Abstract
Flujo reducido de sangre de la médula espinal (SCPF) (es decir, isquemia) desempeña un papel clave en la lesión medular traumática (SCI) fisiopatología y en consecuencia es un objetivo importante para las terapias neuroprotectoras. Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, todos ellos tienen limitaciones significativas. Para superar este último, se propone la utilización de imágenes de contraste mejorado de ultrasonido en tiempo real (CEU). Aquí se describe la aplicación de esta técnica en un modelo de rata de la contusión SCI. Un catéter yugular se implanta primero para la inyección repetida de agente de contraste, una solución de cloruro de sodio de hexafluoruro de azufre microburbujas encapsuladas. La columna vertebral se estabiliza luego con un 3D-marco a medida y la médula espinal duramadre está expuesto por una laminectomía en Thix-ThXII. La sonda de ultrasonido se coloca entonces en el aspecto posterior de la duramadre (recubierta con gel de ultrasonido). Para evaluar SCPF línea de base, una sola inyección intravenosa (400 l) de contraagente st se aplica para registrar su paso a través de la microvasculatura de la médula espinal intacta. Un dispositivo de peso soltar se utiliza posteriormente para generar un modelo experimental reproducible contusión de SCI. Agente de contraste se re-inyecta 15 min después de la lesión para evaluar los cambios post-SCI SCPF. CEU permite en tiempo real e in-vivo evaluación de los cambios SCPF siguiente SCI. En el animal está sano, la ecografía mostró flujo sanguíneo irregular a lo largo de la médula espinal intacta. Además, 15 min después de la SCI, hubo isquemia crítica en el nivel del epicentro SCPF mientras permaneció conserva en las zonas más remotas intacto. En las regiones adyacentes al epicentro (tanto rostral y caudal), SCPF se redujo significativamente. Esto corresponde a la descrita previamente "zona de penumbra isquémica". Esta herramienta es de gran interés para la evaluación de los efectos de las terapias destinadas a limitar la isquemia y la necrosis tisular resultante después de la SCI.
Introduction
Lesión medular traumática (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a un deterioro significativo de motor, sensorial y funciones autónomas. Hasta la fecha, ninguna terapia ha demostrado su eficacia en los pacientes. Por tal razón, es importante identificar las nuevas técnicas que mejoren la evaluación de los posibles tratamientos y puede aclarar aún más pathiophysiology lesiones 1.
SCI se divide en dos fases secuenciales, que se refiere a las lesiones como primarios y secundarios. La lesión primaria corresponde al insulto mecánica inicial. Considerando que los grupos de lesiones secundarias una cascada de varios eventos biológicos (tales como la inflamación, el estrés oxidativo y la hipoxia) que contribuyen más a la expansión progresiva de la lesión inicial, daños en los tejidos y, por tanto, 2,3 déficit neurológico.
En la fase aguda de la lesión medular, terapias neuroprotectoras están dirigidas a reducir la patología lesión secundaria y shen consecuencia ould mejorar los resultados neurológicos. Entre los muchos eventos de lesiones secundarias, isquemia desempeña un papel 4,5 crucial. En el nivel del epicentro SCI, los microvasos del parénquima dañados impiden el flujo de sangre de la médula espinal efectiva (SCPF). Por otra parte, SCPF también se reduce significativamente en la región que rodea el epicentro lesión, un área específicamente conocida como la "zona de penumbra isquémica". Si SCPF no se puede restaurar rápidamente dentro de estas regiones, la isquemia puede conducir a la necrosis del parénquima suplementario y daños en los tejidos más nervioso. Como incluso la preservación de tejido más ligero puede tener efectos sustanciales de la función, es de gran interés para el desarrollo de fármacos y terapias que pueden reducir la isquemia post-SCI. Para poner de relieve este fenómeno, el trabajo previo ha demostrado que la preservación de sólo el 10% de los axones mielinizados fue suficiente para permitir caminar en los gatos después de la SCI 6.
Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, lay todos tienen limitaciones significativas. Por ejemplo, el uso de microesferas radioactivas 7,8 y C14-iodopyrine autorradiografía 9 requiere el sacrificio de animales posterior y no puede repetirse a posteriores puntos de tiempo. La técnica de limpieza de hidrógeno al 10 depende de la inserción de electrodos intraespinales, que pueden dañar aún más la médula espinal. Mientras Doppler láser, fotopletismografía 14,15 e in vivo microscopía de luz 16 tiene una profundidad muy limitada / zona de medida 11-13.
