Introduction
大多数组织在体内是软的粘弹性材料具有的杨氏模量为0.1千帕为脑至100千帕软软骨，然而，大多数体外细胞研究的是组织培养聚苯乙烯（TCP）的进行，其具有〜1京帕的模量1，本刚度匹配极大地影响方式细胞所处的环境做出反应。越来越多的研究机构是这样的专用于阐明对各种细胞类型，2,3-包括干细胞。4，结果的命运衬底刚度的效果，多水凝胶已经开发了在刚性依赖的细胞的帮助理解生物学包括聚丙烯酰胺（PA），5-7聚乙二醇（PEG），8,9-二甲基硅氧烷（PDMS），10和藻酸盐。11虽然这种衬底刚度对细胞命运产生重大影响的证据正在增长，大多数研究的进行上小规模用少量第amples。在基板刚度的细胞类型或环境条件是罕见的数组效果系统，多维的研究。12
几个有前途的高通量凝胶技术已被开发出来，其中包括基于PEG的微阵列，用于生产琼脂糖凝胶微珠，14或微和纳米棒，其中刚度由微米棒的直径和高度调制13的微流体装置15不过的技术来制备这样的基体是复杂的，并提供给限于实验室的数目。许多研究涉及刚度调制细胞应答使用聚丙烯酰胺（PA）的凝胶，这是不仅便宜和简单的实现，但也显示出杨氏模量，即0.3的生理学相关范围- 300千帕16-22但是，现有的方法来制造的PA凝胶为细胞培养是劳动密集型的，因此制备ARED小批量。从该凝胶中必须准备的规定部分与PA的凝胶作为细胞底物的制备相关的困难茎：1）在不存在氧，以允许完全聚合，2）具有平坦和光滑的表面，以允许均匀的细胞附着和铺展，和3）永久地固定在细胞培养皿为了防止浮动的底部。
几个小组已尝试产生的PA的凝胶为细胞培养在大批量。塞姆勒等人制备的厚片的PA凝胶中，将其“切断”用打孔器并置于96孔板中。23然而，该方法仅限于更硬的凝胶， 即 > 1千帕在杨氏模量，因为较软的凝胶是“粘性”，难以切割，且容易损坏。 MIH 等人开发出了更复杂的技术，它允许对凝胶直接聚合在玻璃底多孔板。
本文介绍了一种简单而廉价的方式来组装PA凝胶中，可以很容易地通过任何实验室多孔板。这里，一个挠性塑料支撑被利用，其中有两个侧边 - 一个疏水性的，这是斥PA凝胶，和亲水性的，在沉积该共价结合的PA的凝胶。一旦PA凝胶片被淀积并永久地固定到柔性塑料支撑，它使得能够处理任何厚度或硬度的凝胶和切削成任何所需的形状。这APPRoach不仅产生定制的塑料“盖玻片'的尺寸不否则市售，也省却了必要的预治疗玻璃表面，无论是玻璃盖玻片或昂贵的玻璃底多孔板的孔中，具有PA的粘合溶液，这是一个繁琐和耗时的工序。最后，均匀的PA的凝胶片材可以在大批量制备并存储的去水合数月。
总之，这里介绍的测定法是一种改进的几个方面的现有的方法。首先，多孔板组装的过程中是有效的，并且所需要的材料的总成本是低的。其次，水凝胶生产大批量在一个单一的均匀的凝胶膜。最后，仅是商业上可用的材料是必需的。该测定的效用是通过探索基板刚度对细胞形态的影响，传播区域所示。
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Protocol
1.准备水凝胶有关的解决方案和等分
- 制备的聚丙烯酰胺凝胶前体溶液。
- 通过混合丙烯酰胺（A）中制备的聚丙烯酰胺凝胶前体溶液（40％w / v的，M R71.08克/摩尔），交联剂双丙烯酰胺（B）（2％w / v的，M R154.17克/摩尔），和DE-离子水在表1中规定的体积百分比。
注意：这些解决方案能在大批量制备，并储存在4℃下进行长达数月。- 注意：丙烯酰胺是在吸入或摄入有毒，特别是，当以粉末形式：因此，优选使用40％w / v的溶液，以降低毒性风险。只处理而穿着防护服，如手套，护目镜，以及白大褂。在储存在冰箱的耐光，密闭的容器中（<23°C，通风良好的地方）。
