Introduction
La maggior parte dei tessuti del corpo sono materiali viscoelastici morbidi con un modulo di Young che vanno da 0,1 kPa per cervello a 100 kPa per cartilagine morbida, ma, più in ricerca sulle cellule vitro è condotta su coltura tissutale polistirene (TCP), che ha un modulo di ~ 1 GPa . 1 Questa mancata corrispondenza rigidità influenza notevolmente il modo in cui le cellule rispondono al loro ambiente. Un crescente corpo di ricerca è quindi dedicata alla chiarire l'effetto del substrato rigidità sul destino di vari tipi cellulari, comprese le cellule staminali 2,3. 4 Come risultato, più idrogel sono stati sviluppati per aiutare nella comprensione della cella rigidità-dipendente biologia compresi poliacrilammide (PA), 5-7 polietilene glicole (PEG), 8,9 polidimetilsilossano (PDMS), 10 e alginato. 11 Mentre la prova che substrato rigidità ha un impatto sostanziale sul destino delle cellule è in crescita, la maggior parte degli studi sono condotti su scala ridotta con un piccolo numero di samples. Sistematiche, studi multidimensionali sull'effetto di substrato rigidità per una serie di tipi cellulari o condizioni ambientali sono rare. 12
Sono state sviluppate diverse tecnologie idrogel high-throughput promettenti, tra cui microarrays basati PEG, 13 dispositivi microfluidici per la produzione di microsfere di agarosio idrogel, 14 o micro e nano-aste in cui la rigidità è modulata dal diametro e altezza delle microrods. 15 Tuttavia , le tecnologie per preparare questi substrati sono sofisticati e disponibili per il numero limitato di laboratori. Gran parte della ricerca che coinvolge rigidità modulato le risposte delle cellule utilizza poliacrilammide (PA) gel che non sono solo poco costoso e semplice da implementare, ma mostrano anche una gamma fisiologicamente rilevanti di modulo di Young, vale a dire 0,3 -. 300 kPa 16-22 Tuttavia, i metodi esistenti per fabbricare PA gel per colture cellulari molto lavoro e, conseguentemente, di preparazioneared in piccoli lotti. Alcune delle difficoltà associate alla preparazione di gel PA come substrati cellulari derivano dal requisito che i gel devono essere preparati: 1) in assenza di ossigeno per permettere la completa polimerizzazione, 2) con una superficie piana e liscia per consentire cellulare uniforme attaccamento e diffusione, e 3) fissata in modo al fondo del piatto di coltura cellulare per prevenire galleggiante.
Diversi gruppi hanno tentato di produrre gel PA per colture cellulari in grandi lotti. Semler et al. Fogli spessi preparati dei gel PA che erano poi "tagliata" con un perforatore e posizionati in piastre da 96 pozzetti. 23 Tuttavia, questo metodo è limitato a gel rigide, cioè,> 1 kPa nel modulo di Young, perchè più morbido gel sono "sticky", difficile da tagliare, e facilmente danneggiati. Mih et al. Sviluppato una tecnica più sofisticata che permette i gel da polimerizzare direttamente in una piastra multipozzetto fondo di vetro.
Questo documento descrive un modo semplice e poco costoso da montare gel PA in una piastra multipozzetto che potrebbe facilmente essere adottata da qualsiasi laboratorio. Qui, un supporto plastico flessibile è utilizzato, che ha due lati - uno idrofoba, che è repellente per gel PA, e uno idrofila, che si lega covalentemente il gel PA sulla deposizione. Una volta fogli di gel PA vengono depositati e permanentemente affissa al supporto plastico flessibile, consente la movimentazione gel di qualsiasi spessore o rigidità e taglio in qualsiasi forma desiderata. Questo approach non solo produce custom 'vetrini' di plastica in formati non altrimenti disponibili in commercio, ma evita anche la necessità di pre-trattare le superfici di vetro, sia vetrini o pozzetti di costose lastre di pozzetti con fondo di vetro, con una soluzione PA vincolante, che è un noioso e un passo che richiede tempo. Infine, uniformi fogli gel PA possono essere preparati in grandi lotti e de-idratato conservati per alcuni mesi.