Nuestro equipo ha demostrado previamente que un mayor contraste de ultrasonidos de formación de imágenes (CEU) se puede utilizar para evaluar en tiempo real e in vivo los cambios SCPF en el parénquima de la médula espinal de rata 17. Es importante señalar que una técnica similar se aplicó por Huang et al., En un modelo porcino de SCI 18. CEU se aplica un modo específico de imágenes de ultrasonido que permite asociar im morfológica de escala de grisesedades (obtenidos por el modo B convencional) con la distribución espacial del flujo de sangre 19. La imagen SCPF y cuantificación se basa en la inyección intravascular de agentes de eco-contraste. El agente de contraste está compuesto de microburbujas de hexafluoruro de azufre (diámetro de significar sobre 2,5 micras y 90% tienen un diámetro inferior a 6 micras) estabilizada por fosfolípidos. Las microburbujas reflejan el haz de ultrasonido emitido por la sonda mejorando así la ecogenicidad de la sangre y el aumento de contraste de los tejidos en función de su flujo sanguíneo. Por tanto, es posible evaluar el flujo sanguíneo en una región determinada de interés según la intensidad de la señal reflejada. Las microburbujas también son seguros y que se han aplicado clínicamente en seres humanos. El hexafluoruro de azufre se elimina rápidamente (media vida media terminal es de 12 min) y más de 80% de la hexafluoruro de azufre administrada se recuperó en el aire exhalado dentro de 2 min después de la inyección. Este protocolo proporciona una forma sencilla de utilizar CEU imenvejecimiento para evaluar los cambios en SCPF rata.
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Protocol
NOTA: Los procedimientos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de Lariboisière, París, Francia (CEEALV / 2011-08-01).
1. Preparación de instrumentos
- Preparar y limpiar los siguientes instrumentos para la inserción del catéter: micro-micro-pinzas, tijeras, pinza microvascular, grandes tijeras, hilo quirúrgico (seda trenzada Negro 4-0) y un catéter 14 G. Heparinizar el catéter con una solución de heparina (5.000 U / ml).
- Preparar y limpiar los siguientes instrumentos para la laminectomía: grandes tijeras, bisturí y un cortador de hueso. Realizar laminectomía con un cortador de hueso a medida diseñado para reducir el riesgo de dañar la médula espinal durante la laminectomía (Figura 1).
- Puesta en marcha del marco 3D utilizado para el posicionamiento y la estabilización del animal. El marco de encargo se construye con los elementos de un fijador externo Hoffman 3 en asociación con fórceps, which han sido curvados con el fin de adaptarse a la columna lumbar del animal.
- Prepare el dispositivo de peso-drop (impactador) utilizado para la lesión de la médula espinal biomecánico.
NOTA: El dispositivo de impactación medida fue diseñado con un software 3D e impreso en 3D. - Encienda la máquina de ultrasonido.
- Preparar el kit para la reconstitución del agente de contraste.
NOTA: El kit incluye 1 vial que contiene 25 mg de polvo liofilizado, 1 jeringa precargada que contiene 5 ml de cloruro de sodio y un sistema de transferencia mini-pico (Figura 2). Los pasos para la reconstitución del agente de contraste se detallan a continuación (en la sección 5).
2. vena yugular cateterismo (Figura 3)
- Anestesiar al animal con 4% de isoflurano. Colocar el animal en posición supina. Confirmar anestesia adecuada, garantizando que el animal no responde cuando las patas queden atrapados con una pinza. Aplique un ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras undanestesia er.
- Afeitarse el cuello y limpiar la piel. Hacer una incisión en la línea media del cuello. Retraer el músculo sternocleidomastoidian para encontrar la vena yugular interna. Apretar una ligadura en la parte rostral de la vena.
- Aplicar una pinza microvascular en la vena, 1 cm por debajo de la ligadura. Pasar otro hilo alrededor de la vena, justo debajo de la abrazadera con el nudo listo para ser apriete cuando se suelta la abrazadera.
- Abra la pared de la vena (venotomía) entre la abrazadera y la ligadura rostral. Introducir un G catéter 14 en el lumen de la vena y empujarlo hacia el corazón.