- 注意：双 - 丙烯酰胺是在吸入或摄入有毒，特别是，粉末形式时：因此，优选使用2％w / v的溶液，以降低毒性风险。只处理而穿着防护服，如手套，护目镜，以及白大褂。在储存在冰箱（<4°C，通风良好的地方）光性，密闭容器内。
- 通过混合丙烯酰胺（A）中制备的聚丙烯酰胺凝胶前体溶液（40％w / v的，M R71.08克/摩尔），交联剂双丙烯酰胺（B）（2％w / v的，M R154.17克/摩尔），和DE-离子水在表1中规定的体积百分比。
- 制备和 N -Sulfosuccinimidyl -6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基）己酸的使用量（磺基SANPAH，M R492.40克/ mol）的等分试样。注意：磺基SANPAH造成严重眼刺激;手套和适当的眼部或面部防护处理。储存于-20℃，在收到和前分装。
- 以存储磺基SANPAH：50毫克/毫升溶解磺基SANPAH在dimethylsulfoxane（DMSO）中。分装原液到每管20微升50微离心管中。在干冰上，或在液氮中闪冻（任选的但优选的步骤，以保持最大效率交联剂），并存储在-80℃。
注：CA等分N为存放数个月。 - 使用磺基SANPAH：解冻的等分试样简要和稀释在480微升去离子水。立即使用。磺SANPAH迅速水解水：所以采取谨慎快速执行上述所有步骤。
- 以存储磺基SANPAH：50毫克/毫升溶解磺基SANPAH在dimethylsulfoxane（DMSO）中。分装原液到每管20微升50微离心管中。在干冰上，或在液氮中闪冻（任选的但优选的步骤，以保持最大效率交联剂），并存储在-80℃。
- 准备过硫酸铵（Mr为228.18克/摩尔）等分。
注意：过硫酸铵引起眼睛，皮肤和呼吸系统有刺激性。处理时，佩戴合适的个人防护装备。处理过硫酸铵粉末在化学通风橱中。粉储存在干燥，通风良好的地方。一旦分装，稀溶液可用于在工作台上。- 溶解过硫酸铵在去离子水以达到最终的过硫酸铵浓度为10％w / v的。分装和储存在-20℃。解冻使用前立即。
- 制备胶原蛋白I型的解决方案。
- 制备0.2mg / ml的胶原溶液稀释储备所以lution在pH为7.4的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。储存在冰短暂或稀释后立即使用。
2.水凝胶的制备（参见图1）
- 制备的疏水载玻片上。
- 放置几滴疏水溶液在玻璃板上，并用纸巾在表面上传播。让空气干燥，并再次用纸巾擦拭纸拉平疏水涂层。
注：易燃内阁在室温储存疏水性的解决方案。处理时佩戴个人防护装备。在通风良好的地方工作。
- 放置几滴疏水溶液在玻璃板上，并用纸巾在表面上传播。让空气干燥，并再次用纸巾擦拭纸拉平疏水涂层。
- 制备的柔性塑料支撑。
- 切割柔性塑料支撑以匹配疏水涂覆玻璃板的尺寸。
- 通过轻轻搔抓用尖锐的工具的表面上，如手术刀马克挠性塑料支撑的疏水侧。
注意：一旦凝胶 - 这是完全透明的 - 烘的划痕将有助于区分哪些灵活的塑料支撑侧含有凝胶。
注：柔性塑料支撑具有疏水和亲水侧。一旦沉积，聚丙烯酰胺永久坚持的塑料支撑这有利于方便后续处理水凝胶的亲水性的一面。
- 凝胶法制备（例如卷，给出了5毫升凝胶前体解决方案）。
注：5毫升将足以产生〜40的凝胶时的凝胶的初始厚度为0.5毫米。更多的凝胶可以生产如果凝胶厚度减小。- 放置4972.5微升期望的最终浓度（ 表1）的聚丙烯酰胺的前体溶液到50毫升锥形管中。放置在脱气室30分钟以打开盖子。
注：氧气用作自由基捕集和当存在时，其抑制聚合。 - 添加25微升10％w / v的过硫酸铵（参照点1.3）以达到最终的0.05％过硫酸铵浓度。
