Kontrastförstärkt ultraljud Imaging för Bedömning av ryggmärgs blodflöde i experimentell Ryggmärgsskada
Summary
Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.
Abstract
Minskad ryggmärgs blodflöde (SCBF) (dvs, ischemi) spelar en nyckelroll i traumatisk ryggmärgsskada (SCI) patofysiologi och är därför ett viktigt mål för neuroprotektiva terapier. Även om flera tekniker har beskrivits för att utvärdera SCBF, de alla har betydande begränsningar. För att övervinna det senare, föreslår vi användning av realtids-kontrastförstärkt ultraljud (CEU). Här beskriver vi tillämpningen av denna teknik i en rått kontusion modell av SCI. En jugular kateter implanteras först för upprepad injicering av kontrastmedel, en natriumkloridlösning svavelhexafluorid inkapslade mikrobubblor. Ryggraden är sedan stabiliseras med en skräddarsydd 3D-ram och ryggmärgen dura mater exponeras genom en laminektomi vid ThIX-ThXII. Ultraljudssonden positioneras sedan vid den bakre sidan av dura mäter (belagd med ultraljudsgel). För att bedöma baslinjen SCBF, en enda intravenös injektion (400 l) av contrast Medlet appliceras för att registrera dess passage genom den intakta ryggmärgen mikrovaskulatur. En vikt-släpp anordning används därefter för att generera en reproducerbar experimentell kontusion modell av SCI. Kontrastmedlet återinjiceras 15 minuter efter skadan för att bedöma efter SCI SCBF förändringar. CEU möjliggör realtid och in vivo bedömning av SCBF förändringar efter SCI. I den oskadade djur, ultraljud visade ojämn blodflödet längs den intakta ryggmärgen. Vidare, 15 min efter SCI, det var kritisk ischemi i nivå med epicentrum medan SCBF förblev bevarade i de mer avlägsna intakta områden. I de regioner som gränsar till epicentrum (både rostralt och caudal), var SCBF minskas betydligt. Detta motsvarar den tidigare beskrivna "ischemisk Penumbra zon". Detta verktyg är av stort intresse för att bedöma effekterna av behandlingar som syftar till att begränsa ischemi och den resulterande vävnadsnekros efter SCI.
Introduction
Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) är en förödande tillstånd vilket leder till betydande försämring i motor, sensoriska och autonoma funktioner. Hittills har ingen terapi visat sig vara effektiv hos patienter. För en sådan anledning, är det viktigt att identifiera nya tekniker som kommer att förbättra bedömningen av potentiella behandlingar och kan ytterligare belyser skada pathiophysiology 1.
SCI är uppdelad i två på varandra följande faser, kallade primära och sekundära skador. Den primära skadan motsvarar den initiala mekaniska förolämpning. De sekundära skadegrupperna en kaskad av olika biologiska händelser (såsom inflammation, oxidativ stress och hypoxi) som ytterligare bidrar till den progressiva expansionen av den ursprungliga skadan, vävnadsskada och därför neurologiska underskott 2,3.
Vid den akuta fasen av SCI är neuroprotektiva behandlingar syftar till att minska sekundära skador patologi och shOuld följaktligen förbättra neurologiska utfall. Bland de många sekundära skadehändelser, spelar ischemi en avgörande roll 4,5. På nivån för SCI epicentrum, de skadade parenkyma mikrokärl hämma en effektiv ryggmärgen blodflöde (SCBF). Dessutom är SCBF minskade också signifikant i den region som omger skadan epicentrum, ett område som särskilt kallas "ischemisk Penumbra zon". Om SCBF inte kan snabbt återställas inom dessa områden, kan ischemi leda till kompletterande parenkymal nekros och ytterligare nervvävnadsskada. Som även den minsta vävnads bevarande kan få betydande effekter på funktion, är det av stort intresse att utveckla läkemedel och behandlingar som kan minska ischemi efter SCI. För att belysa detta fenomen har tidigare arbete visat att bevarandet av endast 10% av myeliniserade axoner var tillräckligt för att möjliggöra promenader i katter efter SCI 6.
Även om flera tekniker har beskrivits för att utvärdera SCBF, deny alla har betydande begränsningar. Till exempel användning av radioaktiva mikrosfärer 7,8 och C14-iodopyrine autoradiografi 9 kräver efterföljande djuroffer och kan inte upprepas vid senare tidpunkter. Clearance vätetekniken 10 beror på införing av intraspinala elektroder, vilket ytterligare kan skada ryggmärgen. Även laser Doppler imaging, fotopletysmografi 14,15 och in vivo ljusmikroskop 16 har ett mycket begränsat djup / område för mätning 11-13.