- Cuando se trata en contra de la abrazadera, suelte el último y empujar el catéter más. Asegurar el catéter en la vena, por apretar firmemente el nudo en la vena con el catéter dentro.
- Evaluar la permeabilidad del catéter mediante la retirada de una pequeña cantidad de sangre venosa en el catéter y, posteriormente, a continuación, lavado con solución salina heparinizada. Esto evita la obstrucción de la catheter por un potencial coágulo de sangre.
- Conectar un tubo flexible al catéter para su posterior inyección de agente de contraste (microburbujas). Manténgalo cerrado (cerrado) hasta que esté listo para su uso.
3. Acceso a la columna vertebral, laminectomía y la rata de posicionamiento (en el marco 3D)
- Colocar el animal en una posición horizontal propensos plana. Afeitado y limpiar la parte posterior (región torácica) del animal.
- Identificar la última costilla (el XIII en la rata) por palpación (Figura 4). Esto permite estimar la ubicación de la vértebra torácica XIII (ThXIII).
- Hacer una incisión en la piel 4 cm en la línea media, centrada en ThXIII. Abra la incisión de la piel, así como la bursa subyacente. Observar la aponeurosis de los músculos de espalda, así como las puntas de los procesos de la columna vertebral.
- Localizar con cuidado el proceso de la columna vertebral de ThXIII palpando las costillas XIII.
NOTA: La costilla XIII está conectado a ThXIII y por lo tanto representa un fácil locahito anatómico te para la identificación de ThXIII. Este paso permite la localización de la ThXII a thix apófisis espinosa, así como L1 y L2 (primera y segunda vértebras lumbares). - Cortar la aponeurosis muscular y separar los músculos a cada lado para exponer las apófisis espinosas, las láminas y las articulaciones facetarias desde thix a L2. Exponer los aspectos laterales de L1 y L2 separando los músculos de las apófisis transversas.
- Enganche incisivos dientes del animal en el marco 3D para asegurar la posición (Figura 5). Sujete las vértebras L1 y L2 con el fórceps modificados. Conectar los fórceps modificado al bastidor 3D con el fin de estabilizar el animal.
- Tire suavemente caudalmente las pinzas que sujetan la columna lumbar con el fin de apretar toda la columna vertebral y de elevar el tórax desde el banquillo.
NOTA: Con la disposición descrita el animal debe ser capaz de respirar. Además, a pesar de los movimientos respiratorios de la caja torácica, la columna vertebral y la médulaespinal también debe permanecer inmóvil. - Retire el PROCESOS espinosa de Thix a ThXII. Introduzca suavemente la hoja inferior de la cuchilla de hueso debajo de la lámina izquierda del ThXII y cierre el cortador de hueso con el fin de cortar la lámina (Figura 6).
- Repita la misma maniobra de la lámina derecha y eliminar sucesivamente el arco posterior. Repetir los pasos anteriores para el ThXI vértebras a thix a fin de lograr una laminectomía de cuatro niveles. Retire las dos carillas articulares de cada vértebra.
NOTA: Durante todo el procedimiento, limpiar el campo quirúrgico de una hemorragia local. Para ello, utilizar hisopos de algodón y la irrigación con solución salina tibia. La hemostasia se produce sistemáticamente en cuestión de minutos.
4. CEU Sonda Posicionamiento
- Cubra la duramadre con gel de ultrasonido. Esto permite la transmisión efectiva de las ondas de ultrasonido entre la sonda y la médula espinal (Figura 7).
- Estabilizar el ingenio sonda de ultrasonidopinza ha que se puede conectar posteriormente a la 3D-frame por un brazo articulado. Posicionar manualmente la sonda. Asegúrese de que la sonda está orientada a obtener una rebanada sagital longitudinal oblicua. En una posición correcta, la médula espinal es estrictamente horizontal en la imagen y el canal central de la médula espinal es visible a lo largo del segmento completo de la médula espinal.
NOTA: Posicionamiento debe estar guiada por la imagen en modo B en tiempo real que se muestra en la pantalla de la máquina de ultrasonido. La distancia focal de la sonda de ultrasonido debe estar alineado con el canal central de la médula espinal. En este momento, la cara posterior de la médula espinal es accesible que en última instancia permitir el posicionamiento del impactador. - Cuando óptima, bloquee el brazo articulado para estabilizar la posición.