- 加入2.5微升的N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED，M R116.24克/摩尔）于脱气的凝胶溶液以达到0.5％的最终TEMED浓度。
注：储存TEMED在易燃内阁在室温。穿着适当的个人防护设备时，处理化学通风柜。保持在惰性气体密闭的，因为它是高度空气和水分敏感。 - 5倍 - 吹打向上和向下轻轻3混合的解决方案。不要旋涡振荡，以避免氧扩散到凝胶前体溶液。
- 吸管将凝胶溶液涂布在柔性塑料支撑和三明治用疏水涂层玻璃载片的亲水侧。具有所需厚度（ 例如，0.5mm）的硅隔板分开的两个幻灯片。离开的聚合物前体溶液少量（约100微升）在50毫升锥形管作为凝胶化的指标来使用。
注意：任何间隔可被使用。例如，封口膜的单个条给出了100的最终的溶胀凝胶的厚度 - 120微米。 - 将另一玻璃板上盖的弹性塑料支撑/凝胶三明治聚合后确定的，即使水凝胶表面。
- 让凝胶聚合45分钟，尽管更少的时间，可用于较高的％（重量）的凝胶，如果需要的。以确定该凝胶已聚合，观察在50ml锥形管中的剩余溶液;如果剩余的溶液已凝胶化，则很可能该凝胶在玻璃板已被启动以及。但是请注意，模具过早开放将防止完全聚合。
- 一旦凝胶形成，剥离的柔性塑料支撑在顶部具有共价附着的聚丙烯酰胺凝胶，并设置凝胶朝上风干。
注：对流或热干燥，也可用于加速此步骤。一旦干燥到柔性塑料支撑，该凝胶可以是存储无限期ð。- 纪念弹性塑料的支持，其中聚丙烯酰胺凝胶并没有因为泡沫形成的裸露的斑点。标记而凝胶仍水合，因为这将融合在一起的柔性塑料支撑一旦凝胶干燥。
- 放置4972.5微升期望的最终浓度（ 表1）的聚丙烯酰胺的前体溶液到50毫升锥形管中。放置在脱气室30分钟以打开盖子。
3.多孔板组装，胶原蛋白涂层和灭菌
- 多孔板组件。
- 一旦干燥，切成PA凝胶成所需的形状。
- 对于一个96孔板中，使用重型打孔器，直径为〜6mm之间。使用重型切纸机切断的凝胶成正方形或矩形形状。或者，用剪刀。
- 根据制造商的说明每96孔板制备约500微升的PDMS。胶水凝胶到多孔板的底部，放置一个小墨滴（〜5微升）聚二甲基硅氧烷（PDMS）中的的中央各孔中。使用镊子，将一个聚丙烯酰胺ë凝胶在各孔中，柔性塑料支撑面朝下。为了让PDMS治愈，留下的组装板在37℃最少4小时的。
- 一旦干燥，切成PA凝胶成所需的形状。
- 聚丙烯酰胺凝胶的胶原蛋白涂层。
- 用移液管，将少量 - 磺基 - SANPAH（7 8微升）（参照点1.2.2）的各孔中，涡流从一侧到另一侧涂覆凝胶表面均匀。工作迅速自磺基SANPAH并不稳定在水中。
- 放置孔板下高强度UV灯（强度= 37毫瓦，λ= 302 - 365 nm）的5分钟。冲洗用PBS凝胶以除去过量的磺基 - SANPAH。
- 吸管将50μl0.2mg / ml的I型胶原溶液（参照点1.4）到每个孔中。留在4℃下覆盖在RT至少2小时或O / N的板。
注意：为了加快胶原涂层的过程中，移液管可用于添加胶原溶液。通常情况下，1 - 2液滴的溶液应该是足以完成LY覆盖凝胶表面。 - 离开孔板在RT至少2小时，以允许胶原粘接。
- 用PBS冲洗以除去过量的胶原蛋白溶液和UV（λ= 200纳米）下消毒的组织培养罩2小时。
- 泡在完全培养基（参见4.1节的培养基成分）O / N来滋润和平衡的凝胶。用于小区在冰箱立即或商店播种长达2天。
在PA刚度试验4.细胞种植
注意：虽然典型的常见的哺乳动物细胞系，在这个部分中所概述的协议进行具体的乳腺癌MDA-MB-231细胞系中使用（ 见图4和5）。
