Introduction
Studio di Drosophila melanogaster ha fornito grandi intuizioni nella regolazione genetica di una vasta gamma di fenomeni. In particolare, non vi è stata un'ampia ricerca sullo sviluppo delle uova, perché ovogenesi fornisce un modo trattabili per indagare molti diversi processi di sviluppo, tra cui patterning tessuti, i cambiamenti di polarità cellulare, la commutazione del ciclo cellulare, e la regolazione traslazionale 1,2,3,4. Un importante evento morfogenica durante oogenesi è la specificazione, l'acquisizione di motilità e la migrazione di un insieme di cellule chiamate cellule di confine (recensito in 5). Poiché la migrazione delle cellule è una caratteristica chiave della morfogenesi animali, e perché la regolazione genetica di questo processo è ben conservato, meccanismi di determinati in mosche sono suscettibili di essere importante in altri contesti. Quindi, stiamo studiando il controllo molecolare della migrazione delle cellule di confine. Per i nostri studi, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per osservare i poli anteriori di sviluppo delle uova,dove sorgono le cellule di confine, per esaminare come si sviluppano nel dettaglio.
All'interno l'ovaio, esistono camere uovo a vari stadi di sviluppo lungo le catene di chiamate ovarioli, che sono racchiusi in un sottile guaina (Figura 1A). Ogni camera di uovo andrà a formare un uovo. Durante oogenesi, diversi tipi di cellule devono sviluppare in modo coordinato. Il D. Camera melanogaster uovo è composto da 16 celle germinali, tra cui un ovocita, circondato da un singolo strato epitelio follicolare 6. Un piccolo numero di cellule specializzate, chiamate cellule polari, sorgono a anteriore e posteriore poli dell'epitelio. Le cellule di frontiera 6-8 originano nell'epitelio anteriore della camera di uovo, indotta dalle cellule polari 5,7. A metà oogenesi (fase 9), le cellule di confine si staccano dai loro vicini e migrano tra le cellule nutrici per raggiungere l'ovocita al posteriore della camera di uovo 5,7. Questo movimento deve essere realizzatomentre le cellule di confine rimangono in un cluster circostante due celle polari non mobili, rendendo questo tipo di migrazione cellulare collettiva. La migrazione di successo del cluster cella di bordo assicura il corretto sviluppo del micropilo del guscio d'uovo, che è necessaria per la fecondazione.
Le cellule polari anteriori istruiscono il destino delle cellule di confine attivando una cascata di trasduzione del segnale. Cella polare secernono una citochina, non accoppiato (UPD), che si lega ad un recettore transmembrana, Domeless (DOME), sulla vicina cellule del follicolo durante fase 8 dello sviluppo dell'ovocita 8,9. Il legame di UPD provoca Janus tirosin chinasi (JAK) di fosforilare il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT) 8,10,11. STAT sposta quindi al nucleo di attivare la trascrizione. Le cellule di confine lenti (SLBO) è un fattore di trascrizione che è un bersaglio trascrizionale diretta di STAT ed è anche necessario per la migrazione delle cellule di confine 12. Viste laterali delle camere uovo indicano tattività di STAT cappello è regolata in un gradiente attraverso l'epitelio anteriori 8,11,13. Cellule del follicolo vicini alle cellule polari hanno i più alti livelli di attivazione STAT, quindi diventano cellule di frontiera e invadono il tessuto germinale adiacente.