5. Preparación del agente de contraste - microburbujas Reconstitución
- Usando el contenido de un kit comercial de la reconstitución y conectar el vástago de émbolo por su fijación tightly en la jeringa (en sentido horario). Abra la ampolla sistema de transferencia y retire la tapa de la punta de la jeringa. Abra la tapa del sistema de transferencia y conectar la jeringa al sistema de transferencia (sujetar firmemente).
- Retire el disco protector del vial. Deslice el vial en la manga transparente del
- sistema de transferencia y presione firmemente para bloquear el vial en el lugar.
- Vaciar el contenido de la jeringa en el vial presionando sobre el vástago de émbolo. Agitar vigorosamente durante 20 segundos para mezclar todos los contenidos en el vial para obtener un líquido homogéneo de color blanco lechoso.
- Invertir el sistema y retirar cuidadosamente el agente de contraste en la jeringa. Desenroscar la jeringa del sistema de transferencia. Después de la reconstitución (como se indica), 1 ml de la dispersión resultante contiene 8 l hexafluoruro de azufre en las microburbujas. Dibujar la suspensión de microburbujas en una jeringa de 100 ml. Inserte la jeringa 100 ml dentro de la bomba eléctrica. Cierre la tapa.
- Iniciar agitación constante de la remicroburbujas constituidas. Agitación constante obtenida por rotación lenta de la jeringa, que mantiene la suspensión de microburbujas. Conectar la bomba al catéter yugular a través del tubo flexible. Ajuste la máquina de ultrasonido para "Modo Armónico".
NOTA: Este último corresponde al modo en el que las microburbujas pueden detectarse específicamente y se visualizaron. Este modo tiene un índice mecánico bajo, que no destruye las microburbujas en comparación con el modo B. - Purgar el catéter mediante la infusión de una primera dosis (400 l) de agente de contraste. Durante esta primera infusión, compruebe que las microburbujas aparecen en la pantalla del ultrasonido. Esto confirma que todo el circuito (de la jeringa al torrente sanguíneo de la rata) está intacto y abierto.
- Ajuste la máquina de ultrasonido a "B-mode" para visualizar el parénquima de la médula espinal y la destrucción de las pocas microburbujas restantes en el torrente sanguíneo. La alta frecuencia de la "B-Mode" tranalta energía smits a las microburbujas, lo que les permite a la ruptura.
- Deje que el animal se quedó inmóvil durante aproximadamente 30 min. Este periodo permite la estabilización de los parámetros hemodinámicos.
6. Evaluación de SCPF en la médula espinal intacta
- Ajuste la máquina de ultrasonido para el "Modo de armónicos". Iniciar simultáneamente (1) de infusión de agente de contraste (400 l) y (2) el cronómetro.
NOTA: Durante la infusión, la concentración de microburbujas en el torrente sanguíneo debe aumentar, lo que permite la imaginación contraste de la médula espinal (Figura 8). Dado que las microburbujas se destruyen rápidamente, la concentración en sangre de microburbujas comienza a disminuir una vez que se ha completado la inyección que genera una disminución progresiva en contraste visualización de la médula espinal. - Después de que el botón de "Clip Store" en la máquina de ultrasonido 1 min, seleccione (pulse). Esto permitirá a uno para salvar a 1 min de la raw datos de la ecografía y la grabación de vídeo de imagen (que se mostró previamente en la pantalla de ultrasonido).
- Ajuste la máquina de ultrasonido a "B-Mode". Esto eliminará las microburbujas restantes.
7. Experimental SCI
- Utilizando el micromanipulador conectado al bastidor 3D, posicionar el dispositivo de impactación peso soltar de manera que la punta del impactador entra en contacto con la duramadre (en la línea media de la médula espinal), en la unión entre THX y ThXI (Figura 9) .
NOTA: Este nivel debe corresponder a la mitad del segmento de la médula espinal observado con el dispositivo de ultrasonido. El delantero y el cuerpo del impactador son 8 mm de diámetro. La punta del impactador, que generará la lesión, es de 3 mm de diámetro. - Coloque el delantero del dispositivo de retención en una posición 10 cm de alto. Inducir el SCI experimental soltando el delantero del dispositivo de retención. El delantero cae y libera the impactador, hiriendo a la médula espinal. La impactación por encargo ofrece un impacto equivalente a un 10 g de peso cayó desde una altura de 10 cm.