Vårt team har tidigare visat att kontrastförstärkt ultraljud (CEU) avbildning kan användas för att bedöma realtid och in-vivo SCBF förändringar i rått ryggmärgen parenkymet 17. Det är viktigt att notera att en liknande teknik anbringades av Huang et al., I en grismodell av SCI 18. CEU tillämpar ett bestämt sätt att ultraljudsundersökningar som gör det möjligt att koppla gråskala morfologiska imåldrar (som erhållits genom konventionella B-läge) med geografiska fördelningen av blodflödet 19. Den SCBF avbildning och kvantifiering bygger på intravaskulär injektion av eko-kontrastmedel. Kontrastmedlet består av svavelhexafluorid mikrobubblor (medeldiameter av ca 2,5 ^ m och 90% har en diameter mindre än 6 pm) stabiliseras genom fosfolipider. Mikrobubblorna speglar ultraljudstrålen som avges av sonden förstärker därmed blodets ekosignaler och ökar kontrasten i vävnaderna i enlighet med deras blodflöde. Det är därför möjligt att bedöma blodflödet i en viss region av intresse i enlighet med intensiteten hos den reflekterade signalen. Mikrobubblorna är också säkra och de har kliniskt tillämpats i människa. Den svavelhexafluorid snabbt rensas (genomsnittlig terminal halveringstid är 12 minuter) och mer än 80% av den administrerade svavelhexafluorid återfinns i utandningsluften inom 2 minuter efter injektionen. Detta protokoll ger ett enkelt sätt att använda CEU imaging att bedöma SCBF förändringar hos råtta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om vi har beskrivit hur man använder CEU i en råtta SCI kontusion modell, kan detta protokoll ändras för att passa andra experimentella mål eller SCI modeller. Vi har valt att mäta SCBF endast två tidpunkter (före skadan och 15 minuter efter SCI), men antalet tidpunkter och fördröjningen mellan SCBF mätningar kan anpassas för att uppfylla behoven hos andra studier. Till exempel, i vårt tidigare arbete 17 har vi mätt SCBF vid fem på varandra följande tidpunkter under hela den första timm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Comments/Description | |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
References
- Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: a systematic review of current treatment options. Clin Orthop Relat Res. 469 (3), 732-741 (2011).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- MacDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
- Mautes, A. E., Weinzierl, M. R., Donovan, F., Noble, L. J. Vascular events after spinal cord injury: contribution to secondary pathogenesis. Phys Ther. 80 (7), 673-687 (2000).
- Martirosyan, N. L., et al. Blood supply and vascular reactivity of the spinal cord under normal and pathological conditions. J Neurosurg Spine. 15 (3), 238-251 (2011).
- Blight, A. R. Cellular morphology of chronic spinal cord injury in the cat: analysis of myelinated axons by line-sampling. Neuroscience. 10 (2), 521-543 (1983).
- Bassingthwaighte, J. B., et al. Validity of microsphere depositions for regional myocardial flows. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H184-H193 (1987).
- Drescher, W. R., Weigert, K. P., Bunger, M. H., Hansen, E. S., Bunger, C. E. Spinal blood flow in 24-hour megadose glucocorticoid treatment in awake pigs. J Neurosurg. 99 (3 Suppl), 286-290 (2003).
- Golanov, E. V., Reis, D. J. Contribution of oxygen-sensitive neurons of the rostral ventrolateral medulla to hypoxic cerebral vasodilatation in the rat. J Physiol. 495 (Pt 1), 201-216 (1996).
- Ueda, Y., et al. Influence on spinal cord blood flow and function by interruption of bilateral segmental arteries at up to three levels: experimental study in dogs). Spine (Phila Pa 1976). 30 (20), 2239-2243 (2005).
- Carlson, G. D., et al. Sustained spinal cord compression: part II: effect of methylprednisolone on regional blood flow and recovery of somatosensory evoked potentials). J Bone Joint Surg Am. 85-A (1), 95-101 (2003).
- Hamamoto, Y., Ogata, T., Morino, T., Hino, M., Yamamoto, H. Real-time direct measurement of spinal cord blood flow at the site of compression: relationship between blood flow recovery and motor deficiency in spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 32 (18), 1955-1962 (2007).
- Horn, E. M., et al. The effects of intrathecal hypotension on tissue perfusion and pathophysiological outcome after acute spinal cord injury). Neurosurg Focus. 25 (5), E12 (2008).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Phillips, J. P., George, K. J., Kyriacou, P. A., Langford, R. M. Investigation of photoplethysmographic changes using a static compression model of spinal cord injury. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009, 1493-1496 (2009).
- Ishikawa, M., et al. Platelet adhesion and arteriolar dilation in the photothrombosis: observation with the rat closed cranial and spinal windows. J Neurol Sci. 194 (1), 59-69 (2002).
- Soubeyrand, M., et al. Real-time and spatial quantification using contrast-enhanced ultrasonography of spinal cord perfusion during experimental spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 37 (22), E1376-E1382 (1976).
- Huang, L., et al. Quantitative assessment of spinal cord perfusion by using contrast-enhanced ultrasound in a porcine model with acute spinal cord contusion). Spinal Cord. 51 (3), 196-201 (2012).
- Postema, M., Gilja, O. H. Contrast-enhanced and targeted ultrasound. World J Gastroenterol. 17 (1), 28-41 (2011).
- Soubeyrand, M., Badner, A., Vawda, R., Chung, Y. S., Fehlings, M. Very High Resolution Ultrasound Imaging for Real-Time Quantitative Visualisation of Vascular Disruption After Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. , (2014).
- Akhtar, A. Z., Pippin, J. J., Sandusky, C. B. Animal models in spinal cord injury: a review. Rev Neurosci. 19 (1), 47-60 (2008).