In sintesi, il saggio qui presentato è un miglioramento rispetto ai metodi esistenti in diversi aspetti. In primo luogo, il processo di assemblaggio piastra multipozzetto è efficiente, e il costo complessivo dei materiali necessari è basso. In secondo luogo, gli idrogel sono prodotte in grandi lotti in un unico film gel omogeneo. Infine, solo materiali che sono commercialmente disponibili sono richiesti. L'utilità del saggio è illustrato esplorare l'effetto di substrato rigidità sulla morfologia cellulare e zona diffusione.
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Protocol
1. Preparazione di soluzioni e Aliquote Hydrogel associati
- Preparazione della soluzione poliacrilammide gel precursore.
- Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1.
NOTA: Queste soluzioni possono essere preparati in grandi lotti e conservati a 4 ° C fino a diversi mesi.- ATTENZIONE: L'acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare, se in polvere: così, utilizzare preferibilmente il 40% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (<23 ° C, e ben ventilato).
- ATTENZIONE: Bis-acrilamide è tossica su inalazione o ingestione, in particolare,quando in polvere: così, utilizzare preferibilmente 2% w / v soluzione per ridurre i rischi di tossicità. Maneggiare solo mentre indossa indumenti protettivi, come guanti, occhiali, e un camice da laboratorio. Conservare in un contenitore resistente alla luce, ben chiuso in frigorifero (<4 ° C, e ben ventilato).
- Preparare soluzione di gel di poliacrilammide precursore miscelando acrilammide (A) (40% w / v, M r 71.08 g / mol), la bisacrylamide reticolante (B) (2% w / v, M r 154.17 g / mol), e de- acqua ionizzata nelle percentuali di volume specificati nella tabella 1.
- Preparazione e utilizzo di N -Sulfosuccinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) esanoato (Sulfo-SANPAH, M r 492,40 g / mol) aliquote. ATTENZIONE: Sulfo-SANPAH provoca grave irritazione oculare; maneggiare con i guanti e la corretta protezione degli occhi o il viso. Conservare a -20 ° C alla ricezione e prima in aliquote.
- Per memorizzare sulfo-SANPAH: sciogliere Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Aliquota della soluzione di riserva in 50 provette micro da 20 ml per provetta. Freeze Flash in ghiaccio secco o in azoto liquido (un passaggio facoltativo, ma preferito per preservare la massima efficienza reticolante) e conservare a -80 ° C.
NOTA: Le aliquote can essere conservati per alcuni mesi. - Per utilizzare solfo-SANPAH: scongelare brevemente un'aliquota e diluire in 480 ml di acqua deionizzata. Utilizzare immediatamente. Sulfo-SANPAH idrolizza rapidamente in acqua: quindi prendere cautela per eseguire tutti i passaggi sopra in fretta.
- Per memorizzare sulfo-SANPAH: sciogliere Sulfo-SANPAH in dimethylsulfoxane (DMSO) a 50 mg / ml. Aliquota della soluzione di riserva in 50 provette micro da 20 ml per provetta. Freeze Flash in ghiaccio secco o in azoto liquido (un passaggio facoltativo, ma preferito per preservare la massima efficienza reticolante) e conservare a -80 ° C.
- Preparazione di persolfato di ammonio (M r 228,18 g / mol) aliquote.
NOTA: persolfato di ammonio provoca occhi, irritazione della pelle e delle vie respiratorie. Indossare dispositivi di protezione adeguati durante la manipolazione. Maneggiare persolfato di ammonio in polvere in una cappa. Conservare la polvere in un luogo asciutto e ben ventilato. Una volta aliquotati, la soluzione diluita può essere utilizzato sul banco di lavoro.- Sciogliere persolfato di ammonio in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale persolfato di ammonio del 10% w / v. Aliquota e conservare a -20 ° C. Scongelare immediatamente prima dell'uso.
- Preparazione della soluzione di collagene di tipo I.
- Preparare 0,2 mg / ml soluzione di collagene diluendo il magazzino in modoluzione in 1x tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4. Conservare brevemente ghiaccio o utilizzare immediatamente dopo la diluizione.