Per capire come le cellule di confine sono specificati all'interno e si staccano dal epitelio, abbiamo bisogno di osservare come il tessuto è organizzato. Se consideriamo le camere di uova da una prospettiva antero-on, ci aspetteremmo simmetria radiale di attività STAT nelle cellule follicolari che circondano le cellule polari. Un dall'estremità vista sarebbe anche mostrare più accurato differenze di proteine di membrana e interfacce cellula-cellula prima e durante il distacco che confrontando cellule in differenti piani focali. Perché le camere di uova sono oblunghe e attaccato tra loro da cellule gambo, si depositano su vetrini lateralmente, il che rende difficile osservare l'architettura anteriore. Pertanto, molte informazioni sulle cellule ai poli della camera uovo hastato dedotto da viste laterali. Anche se alcune informazioni possono essere ottenute attraverso algoritmici 3-D ricostruzioni di sezioni ottiche, dispersione della luce, photobleaching e limiti più poveri della risoluzione dell'asse Z rendere queste informazioni meno dettagliate e affidabili, in assenza di tecniche costose come super-risoluzione microscopio 14 . Altri tipi di immagini sezione a base (per esempio, microscopia elettronica o microtomo sezionamento) richiedono ampie manipolazione dei tessuti, comprendenti disidratazione, aumentando la probabilità di artefatti. Così, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l'immagine D. camere melanogaster uovo mentre in posizione verticale. Questo metodo è già dimostrato utile nel chiarire come cellule mobili sono fated (vedere risultati rappresentativi e Manning et al, in esame), ed è probabile che sia più ampiamente prezioso negli studi di altri aspetti della oogenesis.
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Protocol
1. dissezione ovarioli
- Trasferire una quindicina di 2-4 giorni di età mosche femmine e alcuni maschi di una nuova mosca alimento flacone con aggiunta di lievito secco attivo. Utilizzare il cotone come una presa per i flaconi, e aggiungere qualche goccia di acqua per il cotone per mantenere l'umidità alta.
- Luogo flacone in un incubatore a 25 ° C per 14-16 ore per massimizzare il numero di stage 8-10 camere uovo.
NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda della temperatura e la fase desiderata. - Preparare i media dissezione, 0.1M KPO 4 e NP40 soluzioni come necessario per il giorno successivo (vedi Materiali).
- Anestetizzare linea con CO 2, e mettere sotto un microscopio dissezione. Dispensare alcune gocce di media dissezione in ogni cavità nella diapositiva depressione vetro.
- Tenere pinze in ogni mano ad un angolo di circa 30 ° rispetto al piano del tavolo e orientare una mosca femmina con le ali giù. Con la mano non dominante, prendere la femmina usando pinze, afferrando il suo al dinterior dell'addome, vicino al torace, e la immergere nei media dissezione nella depressione slitta (Figura 1A riquadro).
- Con l'altra coppia di pinze, afferrare l'esoscheletro al posteriore ventrale dell'addome e perforare attraverso. Afferrare le ovaie alla estremità posteriore, quindi tirare fuori dell'addome e posto in media fresca sull'altro lato della slitta depressione. (Figura 1A riquadro). Evitare di tirare a parte l'intestino. Eliminare la carcassa.
- Ripetere con gli altri mosche femminili fino a quando tutte le ovaie vengono sezionati. Eliminare i maschi.
- Con una coppia di pinze, tenere un'ovaia alla fine posteriore (vicino più grandi camere d'uovo), e con l'altra mano usare un paio di pinze per pizzicare una delle camere più uova anteriori (germarium). (Figura 1A).
- Lentamente e costantemente, tirare una catena ovariole dalla guaina dell'ovaio. Continuare a sezionare fuori ovarioli individualmente fino a quando tutte le camere uovo desiderati sono rdell'uso e rimossi.
- Ripetere i passaggi 1,7-1,8 per tutti ovaie sezionati.
- Una volta completato, il trasferimento ovarioli ad un tubo 0,6 ml con una pipetta di trasferimento di plastica.
- Lasciate ovarioli depositano sul fondo della provetta, quindi procedere al fissaggio e colorazione passi.
2. immunofluorescenza (IF) La colorazione di ovarioli
- Rimuovere con attenzione i media dissezione da ovarioli con una pipetta. Assicurarsi di non rimuovere eventuali ovarioli o camere di uova. Lasciare circa 50 ml di ovarioli e media dissezione.