- 通过暴露收集从组织培养烧瓶中的细胞，以5％的胰蛋白酶/ EDTA进行5分钟，在37℃。使用〜80微升胰蛋白酶/ EDTA的每培养瓶中区的每厘米2;例如，使用2个ml胰蛋白酶/ EDTA的FORA T25细胞培养瓶中。重悬浮收集的细胞中，在所期望的最终细胞浓度补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素的完全培养基。考虑到细胞倍增时间，以及时间的细胞将被接种上测定的长度，选择适当的子汇合细胞浓度。确保补充介质是足以完全浸没水凝胶。
注意：由于该水凝胶已预平衡的培养基（参见步骤3.2.6）加入100μl体积应该是足够的。用于多孔板的典型介质体积应足以自凝胶已预平衡的培养基在上一步。
注：该测定是适当的任何附着依赖性细胞类型。- 通过使用血细胞计数器计数倒置显微镜下的细胞数。负载10微升细胞悬液到每个血球端口和至少8个象限平均细胞计数。为了得到最终的细胞浓度，以10 4乘以细胞计数。
注：当在每个血球细胞象限数为20的最佳细胞计数结果获得 - 50。
- 通过使用血细胞计数器计数倒置显微镜下的细胞数。负载10微升细胞悬液到每个血球端口和至少8个象限平均细胞计数。为了得到最终的细胞浓度，以10 4乘以细胞计数。
- 培养在37℃下将细胞到PA的刚度测定的加湿培养箱和5％的CO 2。更换介质每2 - 3天。 5分钟需要通过暴露于5％胰蛋白酶/ EDTA，在37℃时收集细胞。使用〜80微升胰蛋白酶/ EDTA的每组织培养瓶的厘米2。在所有电池操作的步骤，特别注意不要破坏凝胶面：吸或吸液管中通过略微倾斜的多孔板侧身触摸枪头到侧壁各井，而不是触摸水凝胶。
注：除采取特别小心不要损坏在标准的组织培养处理的水凝胶表面，将细胞接种到刚性测定法可以被操纵以同样的方式，就好像它们接种在到正规的多孔板。
5.成像细胞接种于PA刚度分析
- 图像细胞直接作用于PA刚度检测。
注意：任何显微镜 - 倒置，荧光，或共焦，可用于细胞成像。
注意：用于构造刚度试验的软塑料的支持是完全透明的，不autofluoresce或干扰细胞成像。然而，即使在柔性塑料支撑本身是透明的，成像能力将通过物镜的工作距离的限制。柔性塑料支撑体的厚度为0.23毫米，10X物镜的一个典型的工作距离是〜4毫米，大幅降低为较高倍率。- 活细胞成像，在显微镜板夹和图像位置PA刚度检测。保持成像会议下2小时，或使用配有环境室长成像倍的显微镜。
- 当活细胞IM老化是不是目的，固定的细胞在4％的甲醛溶液补充有0.1％的清洁剂。浸泡细胞固定液在室温下最少2小时的。用PBS冲洗两次。丢弃固定液浪费在指定的废物容器。
注：细胞可以立即被成像或存储浸没在PBS中，在4℃下进行最多2周。注意：甲醛是对吸入和接触有毒。处理与化学通风柜手套。
注：细胞固定协议具有基于所述随后的细胞染色和处理协议被选择，因为某些固定剂损坏某些细胞蛋白。 - 对于荧光成像，染色固定的细胞具有所需的细胞在多孔板直接染色。图像立即。
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Representative Results
聚丙烯酰胺（PA）的水凝胶被广泛用来测试刚性依赖性细胞反应。17,24通过混合不同浓度的丙烯酰胺（A）和双-丙烯酰胺（B），可以使跨越大部分软组织中的刚度范围PA的凝胶主体- 0.3 - 300千帕的杨氏模量1但是，制备的聚丙烯酰胺凝胶的是乏味和耗时的，常常限制了其在“高通量”的应用，例如药物筛选效用12在这里，为简单而快速的方法组装的PA凝胶在多井板或任何其它期望的组织培养容器中呈现（ 图1）。图2A示出的杨氏模量为几A和B的浓度的函数（也总结在表1）。额外的A和B的组合的模量在文献中报道。17,25,26充分swolle的凝胶硬度10赫兹和2％恒应变 - N凝胶是通过流变学（AR 2000EX流变仪，TA仪器）以20mm的上部平行几何，振荡频率扫描试验1测得的。如预期的，证明这两个贮能模量，G'和损耗模量G“，是独立的频率（ 图2B）的。它也证实，干燥，然后重新水化凝胶，并不影响它们的杨氏模量（ 图2C）。杨氏模量与储能模量由下式： 