2. Idrogel Preparazione (fare riferimento alla figura 1)
- Preparazione di vetrini idrofobici.
- Mettere alcune gocce di una soluzione idrofobico su una lastra di vetro e utilizzare carta velina per diffondere attraverso la superficie. Lasciate asciugare e pulire con un fazzolettino di carta di nuovo per uniformare il rivestimento idrofobo.
NOTA: soluzione idrofobico Conservare in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Indossare indumenti protettivi durante la manipolazione. Lavorare in un ambiente ben ventilato.
- Mettere alcune gocce di una soluzione idrofobico su una lastra di vetro e utilizzare carta velina per diffondere attraverso la superficie. Lasciate asciugare e pulire con un fazzolettino di carta di nuovo per uniformare il rivestimento idrofobo.
- Preparazione del supporto plastico flessibile.
- Tagliare il supporto di plastica flessibile per adattarsi alle dimensioni della lastra di vetro idrorepellente rivestita.
- Contrassegnare lato idrofoba del supporto plastico flessibile leggermente graffiare la superficie con un attrezzo appuntito come un bisturi.
NOTA: Una volta che il gel - che è completamente trasparente - asciuga, I graffi aiuteranno a distinguere da che parte il supporto di plastica flessibile contiene il gel.
NOTA: Il supporto di plastica flessibile ha un idrofobico e un lato idrofila. Una volta depositato, poliacrilammide aderisce in modo permanente al lato idrofila del supporto plastico che facilita la successiva manipolazione idrogel.
- Gel Preparazione (esempio volumi sono indicati per soluzioni gel precursori 5 ml).
NOTA: 5 ml sarebbero sufficienti a produrre ~ 40 gel quando lo spessore iniziale gel è di 0,5 mm. Più gel possono essere prodotti se lo spessore gel viene ridotta.- Inserire 4972,5 ml di soluzione di precursore di poliacrilammide concentrazione finale desiderata (Tabella 1) in una provetta conica da 50 ml. Mettere in una camera di degasaggio per 30 minuti con il tappo aperto.
NOTA: ossigeno agisce come una trappola radicali liberi e, quando presente, inibisce la polimerizzazione. - Aggiungere 25 ml di 10% w / v di ammonio persolfato (vedi punto 1.3) per ottenere una finaleammonio persolfato concentrazione dello 0,05%.
- Aggiungere 2,5 ml di N, N, N ', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED, M r 116.24 g / mol) alla soluzione di gel degasato per ottenere una concentrazione finale di 0,5 TEMED%.
NOTA: Conservare TEMED in un armadio infiammabile a temperatura ambiente. Maneggiare in una cappa indossando i dispositivi di protezione adeguati. Tenere ben chiuso sotto gas inerte, come è altamente dell'aria e sensibile all'umidità. - Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù 3 - 5 volte. Non vortice per evitare la diffusione di ossigeno nella soluzione di gel precursore.
- Pipettare la soluzione di gel sul lato idrofila del supporto plastico flessibile e panino con idrofobico rivestita vetrino. Separate le due slitte con distanziali silicone di spessore desiderato (ad esempio 0,5 mm). Lasciare una piccola quantità (~ 100 ml) di soluzione di precursore di polimero nella provetta conica da 50 ml di utilizzare come indicatore di gelificazione.
NOTA:Qualsiasi spacer potrebbe essere utilizzato. Per esempio, una singola striscia di Parafilm dà spessore gonfio gel finale di 100 - 120 micron. - Posizionare un altro lastra di vetro in cima al flessibile panino supporto / gel plastica per accertare una superficie piana idrogel sulla polimerizzazione.
- Lasciare polimerizzare il gel per 45 minuti, anche se meno tempo può essere utilizzato per i gel di maggiore% in peso, se desiderato. Per verificare che il gel ha polimerizzato, osservare la soluzione rimanente nel tubo conico da 50 ml; se la soluzione rimanente è gelificata, allora è probabile che gelificazione sulla lastra di vetro è stata avviata pure. Si noti tuttavia che l'apertura anticipata dello stampo impedirà completa polimerizzazione.