- Aggiungere 50 ml di 16% paraformaldeide a 150 ml di 0,1 M KPO 4 Buffer in un tubo, e aggiungere la soluzione alle camere uovo di correggerli. Incubare mentre a dondolo per 10 min. ATTENZIONE: paraformaldeide è tossico.
- Rimuovere fissativo e lavare due volte con 0,5 ml di tampone di lavaggio NP40.
- Lavare due volte per 15 minuti ciascuno a RT.
- Fare riferimento alla norma se il protocollo 15 per passi successivi.
- In breve, dopo la fissazione, aggiungereanticorpi primari alle diluizioni appropriati e incubare O / N a 4 ° C. Lavare in NP40 più volte, quindi aggiungere anticorpi secondari (1: 200) diluizioni.
- Lavare più volte in NP40, quindi aggiungere DAPI (1: 1.000) per 10 minuti, quindi ripetere lavaggi. Una volta se il protocollo è completo, aggiungere 200 ml di glicerolo al 50% in PBS per camere d'uovo e lasciate riposare a temperatura ambiente per 2 ore.
- Rimuovere la soluzione, sostituirlo con il 70% glicerolo in PBS, e coprire con un foglio. Posizionare campione a 4 ᵒC fino al momento per il montaggio. Nel frattempo, continuare con il passo 3.
3. preparazione preliminare di diapositive gelatina glicerina
- Misurare almeno 4 ml di glicerina gelatina con una spatola e riempire un tubo di coltura cellulare di vetro per il marchio a metà strada. Sciogliere gelatina glicerina in un bagno di acqua a 55 ° C per 30 min.
- Versare una piccola goccia di glicerolo, circa 300 ml, dalla soluzione madre su due vetrini da microscopio. Utilizzando un tessuto, diffuso glicerolo in un sottile layer su ciascuna delle diapositive. Ciò fornisce una base e consente una facile rimozione di gelatina glicerina al punto 5.6.
- Tagliare la punta fuori di un filtrato puntale 1.000 ml. Usa taglio puntale per trasferire 1000-1500 ml di caldo gelatina glicerina lentamente ad ogni vetrino da microscopio. Fare attenzione per evitare le bolle.
- Lasciate diapositive gelatina glicerina riposare per 5 minuti a temperatura ambiente per impostare.
- Collocare ogni diapositiva gelatina glicerina in 60 mm × 15 mm piatto di Petri e coprire con pellicola trasparente. Posto a 4 ° CO / N. Facoltativamente, negozio di glicerina scivoli gelatina per un massimo di 5 giorni a 4 ° C.
4. Montaggio Egg Chambers
- Utilizzando campioni dal punto 2.5, pipette alcune gocce 3 microlitri delle camere uovo nel 70% glicerolo attraverso uno glicerina gelatina diapositiva. Continuare pipettaggio 3 gocce microlitri fino a quando tutte le camere di uova sono in questa diapositiva. Assicurarsi che ogni goccia contiene almeno dieci camere d'uovo. Nel frattempo, scaldare un tubo cultura di gelatina glicerina in un bagno di 55 ° C Acque.
- Posizionare il vetrino gelatina glicerina con le camere d'uovo al microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una goccia di camere uovo è nel campo di vista (Figura 1B).
- Utilizzando un ago calibro 30 come un cucchiaio, prendere la camera stadio di uovo desiderato. Quando necessario, camere uovo desiderati separati da una catena ovariole utilizzando l'ago come un coltello.
- Per evitare detriti che possono interferire con le immagini, trasferire la camera delle uova alla seconda diapositiva gelatina glicerina, con la parte anteriore rivolta verso sinistra (Figura 1E -1). Ripetere finché ci sono almeno sette camere uovo allineati in una colonna (Figura 1C).
- Formare nuove colonne di sette finché tutte le camere uovo desiderati vengono trasferiti alla seconda slitta gelatina glicerina.
- Strappare un piccolo pezzo di tessuto e di torsione. Usare questo per assorbire l'eccesso di PBS-Glicerolo dalle camere di uova da sfiorando ciascuno. Fare attenzione a non rimuovere le camere di uova.