其中，E是杨氏模量，v为泊松比将其近似为0.5用于PA凝胶。27。注意，所报告的值是用于制备具有TEMED水凝胶。 PA的水凝胶也可以通过UV交联制备时的曝光时间和UV强度进行了优化（
此外，还表明，细胞接种在不同stiffne的水凝胶SS表现出不同的形态。对于本实验，乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于PA的凝胶的顶部24 - 72小时。细胞在37℃和5％CO 2的补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的加湿培养箱RPMI培养基中培养。细胞以1×10 5个细胞/ ml或1×10 4个细胞/孔的96孔板。这是一个典型的细胞接种密度- 4倍比汇合的细胞密度，在那里达到在约1×10 5个细胞/ cm 2汇合为哺乳动物细胞系低。图像通过形状描述和区域软件插件采取倒置荧光显微镜分析了ImageJ的。据观察，24小时接种在PA凝胶时，乳腺癌MDA-MB-231细胞维持轮上的软0.5和1帕的凝胶，但能够分散和细长的刚性为100kPa凝胶（ 图4）。图4还showcasES的事实，即在挠性塑料支撑的顶部制成的水凝胶是透明的，并允许容易的可视化和显微镜。此外，该柔性塑料支持不autofluoresce并且因此不与荧光标记的细胞的成像干涉。细胞形态进一步量化整体细胞的扩散面积和细胞形状因子术语-圆度（ 图5）。细胞扩散区是通过创建一个掩模来跟踪每个小区的周边测量。细胞形状（圆度），然后，从下列关系式计算： 
圆形度的标度0 - 1，其中0.6 - 1被带到指定圆形细胞和0 - 0.5被带到指定细长细胞。大约来自至少三次独立实验的三百细胞为每个数据POIN分析吨。分别计算出的统计差异基于单因素方差分析（ANOVA），其中的数据集被认为是显著不同当 p <0.05。
图柔性塑料支撑聚丙烯酰胺凝胶的制备1.示意图。这个数字代表参与了PA凝胶的柔性塑料支撑准备的各个步骤。后的凝胶完全干燥，它可以被切割或冲压成任何期望的形状。对于一个96孔板制备凝胶时一整个冲头（〜直径6毫米）是最方便的，而一个重型切纸机可以用于正方形或长方形的形状。该图还突出的孔的边缘，有和没有凝胶，证明完成井底部覆盖率可以用这种方法来实现。 OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
由流变测量图2刚度PA的水凝胶。 （A）的代表性的杨氏模量为五个不同的A，B的浓度（参照表1缩写词），（B），为通过流变学测量的存储和损耗模量作为频率的函数;（C）的凝胶表现出相同的杨氏模量在最初时（初始）并且它们已被干燥并再水合后（再水合）独立的聚合物前体浓度的。所有凝胶的流变测量准备20毫米直径和1砖 - 1.5毫米的高度（后完全消肿）。
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在PA凝胶图3.胶原涂层的胶原涂层（绿色）被有效地分布和保留到PA的凝胶（红色）表面独立的水凝胶硬度杨氏模量）。胶原用Cy5标记用于此的数据。红色荧光珠粒嵌入到PA的水凝胶，以辅助可视化。横截面图像拍摄在共聚焦显微镜（比例尺= 100微米）。 图片改编自Zustiak等。人5 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.合同期（上排）和荧光（下排）图像MDA-MB-231细胞接种于PA凝胶24小时的。MDA-MB-231细胞保持圆形软凝胶（年轻 7; 0.5和1帕弹性模量），但伸长上僵硬的PA凝胶（杨氏模量为100kPa的）。