8. Evaluación de SCPF 5 min post-SCI
- Repita los pasos descritos en la sección 6 (Evaluación de SCPF). Las microburbujas serán incapaces de pasar a través de la microvasculatura dañado y el epicentro lesión permanecerá oscuro (Figura 10).
9. El sacrificio de animales
- La eutanasia a los animales con una inyección letal intra-peritoneal de pentobarbital (100 mg).
10. La cuantificación de SCPF por Análisis Desconectado
- Inicie el software de Ultra-Extender utilizado para la cuantificación (en la máquina de ultrasonido). Seleccione "Archivo" y luego seleccionar los datos en bruto previamente guardados y abrir los archivos asociados. Active el "modo de cuantificación" pulsando el botón "Chi Q" (selección). Select (botón) y elija la forma circular "Set ROI".
- Seleccione "Dibuja ROI" (botón) y dibuje siete regiones circulares adyacentes de interés (ROI) en la médula espinal (Figura 11). Abra el menú "montaje" y seleccione la función "valor Curve". Observe el software se presentan varias curvas, cada uno correspondiente a los cambios de la concentración de microburbujas dentro de una ROI.
NOTA: Cada curva tiene un perfil "perfusión deperfusion". La primera fase de la curva es plana y se corresponde con el período anterior a la llegada de microburbujas. En la segunda fase, la concentración de microburbujas aumenta rápidamente como resultado de la infusión. En la tercera fase, que comienza cuando la infusión se ha completado, la concentración de microburbujas disminuye progresivamente a medida que disintegratse en el torrente sanguíneo. - Coloque la primera línea vertical al comienzo de la segunda fase de la cUrve y seleccione "SET". Esto informa al software dónde empezar análisis.
- Coloque la segunda línea vertical al final de la grabación y una vez más, seleccione "SET". Esto informa al software donde parar análisis.
- Mira el menú "Cv" y registre el valor "AUC", que corresponde a la "área bajo la curva" analizada. Este valor es proporcional a la SCPF dentro de la ROI correspondiente.
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Representative Results
Con el protocolo descrito anteriormente, es posible mapear la SCPF a lo largo de un segmento de médula espinal sagital longitudinal.
En la médula espinal intacta, no parece haber irregularidades SCPF dentro del parénquima (Figura 12). Esto se puede explicar por la distribución variable de las arterias-radiculo medular (RMA) de un animal a otro. RMA se refiere a segmentaria arterias que llegan a la arteria espinal anterior (ASA) y por lo tanto proporcionan el suministro de sangre a la parénquima de la médula espinal. En contraste, las arterias radiculares corresponden a segmentaria arterias, que no alcanzan el ASA y por lo tanto no proporcionan el suministro de sangre de la médula espinal. Por lo tanto, en los segmentos de la médula espinal donde la RMA anastomosa con la ASA, hay más flujo de sangre (como se muestra en los resultados).
Después de SCI, imágenes CEU en tiempo real muestra una deficiencia en la circulación en el epicentro lesión. El epicentro se mantiene (sin señal de agente de contraste) oscuro,ya que no hay flujo de sangre activo. Un análisis más detallado del flujo de la sangre usando varios ROIs muestra tres territorios de flujo de sangre únicas. En primer lugar, en el nivel del epicentro, el flujo de sangre es la más baja con una disminución media de alrededor de -90%. En segundo lugar, en los territorios adyacentes al epicentro (tanto rostral y caudal), SCPF fue también disminuyó significativamente (que van desde -50% a -80%). En tercer lugar, en las zonas más remotas correspondientes a tejido intacto, SCPF se conserva. La segunda región corresponde a la "zona de penumbra isquémica", que debería ser el objetivo de potenciales terapias neuroprotectoras. Ser capaz de visualizar y cuantificar fácilmente SCPF cambia post-SCI es útil para evaluar la eficacia de las terapias dirigidas a reducir la isquemia tisular, y por lo tanto pone de relieve la importancia de esta técnica (Figura 13).