- Una volta che il gel si forma, staccare il supporto plastico flessibile con il gel di poliacrilammide covalentemente attaccato sulla parte superiore, e impostare gel-side-up asciugare all'aria.
NOTA: convezione o essiccazione calore possono anche essere utilizzati per accelerare questo passaggio. Una volta essiccato sul supporto di plastica flessibile, il gel può essere negoziod tempo indeterminato.- Segna tutti i punti scoperti del supporto plastico flessibile, dove gel di poliacrilammide non formano a causa di bolle. Mark mentre il gel è ancora idratata quanto ciò fondono con il supporto plastico flessibile quando il gel è asciutto.
- Inserire 4972,5 ml di soluzione di precursore di poliacrilammide concentrazione finale desiderata (Tabella 1) in una provetta conica da 50 ml. Mettere in una camera di degasaggio per 30 minuti con il tappo aperto.
3. multipozzetto gruppo piastra, Collagene Coating, e sterilizzazione
- Assieme piastra multipozzetto.
- Una volta asciugato, tagliato gel PA in forme desiderate.
- Per una piastra a 96 pozzetti, utilizzare un buco pugno pesante, con un diametro di circa 6 mm. Usare un taglierino pesante per tagliare gel in forme quadrate o rettangolari. In alternativa, usare le forbici.
- Preparare circa 500 ml di PDMS per piastra da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Per incollare i gel al fondo di una piastra multipozzetto, posizionare una piccola goccia (~ 5 microlitri) di polidimetilsilossano (PDMS) al centro della ogni pozzetto. Utilizzando pinze, collocare uno polyacrylamide gel in ogni lato supporto plastico bene, flessibili verso il basso. Per consentire PDMS curare, lasciare la piastra montata a 37 ° C per un minimo di 4 ore.
- Una volta asciugato, tagliato gel PA in forme desiderate.
- Rivestimento Collagene di gel di poliacrilammide.
- Con una pipetta di trasferimento, mettere una piccola quantità (7-8 ml) di solfo-SANPAH (vedi punto 1.2.2) in ogni pozzetto e turbolenza da un lato all'altro per rivestire la superficie del gel in modo uniforme. Lavoro prontamente dal solfo-SANPAH non è stabile in acqua.
- Posizionare la piastra ben sotto una lampada UV ad alta intensità (intensità = 37 mW, λ = 302-365 nm) per 5 min. Sciacquare i gel con PBS per rimuovere l'eccesso solfo-SANPAH.
- Pipettare 50 ml di 0,2 mg / ml di collagene di tipo I soluzione (vedi punto 1.4) in ogni pozzetto. Lasciare la piastra coperta a temperatura ambiente per almeno 2 ore o O / N a 4 ° C.
NOTA: Per accelerare il processo di verniciatura collagene, una pipetta di trasferimento può essere utilizzata per aggiungere la soluzione di collagene. Tipicamente, 1 - 2 gocce di soluzione deve essere sufficiente per completarely coprire la superficie del gel. - Lasciare la piastra bene a temperatura ambiente per almeno 2 ore per consentire il collagene legame.
- Risciacquare con PBS per rimuovere la soluzione di collagene in eccesso e sterilizzare ai raggi UV (λ = 200 nm) in una cappa coltura tissutale per 2 ore.
- Mettere a bagno i gel in terreno completo (fare riferimento alla sezione 4.1 per mezzo di composizione) O / N per idratare ed equilibrare. Utilizzare per la cella di semina immediatamente o conservare in frigorifero per un massimo di 2 giorni.
4. Semina cellulare su PA Rigidità Assay
NOTA: Sebbene tipico per linee comuni di cellule di mammifero, il protocollo descritto in questa sezione è specificamente utilizzato con il cancro al seno linea cellulare MDA-MB-231 (vedi figure 4 e 5).
- Raccogliere cellule dal pallone di coltura tissutale da esposizione al 5% tripsina / EDTA per 5 min a 37 ° C. Utilizzare ~ 80 ml di tripsina / EDTA per ogni cm 2 di cultura dell'area pallone; per esempio, utilizzare 2 ml di tripsina / EDTA fora T25 pallone di coltura cellulare. Risospendere le cellule raccolte in mezzo completo addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina a una concentrazione cellulare finale desiderata. Tenendo conto delle cellule tempo di raddoppio e la lunghezza del tempo le cellule saranno seminate sul dosaggio, scegliere concentrazione cellulare sub-confluenti appropriata. Assicurarsi che media aggiunto è sufficiente per immergere completamente il idrogel.