将细胞接种在凝胶24小时，固定于乙醇并用吖啶橙（AO - 绿色）以可视化的细胞的细胞质和DAPI（蓝色）来可视化细胞核;比例尺= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.细胞铺展面积和圆形度受下面的基底的硬度。 （一）的MDA-MB-231细胞扩散区域上的100千帕，而不是在0.5千帕的凝胶显著增加。（b）与增加的PA凝胶刚度细胞圆形减小。星号指定显著差异，P <0.05。
图6.在柔性塑料支撑的替代的聚丙烯酰胺凝胶制备的图示。该图表示涉及的PA凝胶的柔性塑料支撑在制备的各个步骤。这里的柔性塑料支撑最初预先切成所希望的形状和大小的塑料“盖玻片”。这种技术最适合柔和的水凝胶。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 缩写 | 丙烯酰胺％ | 双丙烯酰胺％ | 丙烯酰胺为40％储备溶液（毫升） | 双丙烯酰胺，由2％原液（毫升） | 水（毫升） | G'±SD（千帕） | ˱SD（千帕） |
| PA1 | 五 | 0.025 | 625 | 62.5 | 4312.5 | 0.62±0.19 | 1.85±0.57 |
| PA2 | 五 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55±0.12 | 10.64±0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1000 | 250 | 3750 | 9.71±0.64 | 29.14±1.93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1000 | 625 | 3375 | 22.00±2.10 | 66.01±6.31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1，500 | 625 | 2875 | 37.42±2.68 | 112.25±8.03 |
表1丙烯酰胺的浓度（A）和交联剂双-丙烯酰胺（B）和所得到的PA的凝胶硬度。刚度 ，这里由G'和E表示，用流变学测定。 G'是储能模量在1赫兹的频率。杨氏模量，E是从公式算出。 1.标准偏差（SD）的基础上，每个实验测定样品3-5三个独立的实验计算。表中的缩写词对应于图2A中使用的首字母缩写。
| 紫外线强度为15毫瓦/ 平方厘米 | 曝光时间= 300秒 | ||
| 时间（s） | E（千帕）±SD | 在张力（毫瓦/厘米2） | E（千帕）±SD |
| 75 | 0.14±0.03 | 15 | 28.05±2.62 |
| 100 | 6.98±2.34 | 26 | 21.13±3.01 |
| 125 | 19.11±2.29 | 37 | 20.01±2.38 |
| 300 | 28.05±2.62 | 66 | 19.35±2.86 |
表2紫外线聚合是另一种与用于PA凝胶制备方法更快时凝胶化的条件进行了优化; PA3（参照表1）凝胶中描绘。表总结了所得的杨氏模量时，无论曝光时间（左两列）或UV强度（右两列）是多种多样的相同溶液中。根据从表中的结果，似乎300秒的曝光时间和15毫瓦/厘米2的紫外线强度，得到最高的PA凝胶刚度，这与传统的聚合凝胶的硬度为列于表1。
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Discussion