Figura 2. Representación esquemática de la kit para microburbujas reconstitución y la Vueject ° bomba utilizada para microburbujas de infusión. El sistema de transferencia permite la entrega de microburbujas y solución salina entre el vial y la jeringa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. catéter yugular. El catéter se inserta en la vena yugular, luego empujó hacia el corazón y finalmente atar con un nudo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Método para la correcta identificación de los niveles vertebrales. En la rata, la última costilla se une a la vértebra XIII. Este último se puede palpar a través de la piel como un punto de referencia para la última vértebra torácica, el XIII. Los músculos se separan a ambos lados de las apófisis espinosas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Estabilización de los animales en el marco 3D. (1) Los dientes incisivos se enganchan en el bastidor mientras que las primera y segunda vértebras lumbares (L1 y L2) se sujetan con pinzas a medida. (2) La columna lumbar se aprieta ligeramente que estabiliza el animal y eleva el tórax desde el banquillo, lo que permite movimientos respiratorios gratis sin movimientos de la columna vertebral. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Detalles técnicos de la laminectomía. En primer lugar, la hoja fina de la cuchilla de hueso a medida se pasa por debajo de la lámina sin dañar la médula espinal. A continuación, el cortador de hueso está cerrado, que cuts y elimina una parte de la lámina. El procedimiento se repite en ambos lados y desde ThXII a TXIX a fin de lograr una laminectomía de cuatro niveles. Por último, las articulaciones también se eliminan. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Posicionamiento de la sonda de ultrasonidos y el dispositivo de impactación. La sonda es paralela a la médula espinal y ligeramente oblicua (20-30 °), de modo que el impactador de peso-drop puede ser colocado contra la cara posterior de la duramadre. La médula espinal debe ser visible con el canal central presente en todo el segmento medio de la ecografía "B-Mode". Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 8. contraste de formación de imágenes de la médula espinal intacta. Las cifras sucesivas en modo de contraste (imágenes de color naranja) muestran cómo el agente de contraste (microburbujas) aparece progresivamente después de la infusión, mejorando así el contraste de la médula espinal. Infusión de bolo dura aproximadamente 10 segundos y los datos de contraste se registró durante 1 minuto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Los cambios en modo B siguientes SCI experimental. Una lesión hiperecoico aparece dentro del parénquima, correspondiente a la del parénquima h inicial emorrhage post-SCI. Histología (H & E tinción): Los resultados de hemorragia traumática interrupción masiva de los pequeños vasos sanguíneos que conducen a la extravasación de sangre en el parénquima (escala amarilla bar = 2000 m). El dispositivo de retención se muestra a la derecha. El delantero se libera desde una altura de 10 cm y choca con el impactador que posteriormente genera la lesión de la médula espinal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. imágenes de contraste 15 min post-SCI. Similar a la Figura 8, las microburbujas son visibles a medida que pasan a través de la microvasculatura de la médula espinal. En el epicentro (asterisco), el flujo sanguíneo está obstruido por la interrupción microvascular.10large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11. Protocolo para la cuantificación SCPF. Con Ultra-Extender Software, siete regiones circulares y adyacentes de interés (ROI) se dibujan en la imagen de la longitudinal de la médula espinal. La primera ROI se coloca en el epicentro lesión. En cada ROI, el software genera una curva de perfusión-deperfusion y calcula el área bajo esta curva. Este valor se correlaciona con el flujo sanguíneo en esta zona. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 12. La heterogeneidad del flujo de sangre a lo largola médula espinal. Estas gráficas muestran la heterogeneidad del flujo de sangre de la médula espinal, así como la variabilidad entre animales. Esto puede explicarse en gran parte por la anatomía vascular de la médula espinal. Sin embargo, debido a la heterogeneidad y la anatomía vascular variables, uno debe utilizar las mediciones de flujo sanguíneo (de cada ROI) antes de la lesión como la línea de base. Las mediciones realizadas en los siguientes puntos de tiempo (post-SCI) se expresan como el porcentaje de cambio de la línea de base. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 13. Cambios en el flujo de sangre de la médula espinal (SCPF) inducida por la lesión de la médula espinal experimental (SCI). 15 minutos después de la SCI hay isquemia crítica en el nivel del epicentro mientras permaneció p SCPFreservada en las áreas intactas más remotas. En las regiones adyacentes al epicentro (tanto rostral y caudal), SCPF se reduce significativamente. Esto corresponde a la descrita anteriormente "zona de penumbra isquémica". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque hemos descrito cómo utilizar CEU en un modelo de rata contusión SCI, este protocolo puede ser modificado para adaptarse a otros objetivos experimentales o modelos SCI. Hemos elegido para medir SCPF a sólo dos puntos de tiempo (antes de la lesión y 15 minutos después de la SCI), sin embargo el número de puntos de tiempo y el retraso entre las medidas SCPF se pueden adaptar para satisfacer las necesidades de los otros estudios. Por ejemplo, en nuestro trabajo anterior 17, hemos medido SCPF en cinco puntos de tiempo sucesivos a lo largo de la primera hora después de la SCI. Es importante señalar que en el grupo de tratamiento simulado (sin SCI), nos sorprendió observar una disminución progresiva de SCPF. Mientras que inicialmente se temía que la infusión de microburbujas repetida podría dañar la vasculatura de la médula espinal, la experimentación adicional (datos no publicados) confirmó que estos cambios fueron causados por alteraciones progresivas en el tejido local de condiciones fisiológicas (temperatura, hidratación) inducida por la laminectomía, así como el prolongado exposición de tél duramadre y el tejido circundante a la del aire ambiente y el gel de ultrasonido. Estos problemas son comunes en todos los experimentos que se ocupan de la microcirculación, como la circulación es extremadamente sensible a muchos parámetros y, por tanto, propenso a vascoconstriction o vasodilatación. Por lo tanto, se recomienda que el período durante el cual la herida quirúrgica sigue abierto es lo más corta posible. Si se necesitan múltiples mediciones SCPF durante un período prolongado, sería preferible para cerrar la incisión animal entre las adquisiciones con el fin de restaurar las condiciones fisiológicas alrededor y dentro de la médula espinal.
También es posible modificar la forma, el tamaño, la ubicación y el número de ROIs para el análisis SCPF. Una de las principales ventajas de la CEU es que las mediciones se pueden realizar en cualquier momento después de la finalización experimental mediante el procesamiento de la línea de datos grabado. También es posible repetir las mediciones o modificar la configuración de medición / normas si es necesario.
La resolución espacial de imágenes por ultrasonido es proporcional a la frecuencia de las ondas de ultrasonido. Cuanto mayor sea la frecuencia de ultrasonido, mejor es la resolución espacial. Hemos utilizado un alto-Frecuencia (12-14 MHz) sonda, que proporciona una imagen con una resolución de píxel de aproximadamente 100 micras. Con los sistemas de muy alta resolución, la frecuencia aumenta hasta 55 MHz y cada píxel es de aproximadamente 20 micras 20. Tales dispositivos también se pueden utilizar para CEU, que representan de forma más precisa la distribución de SCPF en el parénquima. Sin embargo, los sistemas de muy alta resolución son mucho más caros.
Se han propuesto varias otras técnicas para medir SCPF en SCI, pero todos tienen limitaciones únicas. Algunos, como microesferas radioactivas 7,8 o la autorradiografía C14-yodo-antipirina 9, requieren el sacrificio de animales. En estos casos, la médula espinal debe ser cosechado para el análisis. Por otro lado, la técnica de aclaramiento de hidrógeno 10, requiere la inserción del electrodo intraespinal que en realidad puede modificar el SCPF. Por otra parte, la medición sólo se puede realizar en una región muy restringida de la parénquima de la médula espinal. Microscopía de luza través de una ventana de la médula también proporciona una manera de evaluar la microcirculación, pero este enfoque tiene una profundidad muy restringido de observación. Sólo se permite observar la circulación en la materia pia superficial y no dentro del parénquima 16.
En la literatura, en tiempo real las evaluaciones in-vivo de SCPF se realizan generalmente por imágenes de láser Doppler 11-13. Sin embargo, incluso esta técnica tiene varias limitaciones. En primer lugar, ya que el láser es de menos de 1 mm de diámetro, SCPF sólo puede ser evaluada en una zona muy restringido que corresponde a una semi-esfera de aproximadamente 1 mm de diámetro. Desde la médula espinal de la rata es de aproximadamente 3 mm de diámetro, el área limitada de análisis es una limitación importante. Por otra parte, como hemos demostrado que SCPF en la médula espinal intacta no es homogénea, es importante para medir SCPF en un área más grande para una representación adecuada de la microcirculación del tejido. En segundo lugar, el láser tiene una profundidad limitada de penetración y por lo tanto deteCTS SCPF superficial. Como resultado, no sólo mide SCPF parénquima sino también la de la piamadre (que rodea el parénquima). Desde la piamadre tiene un sistema vascular único y no se somete a los mismos mecanismos de autorregulación como los vasos del parénquima, esta información puede ser engañosa. Por último, el láser-Doppler no proporciona ninguna información morfológica. CEU supera estas limitaciones mediante la visualización de las imágenes morfológicas de la cuerda (modo B), mientras que la presentación de forma exclusiva el agente de contraste que puede ser claramente identificada dentro del parénquima.