- Tagliare ilpunta di un filtrato puntale 200 microlitri. Utilizzare questo per trasferire 150 ml di glicerina gelatina per coprire tutte le colonne delle camere uovo.
NOTA: La quantità di glicerina gelatina necessario per coprire le colonne si riferiscono al fasi camera d'uovo e il numero di colonne. Importo può essere regolata. - Lasciate che le camere d'uovo montati riposare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando lo strato superiore della gelatina glicerina è completamente solidificato (Figura 1D).
- Luogo di diapositive delle camere uovo montati in un piatto di 60 mm × 15 millimetri di Petri e coprire con pellicola trasparente. Conservare a 4 ° CO / N per consentire gli strati gelatina glicerina per solidificare insieme (posto al buio se non vi è preoccupazione per photobleaching).
5. Preparazione di uova Chambers for Imaging
- Mettere diapositive delle camere uovo montati sotto un microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una colonna di camere uovo è nel campo visivo.
- Utilizzando un angolo di 45 ° bisturi in miniatura, tagliare un straight linea lungo il lato destro della prima colonna di camere d'uovo (vicino al lato posteriore delle camere d'uovo). (Figura 1D-E)
- Quindi, tagliare sopra la prima camera uovo in alto e in basso l'ultima camera di uovo in colonna. A questo punto la colonna di camere uovo deve essere tagliato su tre lati.
- Utilizzando un microknife, fetta lungo il lato sinistro della colonna, il più vicino possibile al lato anteriore delle camere d'uovo (Figura 1E -3).
- Dispensare 100 ml di freddo 1X PBT sulla colonna di taglio.
- Utilizzare una spatola rotonda taglio per rimuovere la gelatina glicerina in eccesso intorno a tre lati della colonna taglio delle camere uovo e scartare, lasciando il resto della diapositiva.
- Inserire la spatola nella taglio effettuato sul lato anteriore della camere d'uovo e separare la colonna dal blocco gelatina glicerina primaria.
- Preparare i campioni per entrambi invertiti (5.8.1) o verticale (5.8.2) microscopia.
- Per invertito Microscopio: t Transferegli colonna camere uovo per un coprioggetto con il lato anteriore delle camere uovo rivolto verso il basso. Ripetere i passaggi 5,2-5,8 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montato. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d'uovo per evitare che si secchi. Camere di uova Immagine direttamente sul coprioggetto.
- Per microscopio verticale: Trasferire la colonna di camere uovo di un vetrino da microscopio con il lato anteriore rivolto verso l'alto. Ripetere i passaggi 5,2-5,9 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montati su vetrini da microscopio. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d'uovo e blocchi di copertura con un # 1 ½ coprioggetto.
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Representative Results
Il metodo di imaging in posizione verticale ha permesso di vedere direttamente l'organizzazione delle cellule dell'epitelio follicolare anteriore in fase 8. indicatore generale per il destino delle cellule del follicolo, il Occhi Assente (EYA) di proteine, così come il marcatore DNA nucleare DAPI, ha mostrato anche espressione in questo campo delle celle, e hanno dimostrato che tutte le cellule potrebbero essere visti con simili intensità di colorazione (Figura 2b "). Proteine regolate in risposta al UPD citochina, tuttavia, hanno mostrato schemi variabili e livelli di espressione. Cella polare rilasciano UPD apicale prima di questa fase di sviluppo delle uova 16,17, quindi ci aspettavamo STAT da attivare radialmente sulle cellule polari, che era a volte il caso. Spesso, però, abbiamo osservato che gli obiettivi a valle di STAT, tra cui SLBO, avevano modelli di espressione più complesse. Ad esempio, GFP reporter di espressione SLBO apparso in più, ma non tutti, le cellule che circondano le cellule polari (Figura 2B, e vedere Manning et al fase di revisione). Abbiamo notato piccole differenze nei E-caderina espressione / localizzazione (Figura 2B '), che possono riflettere cambiamenti di aderenza, ma più lavoro sarà necessario per quantificare e interpretare questo risultato. Queste sottigliezze non erano rilevabili attraverso laterale ricostruzione tridimensionale di camere uovo in scena (Figura 2C-D). Le differenze sull'asse apicale-basale delle cellule follicolari possono anche essere distinti utilizzando il metodo verticale. Abbiamo usato una linea reporter per la proteina anello canale Visgun (VSG), che è presente nella regione apicale delle membrane plasmatiche 18 (Figura 3A). Upright immagini confermata espressione VSG è stato rilevato nella parte apicale delle cellule del follicolo, vicino alla parte più stretta delle cellule polari (Figura 3B).