聚丙烯酰胺凝胶，最初开发用于电泳28现在常规用作细胞培养基材来研究衬底刚度对细胞形态，运动性，并且除其他细胞特征的通信3,24,29的影响。聚丙烯酰胺允许操纵衬底刚度以包含在身体的所有软组织的刚度（0.3 - 300千帕）1，在聚合物前体浓度的简单改变（ 图2，表1中 ，也见参考文献17,25,26）。耦合到一个事实，即PA的凝胶是相当便宜和简单的制备，它们已经成为在刚度依赖性细胞材料的相互作用的研究中不可缺少的平台上。但是，即使简单，目前的技术制备的PA凝胶被限制为小批量。这限制从水凝胶的凝胶化的性质，它是由过硫酸铵催化的自由基聚合干和TEMED 30由于反应是自由基链聚合，可以通过在作为自由基阱，如氧的任何元素抑制。因此，由于氧扩散到聚合物溶液具有在聚合期间要避免的 - 这可能需要多达45分钟为最软的凝胶 - 只需吹打PA的凝胶成一种开放的多孔板是不可行的。另外，被用作一个二维（2D）细胞基质，PA的凝胶的表面应是平坦的。上述两种要求规定，以产生PA的凝胶作为2D电池基板，PA凝胶前体溶液要两个平面之间的聚合反应过程中夹持 - 以抑制氧扩散和扁平的凝胶表面。此外，该上表面具有以使得其可以很容易地从凝胶暴露表面为细胞附着剥离。这通常是通过在玻璃表面的疏水性涂层来实现。最后，当定位成第多孔板电子阱，PA的凝胶应覆盖整个孔表面和从浮动限制。完整以及底表面覆盖是在应用中尤其重要，其中用于评估细胞的测定法是，考虑到在井（ 例如，MTT）的全细胞群的类型。当PA凝胶不充分覆盖整个井表面，必须小心，以阻断细胞粘附到暴露的孔表面随着细胞可以很容易地滚下凝胶到玻璃或塑料制成。如果需要的话，BSA阻断以下标准协议或使用现成的货架BSA基细胞粘着阻断试剂盒应足以阻止细胞附着到板孔的底部。例如，以制备BSA的覆盖表面，0.5mg / ml的溶液的BSA在PBS，pH 7.4中应该被吸附到组织培养皿20分钟，在室温，用PBS漂洗，并立即使用或储存于4℃下长达2周。 BSA的已显示阻断细胞粘着ö通过大大减少细胞粘附力亲水和疏水聚苯乙烯表面相对于F哺乳动物细胞培养物如通过原子力显微镜测定的。31 BSA的已被用于常规阻断哺乳动物细胞的粘附，以及建立细胞图案化表面。32,33
在这篇文章中所描述的技术中，满足所有上述要求，允许大量生产定制尺寸和形状的均匀的PA的凝胶。该技术是更简单和更有效的比夹着两个玻璃盖玻片之间的PA凝胶前体溶液的当前标准。此外，它不需要任何复杂的设备，因而是易于采用任何研究实验室。它也更具有成本效益，因为它不需要使用玻璃板或玻璃盖玻片，它们不仅昂贵，而且也来在有限的尺寸。该技术也更快有几个原因。首先，它不涉及任何预处理步骤典型的玻璃表面由于挠性塑料支撑设计有两个不同的表面 - 的亲水性侧永久附着于聚丙烯酰胺和疏水侧，可以形成凝胶后容易剥离。第二，因为塑料载体是柔性的，它更容易和更快地剥离所形成的凝胶：当薄凝胶2载玻片之间形成，剥离顶端疏水滑动是困难的，经常导致破损也损害了凝胶。最后，由于在柔性塑料支撑的透明性，更快的紫外线聚合，可以采用相对于标准TEMED系聚合这可能需要多达45分钟（ 表2）。表2中的数据表明，当聚合时间和UV光强度进行优化类似的刚度可由两个TEMED和紫外线聚合的方法来实现。
水凝胶的制备柔性PL如所描绘的图1。建议来执行在脱气腔室中的凝胶化，以避免凝胶边缘（ 即，边缘效应），由于在两个表面夹着所述聚合物溶液之间的氧扩散不完全聚合ASTIC支持。的目标是创建在挠性塑料支撑的顶部的大的水凝胶薄膜，因而，任何尺寸的玻璃板将是适当的，但它会支配聚丙烯酰胺膜的可实现的尺寸。该玻璃可以涂覆有任何疏水性涂层或可替代地，可以使用柔性塑料支撑的疏水侧代替。一旦在PA凝胶膜形成，将其干燥，切割成所需的形状，然后再水合之前的使用。干燥时，将凝胶可以无限期地保存。它是通过流变学证实，PA的凝胶硬度是在即使当凝胶被存储在干燥状态下几个月（ 图2C）补液不变。