A pesar de sus muchas ventajas a otros enfoques, CEU también tiene algunas limitaciones distintas. Dado que las mediciones se realizan en una rebanada sagital bi-dimensional (generalmente paralelo al canal central), SCPF de otras regiones del parénquima son inaccesibles. Además, la información generada por un segmento de cable de un solo bidimensional sagital espinal puede no ser representativa de todo el cable. Nevertheless, esto puede ser controlado por varias precauciones. En primer lugar, mediante la repetición de mediciones en el mismo lugar, la primera medición hecha (intacta la médula espinal) puede ser utilizado como un valor de referencia. En segundo lugar, por heridas en la línea media de la médula espinal (lesión bilateral), los cambios SCPF deben ser simétricas entre izquierda y derecha (datos no publicados). Estas precauciones ayudan a asegurar que el análisis de una sola rebanada sagital es suficiente para reflejar la distribución longitudinal mundial de SCPF.
El alto costo de las máquinas de ultrasonido es otra limitación. Sin embargo, existen varias soluciones para orientar este problema. En primer lugar, algunos laboratorios pueden negociar un préstamo temporal por el fabricante para sus experimentos. Como las máquinas de ultrasonido son transportables, préstamos temporales son posibles. Este ha sido el enfoque utilizado por nuestro laboratorio. Por otra parte, un grupo de laboratorios puede aunar recursos para comprar la máquina y dividir los costos. De lo contrario, muchas instituciones universitarias tienen instalaciones de imagen y máquina de ultrasonidos se puede recomendar como herramientas esenciales. Por lo tanto, los animales pueden ser transportados de la instalación de formación de imágenes para la evaluación CEU y luego devueltos para otros experimentos.
Para evaluar los cambios vasculares, agente de contraste (microburbujas) debe ser inyectado por vía intravenosa. Aunque la cateterización de la vena yugular o femoral es invasiva y riesgosa, las venas son fácilmente accesibles y claramente identificable. En contraste, inyección en la vena de la cola es mucho menos invasiva, pero el recipiente es poco distinguido / visible para la cateterización adecuada. Por lo tanto, hay un riesgo de que la punta de la aguja no se colocará correctamente dentro de la vena o que se puede mover durante la inyección, comprometer todo el experimento. Por tal razón, se prefiere usar la vena yugular y introducir un catéter para infusión de microburbujas constante.
Huesos de vértebras que rodean la médula espinal. Como las ondas de ultrasonido se reflejan por el hueso y no pueden pasar a través de las láminas de médula espinal, de formación de imágenes requiereeliminación de hueso (laminectomía) para abrir una ventana acústica. La forma más fácil para abrir el canal vertebral es quitar el arco posterior de la vértebra a través de una laminectomía. En este protocolo, se requiere una laminectomía de cuatro niveles de visualizar un largo segmento de la médula espinal, incluyendo el epicentro, la zona de penumbra y zonas remotas del intacta la médula espinal. Aunque la mayoría de los modelos experimentales SCI requiere una laminectomía (para aplicación clip o contusión impactador), estos por lo general consisten en la eliminación de la lámina 1-2. La amplia laminectomía 4 niveles es otra limitación de nuestro estudio. Sin embargo, si uno sólo tiene que estudiar la zona epicentro y penumbra, una menos extensa laminectomía puede hacerse y se recomienda.
En conclusión, a pesar de los varios límites descritos anteriormente, CEU es una herramienta útil para evaluar cambios SCPF y el efecto de diversas terapias (fines de investigación). Esto, fiable en tiempo real, el enfoque es en-vivo ideal para mirar a tratamientos para reducirisquemia y necrosis tisular posterior post-SCI.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
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