moelle épinière intacte) peut être utilisée comme une valeur de référence. Deuxièmement, en blessant à la ligne médiane de la moelle épinière (lésion bilatérale), les changements de SCBF devraient être symétrique entre gauche et droite (données non publiées). Ces précautions permettent de garantir que l'analyse de simple coupe sagittale est suffisante pour refléter la répartition longitudinale globale de SCBF.
Le coût élevé des appareils d'échographie est une autre limitation. Cependant, plusieurs solutions existent pour cibler ce problème. Tout d'abord, certains laboratoires peuvent négocier un prêt temporaire par le fabricant pour leurs expériences. Comme machines à ultrasons sont transportables, prêts temporaires sont possibles. Cela a été l'approche utilisée par notre laboratoire. Alternativement, un groupe de laboratoires peut regrouper les ressources pour acheter la machine et de diviser les coûts. Sinon, de nombreux établissements universitaires disposent d'installations d'imagerie et machine à ultrasonss peut être recommandé comme des outils essentiels. Ainsi, les animaux peuvent être transportés du centre d'imagerie pour l'évaluation CEU puis ramenés pour d'autres expériences.
Pour évaluer les changements vasculaires, agent de contraste (microbulles) doit être injecté par voie intraveineuse. Bien que le cathétérisme de la veine jugulaire ou fémorale est invasive et risquée, les veines sont facilement accessibles et clairement identifiable. En revanche, l'injection veine de la queue est beaucoup moins invasive, mais le navire est mal distinguée / visible cathétérisme appropriée. Par conséquent, il existe un risque que la pointe de l'aiguille ne sera pas correctement placé à l'intérieur de la veine ou qu'il peut se déplacer lors de l'injection, ce qui compromet toute l'expérience. Pour cette raison, nous préférons utiliser la veine jugulaire et d'introduire un cathéter pour perfusion microbulles cohérente.
Os des vertèbres entourent la moelle épinière. Comme ondes ultrasonores sont réfléchies par les os et ne peuvent pas passer à travers les lamelles de la moelle épinière, l'imagerie nécessiteretrait d'os (laminectomie) pour ouvrir une fenêtre acoustique. La meilleure façon d'ouvrir le canal vertébral est de supprimer l'arc postérieur de la vertèbre à travers une laminectomie. Dans ce protocole, nous avons besoin d'une laminectomie quatre niveaux de visualiser un long segment de la moelle épinière, dont l'épicentre, la zone de pénombre et les régions éloignées de la moelle épinière intacte. Bien que la majorité des modèles expérimentaux SCI requiert une laminectomie (pour l'application de clip ou de frappe contusion), ceux-ci se composent généralement de retirer 1-2 limbe. Le vaste laminectomie 4 niveau est une autre limite de notre étude. Cependant, si il suffit d'étudier la zone de l'épicentre et de la pénombre, une laminectomie moins étendue peut être faite et est recommandée.
En conclusion, malgré les plusieurs limites décrites ci-dessus, CEU est un outil utile pour évaluer les changements de SCBF et l'effet de divers traitements (à des fins de recherche). Ce, en temps réel fiable, in vivo approche est idéal pour regarder des traitements pour réduireischémie et une nécrose tissulaire subséquente post-SCI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