Abbiamo trovato anche che il metodo di imaging in posizione verticale funziona bene per visualizzare l'epitelio anteriore in fase di 9 camere di uova. A questo develfase opmental, le celle di confine si uniscono insieme intorno alle cellule polari (Figura 4A). Potremmo osservare questi cluster compattati mediante fine-sull'imaging (Figura 4B-C). Come in fase 8, abbiamo trovato i livelli simili di espressione EYA in tutte le cellule epiteliali (non mostrato), mentre slbo GFP e attivato, STAT nucleare segnate le cellule di confine mobili (Figura 4B e 4C). La localizzazione di proteine FAS3 indicata l'interfaccia cellule cellula-polare (Figura 4B). Inoltre, in entrambi gli stadi 8 e 9 abbiamo potuto vedere i grandi cellule infermiera, come indicato da DAPI o falloidina-colorazione dell'actina corticale (non mostrato), che suggerisce questo metodo sarà anche utile nello studio di cellule germinali o cellule germinali interazioni delle cellule -follicle.
Figura 1. montaggio verticale di Drosophila camera delle uovas. (A) Drosophila ovaio indicando camera delle uova, fodero, e ovariole. Raffigurazione illustra la posizione di pinze per tirare il ovariole lentamente dalla guaina dell'ovaio. Inserto mostra il posizionamento di mosca per la dissezione. Lato ventrale della mosca femminile rivolto verso l'alto. A-anteriore, P-posteriore. (BD) Procedura di montare camere di uova. (B) Una piccola goccia di camere d'uovo in 70% glicerolo-PBS, visto sotto uno stereomicroscopio dissezione. La freccia gialla indica una catena ovariole; freccia gialla indica una camera uovo individuale. Red freccia indica il bordo della goccia glicerolo-PBS. (C) Colonne di camere uovo disposte su strato sottile di solidificato gelatina glicerina. Freccia gialla indica una camera uovo individuale. (D) Un secondo strato sottile di fuso gelatina glicerina copre le colonne camera uovo per incorporare loro. Giallo linea tratteggiata indica dove i tagli dovrebbero essere fatti dopo O / N incubazione a 4ᵒC. Freccia rossa indica ilbordo del secondo strato di gelatina glicerina. Red numeri indicano l'ordine di tagliare le colonne camera uovo (orizzontale superiore e tagli inferiori non sono mostrati). Anteriore è a sinistra. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Imaging dell'epitelio anteriore di uno stadio 8 camera delle uova presto. (A) Vista laterale di una fase 8 celle di confine lento (slbo) gene reporter camera delle uova (genotipo: slbo -Gal4, UAS-mCD8-GFP) 19,20, macchiato con DAPI e anticorpi primari come indicato o per slbo> GFP. Armadillo (ARM) è la mosca omologo di β-catenina. Anteriore (A) è a sinistra, posteriore (P) a destra. (BB ") End-on viste di un uovo chamber. Ricostruzione tridimensionale di immagini Z-stack di uno stadio 8 slbo- gene reporter camera uovo montato in posizione verticale, macchiato con anticorpi primari come indicato. Asterischi Magenta indicano cellule polari. DAPI segna i nuclei. (B ') slbo> GFP è espresso solo nelle cellule di confine presuntivi (SLBO). E-caderina (E-CAD) è una molecola di adesione localizzato alla membrana e arricchito in cellule di confine. (B '') Occhi Assente (EYA) si trova in modo uniforme espressa nei nuclei di tutte le cellule del follicolo tranne cellule polari. (C) Visualizzazione standard laterale di una slbo -reporter fase 8 camera delle uova colorate con DAPI (blu) e gli anticorpi contro la GFP (SLBO, verde), ARM (rosso), e FAS3 (bianco). Inserto mostra gli assi: l'asse X è basso (freccia verde), Y è verso sinistra (freccia rossa), e l'asse Z è verso il visualizzatore (blu) (D) Per confronto alla nuova tecnica. , questo pannello mostra un crea end on-viewta da una ricostruzione tridimensionale, trattati con software Volocity, utilizzando un Z-pila di immagini laterali della camera dell'uovo mostrato in C. inserto mostra gli assi torniti: l'asse X è basso (freccia verde), Z-asse Ora verso sinistra (freccia blu), e l'asse Y è verso lo spettatore (rosso). Le singole celle sono sfocate a causa della bassa risoluzione in Z; in tal modo, il nuovo approccio illustrato in B rappresenta un significativo miglioramento delle immagini. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto espressione della proteina in settori laterali e anteriori dell'epitelio follicolare di una camera di uovo fase 8. (A) Ricostruzione di una vista laterale di una camera di fase 8 uovo di visgun (VSG) GFP giornalista <sup> 21-23, colorate per anticorpi diretti contro GFP o ARM (bianco). DAPI segna i nuclei in blu, e grandi nuclei delle cellule infermiere sono evidenti. VSG localizza ai canali anello di cellule del follicolo (verde). (BB ') End-on vista un uovo chamber.Three-dimensionale ricostruzione di un Z-stack di immagini di uno stadio 8 VSG-GFP camera giornalista uovo, macchiato con anticorpi primari come indicato. Proteine SLBO (rosso) viene rilevata in entrambi i nuclei delle cellule polari e di frontiera. ARM segna membrane cellulari follicolo e si arricchisce in cellule di confine; DAPI etichette nuclei. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Imaging dei primi stage 9 camere di uova. (A) Vista laterale di una prima fase 9 slbo -reporter camera delle uova. Le celle di confine (verde) sono raggruppati all'interno dell'epitelio anteriore (freccia bianca). BC) End-on vista delle camere uovo. Ricostruzione tridimensionale di un Z-stack di immagini da una fase iniziale 9 gene slbo- camera giornalista uovo, colorati con anticorpi primari diretti contro le proteine come indicato o GFP. (B) slbo> GFP è espressa nelle cellule di confine (verde) , mentre Fasciclin 3 (FAS3, bianco) localizza altamente alla membrana tra le due cellule polari; DAPI segna il nuclei (blu). Asterischi Magenta indicano cellule polari. (C) Sia nucleare (attivato) STAT e slbo> espressione GFP si trovano solo nelle cellule di confine, mentre E-caderina (E-CAD) segna le membrane delle cellule del follicolo, e DAPI indica i nuclei. Asterischi Magenta indicano cellule polari. Risultati di colorazione sono riportati singolarmente per slbo> GFP (C ') e STAT (C' ') Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui si descrive un metodo per montare e immagine piccola, sviluppando camere uovo da una prospettiva dall'estremità. Tecniche comuni per le camere di imaging di uova sono ottimizzati per le viste laterali e soprattutto permettono una visualizzazione precisa delle cellule del follicolo medio-laterale quando colorati con anticorpi fluorescenti. L'uso di Z-stack o 3-D ricostruzioni aiuti in visualizzazione di più piani focali, ma è ancora insufficiente per la risoluzione sub-cellulare dei poli delle camere uovo ellittica (Figura 2D). Mentre questo può essere superato parzialmente alle nuove tecniche di microscopia come super-risoluzione di imaging, questi metodi sono costosi e non sempre disponibili. Abbiamo adattato protocolli di imaging in posizione verticale per Drosophila Embrioni 24,25 da utilizzare per le camere di uova molto più piccole. Ci sono diverse modifiche chiave nel metodo per spiegare la dimensione molto più piccola delle camere di uova rispetto agli embrioni. Una componente chiave della tecnica descritta è la SEPAR fisicozione delle singole camere, che non è richiesto di embrioni. Un altro cambiamento è l'uso di una