NOTA: Poiché i idrogel sono stati pre-equilibrata nei media (fare riferimento al punto 3.2.6) 100 Volume ml dovrebbe essere sufficiente. Tipici volumi medi utilizzati per piastre a pozzetti multipli devono essere sufficienti in quanto i gel sono stati pre-equilibrata in media nel passaggio precedente.
NOTA: Il test sarebbe appropriato per qualsiasi tipo di cellula attaccamento-dipendente.- Contare il numero di cellule al microscopio invertito utilizzando un emocitometro. Carico 10 ml di sospensione cellulare in ogni porto emocitometro e la media del numero di celle da almeno 8 quadranti. Per ottenere ilconcentrazione cellulare finale, moltiplicare il numero di celle da 10 4.
NOTA: I migliori risultati di conteggio delle cellule si ottengono quando il numero di cellule in ogni quadrante emocitometro è 20 - 50.
- Contare il numero di cellule al microscopio invertito utilizzando un emocitometro. Carico 10 ml di sospensione cellulare in ogni porto emocitometro e la media del numero di celle da almeno 8 quadranti. Per ottenere ilconcentrazione cellulare finale, moltiplicare il numero di celle da 10 4.
- Coltivare le cellule sul test rigidità PA in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. Cambiare i media ogni 2 - 3 giorni. Raccogliere cellule quando necessario dall'esposizione al 5% tripsina / EDTA a 37 ° C per 5 min. Utilizzare ~ 80 ml di tripsina / EDTA per cm 2 di pallone di coltura tissutale. Durante tutte le fasi di manipolazione cellulare, prestare particolare attenzione a non disturbare la superficie di idrogel: aspirato o medio pipetta leggermente inclinando la piastra pozzetti lateralmente e toccando la punta della pipetta sulla parete laterale di ogni bene, al contrario di toccare l'idrogel.
NOTA: Ad eccezione facendo particolare attenzione a non danneggiare la superficie idrogel durante la movimentazione coltura tissutale normale, le cellule seminate su dosaggio rigidità può essere manipolato nello stesso modo come se fossero seminate suad una piastra multipozzetto regolare.
5. Imaging di celle seminate su PA Rigidità Assay
- Celle di immagine direttamente sul test rigidità PA.
NOTA: Qualsiasi microscope - invertito, fluorescenza o confocale, può essere utilizzata per l'imaging cellulare.
NOTA: Il supporto di plastica flessibile utilizzato per costruire il test di rigidità è completamente trasparente e non possiede autofluorescenza o interferire con l'imaging cellulare. Tuttavia, anche se il supporto flessibile di plastica è trasparente, capacità di imaging saranno limitati dalla distanza di lavoro dell'obiettivo. Il supporto di plastica flessibile ha uno spessore di 0,23 mm e una distanza di lavoro tipica di un obiettivo 10X è ~ 4 mm bruscamente decrescente per ingrandimenti maggiori.- Per l'imaging cellulare dal vivo, posizione PA rigidità test in portatarga microscopio e immagine. Tenere sessioni di imaging in 2 ore, o utilizzare un microscopio equipaggiato con una camera climatica per tempi più lunghi di imaging.
- Quando im cellulare dal vivol'invecchiamento non è l'obiettivo, fissare le cellule in soluzione di formaldeide 4% integrato con 0,1% di detergente. Immergere le cellule in fissante a temperatura ambiente per un minimo di 2 ore. Risciacquare con PBS due volte. Smaltire i rifiuti fissativo in un contenitore per rifiuti designato.
NOTA: Le celle possono essere esposte immediatamente o conservate immersi in PBS a 4 ° C fino a 2 settimane. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica su inalazione e contatto. Maneggiare con guanti in una cappa.