然而，对于非常SOF吨胶（≤1千帕斯卡在杨氏模量）的干燥和再水化加剧表面折皱和裂缝的形成。此行为是很常见的是经受脱水合和随后的再水合，同时被几何限定软凝胶。34,35并非所有的凝胶折痕或裂纹，因此，它是可以在视觉上检查水凝胶在使用前，仅使用样品即显示一个平滑的表面。完全避免折痕的形成和破裂，另一种方法来制备软凝胶中描绘于图6中 。在这里，所述柔性塑料载体是预切割的所需形状和PA的凝胶形成在顶部，由此，凝胶不需要被去水合但可用作制备。这种替代的策略的一个额外的好处是，〜2.5更凝胶可从水凝胶前体溶液（所述估计是基于在协议部分中所述制备的凝胶为标准的96孔板）相同的体积来制造。一个谨慎的时候以这种方式制备的水凝胶是照顾，以避免氧气的渗透，特别是对于较小尺寸（ 例如，在96孔板中使用凝胶）的凝胶。即使当凝胶前体溶液完全脱气， 即无氧，氧气将在两个表面夹着PA解决方案之间的扩散。因此，为了避免边缘效应或不完整的凝胶形成沿边缘，这是最好的，以允许聚合发生在缺氧的情况下。根据我们的经验，真空室效果很好，即使惰性气体环境中，可以以同样的成功使用。
最后一个警告时制备的PA水凝胶作为细胞底物进行测试刚度依赖性细胞反应，是将得到的水凝胶的厚度是很重要的：对于非常薄的凝胶，所述细胞能够感测所述下层基板36使用的理论和实验，。 Lin 等人表明，深度在哪些细胞可以FE埃尔下层衬底是依赖于单元的横向尺寸。29由于目前的研究是矛盾的，识别的最小所需厚度，以防止细胞从感测的“隐藏”基底是从几微米36至多达60微米， 100微米37的最小厚度凝胶应着眼的。
当组装的PA凝胶成多孔板，小液滴的PDMS用于固定凝胶到井的底部。 PDMS是因为它在硬化充当永久性胶，它是完全透明的，并且不与随后的显微镜实验干扰，这是完全无细胞毒性，并且其固化在约4 - 8小时留下足够的时间进行板组装。安全地固定水凝胶的良好辅助细胞处理的底部：例如，大力清洗可以去除水凝胶如果没有坐稳。如果频繁地改变小区mEDIA不是问题，则该凝胶可被暂时固定到井表面由小液滴的非细胞毒性和高粘性液体，例如甘油。
细胞接种前的最后步骤包括凝胶，然后杀菌ECM涂层。这里I型胶原涂层被描述（ 图3），即使在相同的技术可以应用于任何其他ECM蛋白。该双官能交联剂磺基SANPAH被利用来获得均匀的单层涂层。以前的研究已经证明，这样的共价连接产生了更均匀的涂层比简单的蛋白质吸附，并且还允许对蛋白质的附着通过简单地使用不同浓度的蛋白质溶液的量的12倍的调谐6最后，组装的多孔凝胶板紫外线下的组织培养罩灭菌长达2小时。紫外线杀菌允许用于测定待组装在实验室工作台罩，外其使得该方法更简单后勤和整体更快。
图4和5示出了从MDA-MB-231乳腺癌细胞上不同的刚度的柔性塑料支持附加的PA凝胶培养的一些有代表性的结果。 MDA-MB-231被选择的细胞，以证明该方法实用，因为它们已被证明由可测量的变化作出反应，所述下层基板的刚度在其形态。5,12正如预期的，细胞更细长，有一个更大的铺展面积上相比于软0.5和1帕的PA凝胶坚硬100千帕的PA凝胶（ 图4和5）。关于图4中的最下面一行也显示了使用该染色的细胞核和细胞质两种荧光染料，展示了一个事实，即有弹性的塑料支持不与荧光显微镜成像干涉。
总之，一个简单的方法，制备的聚丙烯酰胺凝胶多孔板形式呈现。该技术是更快，更有效，并且比现有方法制备的PA凝胶成本较低，用作细胞底物以及可定制的凝胶的制备尺寸没有另外提供。因为它不要求任何特殊的设备，该方法可以很容易地通过任何研究实验室和将是研究集中在理解刚度依赖性细胞反应特别有用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
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