seconda slitta gelatina glicerina durante il montaggio (4.4). Le dimensioni delle camere uovo e il loro fissaggio attraverso celle gambo ad altre camere di uova richiede la manipolazione con l'ago e porta alla distruzione di gelatina glicerina. Pertanto, camere d'uova devono essere trasferiti con un ago per una nuova diapositiva gelatina glicerina per il montaggio (4.5). Imaging verticale permette la visualizzazione delle aree offuscate da viste laterali o orizzontali, rivelando nuove informazioni circa l'organizzazione dei tessuti durante lo sviluppo delle uova. Ciò ha portato a nuove intuizioni sugli eventi patterning, e proponiamo che questo metodo potrebbe essere utilizzato per esplorare ulteriori aspetti di oogenesis.
Abbiamo determinato diversi passaggi critici nel montaggio verticale di successo. Abbiamo scoperto che è necessario rimuovere le catene ovariole completamente dalla guaina durante la dissezione, e camere di uova desiderata deve essere tagliato dalla ovariole catena. La mancata camere di uova gratuite dal ovariole rende difficile prendere la camera stadio di uovo corretto (fase 4.3). Si consiglia di lavorare con piccole quantità di gelatina glicerina in un momento aliquotandolo in tubi. Non riscaldare glicerina gelatina più di due volte perché il riscaldamento ripetuto cambia la sua consistenza e ne impedisce la solidificazione correttamente (3.1). Utilizzare puntali con filtro per impedire aspirazione gelatina in pipette. Lasciare gelatina glicerina solidificare su vetrino da microscopio per almeno 8 ore a 4 ° C. Accorciare questo passaggio rende il montaggio delle camere d'uovo difficili (3.6). È importante assicurarsi assorbire tutta PBS-glicerolo dalle camere d'uovo montato (4.6). Se troppo liquido è presente, impedisce lo strato superiore di gelatina glicerina di aderire al fondo. In questo caso, le camere di uova possono galleggiare e cambiare posizione. Per ottenere i migliori risultati di imaging, glicerina blocchi gelatina deve essere tagliato il più vicino al lato anteriore camere uovo fisicamente possibile (5.4). Troppo gelatina glicerina su questolato diminuisce la qualità delle immagini a causa della maggiore distanza tra il campione e il vetrino.
Ci sono alcune avvertenze di campioni di montaggio in gelatina glicerina. Per uno, aumenta la distanza tra il campione e l'obiettivo. Questa distanza ad alto ingrandimento, in particolare durante l'utilizzo di un obiettivo di olio, può creare difficoltà a concentrarsi sul campione, che possono compromettere la qualità dell'immagine. Dato questo, è molto importante per ritagliare i blocchi gelatina glicerina molto vicino alle camere d'uovo. Anche se la gelatina glicerina è otticamente trasparente, lo fa defract po 'di luce. Un'altra limitazione è che il segnale anticorpo può essere ridotta a causa di una combinazione di distanza di lavoro dell'obiettivo e lo spessore di gelatina glicerina. Un aumento della concentrazione di primaria e / o anticorpi secondari volte può aiutare a ridurre questo problema. Anche se varia da anticorpi, di solito acquisito le immagini migliori, utilizzando il doppio della concentrazione di formica secondarioiBody nell'imaging verticale rispetto alla quantità utilizzata nell'imaging laterale standard. Sappiamo di alternative alla glicerina gelatina per il montaggio camere uovo in posizione verticale. Altri materiali come agarosio e poliacrilammide sono stati processati, ma tutta la luce defracted più severamente, causando una perdita di chiarezza durante l'imaging. Così, questa tecnica di montaggio è il meglio che è disponibile per l'utilizzo con la microscopia standard.
Mentre ci siamo concentrati sulle fasi di specificazione delle cellule di confine e l'avvio di motilità, camere di uova di diverse fasi potrebbero essere utilizzati in questo protocollo con solo un paio di piccoli cambiamenti. Soprattutto, il calibro dell'ago può essere modificata per manipolare camere uovo di diverse dimensioni e stadi di sviluppo. Per le fasi 7-10, un ago da 30 G funziona bene perché le camere di uova inseriscono facilmente nella smussatura. Per precedenti Camere stadio di uova un ago calibro maggiore (minore smussatura) è consentito e, analogamente, un calibro più piccolo (smussatura più grandi) è consentito per dopo stcamere uovo stagionati. Tutto ciò in una fase di sviluppo più anziano sarebbe troppo grande per questo calibro (4.3). Inoltre qualsiasi lato della camera di uovo può essere ripreso con questa tecnica organizzando il blocco di gelatina glicerina di camere d'uovo con l'area di interesse verso l'obiettivo.
Montaggio piccoli campioni supportati in gelatina glicerina ha il potenziale per essere utile in molteplici contesti. Questa strategia potrebbe essere utilizzato per visualizzare diversi tipi di piccole, tessuti fissati da altri organismi, in particolare quando sarebbe sufficiente per esaminare i campioni da un solo punto di vista. Una volta che questa tecnica è padroneggiata, può essere utilizzato per visualizzare le camere uovo in qualsiasi angolo desiderato, a seconda di come le camere di uova sono posizionati nella gelatina. Questo metodo consente una vista unica creando una migliore comprensione tridimensionale organizzazione cellulare. Montante immagini di camere uovo in combinazione con anticorpi immunofluorescenza permette la rilevazione precisa di proteines e cellula-cellula contatti che non sarebbe possibile in condizioni di montaggio standard. Abbiamo intenzione di utilizzare questo metodo nella mappatura delle interazioni cellula-cellula che permettono la coalescenza e il distacco del grappolo di cellule confine dalla epitelio. In questo momento, la tecnica di imaging verticale non può essere utilizzato con campioni vivi, ma stiamo anche lavorando per superare questo ostacolo. Prevediamo questo metodo si applicherà anche per studiare altri aspetti della Drosophila dell'oogenesi, o potrebbe essere adattato ad altre immagini piccole tessuti a nuovi punti di vista.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) | Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 month at 4°C. | ||
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | methanol-free to preserve GFP fluorescence |
| 30G x 1/2 inch needle | VWR | BD305106 | Regular bevel |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten female flies |
| Bovine Serum Albumin | PAA-cell culture company | A15-701 | Used in NP40 Wash Buffer |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml stock solution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Added to supplement dissection medium (10%) |
| Glass culture tube | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Glass Depression Slides | VWR | 470019-020 | 1.2 mm Thick, Double Cavity |
| Glycerin Jelly | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mounting media |
| Glycerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% in PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML | (interchangable for Nonidet P-40) Used in NP40 Wash Buffer |
| Leica Fluorescent Stereoscope | Leica Microsystems | ||
| Leica SP5 Confocal Microscope | Leica Microsystems | 40x/0.55NA dry objective | |
| Micro spatula | VWR | 82027-518 | Stainless steel |
| Microscope Slide | VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm |
| NP40 Wash Buffer | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1 mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide | ||
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Life Technologies | 10378-016 | Added to supplement dissection medium (0.6X) |
| Petridish- Polysterine, sterile | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 packs of Powder |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791-500G | Used in 0.1 M KPO4 Buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 |
With L-glutamine and sodium bicarbonate |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | Used in fluorescent antibody staining |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | Used in NP40 Wash Buffer |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7.4 |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | For processing confocal Z-stacks |
References
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