NOTA: il protocollo di fissazione delle cellule deve essere scelto in base ai protocolli di colorazione e di trattamento delle cellule successive, in quanto alcuni fissativi danneggiano alcune proteine cellulari. - Per l'imaging fluorescente, macchia cellule con colorazione cella desiderata direttamente nel piatto pozzetti fisso. Immagine immediatamente.
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Representative Results
Poliacrilammide (PA) idrogel sono ampiamente usati per testare le risposte delle cellule rigidità-dipendente. 17,24 Miscelando varie concentrazioni di acrilammide (A) e bis-acrilamide (B) si possono fare gel PA che abbracciano la gamma di maggior rigidità tessuti molli in il corpo - 0,3 -.. 300 modulo di kPa giovane 1 Tuttavia, la preparazione di gel di poliacrilammide è noioso e che richiede tempo, spesso limitando la loro utilità in applicazioni "high throughput" come per lo screening esempio farmaci 12 Qui, un metodo semplice e rapido per assemblaggio gel PA in piastre a più pozzetti o qualsiasi altro opportuno recipiente di coltura tissutale è presentato (Figura 1). La Figura 2A mostra il modulo di Young in funzione di diverse concentrazioni di A e B (anche riassunte in Tabella 1). La moduli di ulteriori combinazioni A e B sono riportati in letteratura. 17,25,26 La rigidità gel completamente swollen gel è stata misurata da reologia (AR 2000EX reometro, TA Instruments) con una geometria parallela 20 millimetri superiore, frequenza oscillatoria prova spazzata 1 - 10 Hz, e 2% di deformazione costante. Come anticipato, è stato dimostrato che sia il modulo di stoccaggio, G ', e modulo viscoso, G ", sono indipendenti dalla frequenza (Figura 2B). È stato inoltre confermato che l'essiccazione e poi re-idratazione gel, non ha influenzato il loro modulo di Young (Figura 2C). Modulo di Young era collegato al modulo di stoccaggio dalla seguente equazione: 
dove E è il modulo di Young e v è il rapporto di Poisson che è stato avvicinato a 0.5 per gel PA. 27 Si noti che i valori riportati sono per idrogel preparati con TEMED. Idrogel PA potrebbe anche essere preparati reticolazione UV quando il tempo di esposizione e intensità UV sono ottimizzati (
Inoltre, è stato dimostrato che le cellule seminate su idrogel di diversa stiffness esposto diversa morfologia. Per questo esperimento, il cancro della mammella MDA-MB-231 cellule sono state seminate in cima gel PA per 24-72 ore. Le cellule sono state coltivate in terreno RPMI supplementato con 10% siero bovino fetale ed 1% di penicillina / streptomicina in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% CO 2. Le cellule sono state seminate a 1 x 10 5 cellule / ml o 1 x 10 4 cellule / pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Questo è un tipico densità di semina cellulare - 4 volte inferiore alla densità cellulare confluenza, dove confluenza per una linea cellulare di mammifero è raggiunta a ~ 1 x 10 5 cellule / cm 2. Le immagini sono state scattate sul microscopio a fluorescenza invertito e analizzati sul ImageJ tramite il descrittore Shape e plug-in software Area. E 'stato osservato che quando seminati su gel PA per 24 ore, il cancro al seno MDA-MB-231 cellule sono rimasti rotonda sulle morbide 0,5 e 1 gel kPa, ma sono stati in grado di diffondere e allungare sulla rigida 100 kPa gel (Figura 4). Figura 4 showcas anchees il fatto che gli idrogel realizzati sulla parte superiore del supporto plastico flessibile sono trasparenti e consentono una facile visualizzazione e microscopia. Inoltre, il supporto plastico flessibile non possiede autofluorescenza e quindi non interferisce con la formazione dell'immagine cellule fluorescente. Morfologia cellulare è stata ulteriormente quantificato in termini di cellule complessiva area e fattore di forma delle cellule diffusione - circolarità (Figura 5). Area diffusione cellulare è stata misurata mediante la creazione di una maschera per tracciare il perimetro di ciascuna cella. Forma cellulare (circolarità) è stato quindi calcolato dalla seguente relazione: 
La circolarità è misurata su una scala da 0 - 1, dove 0,6-1 sono stati portati a designare cellule arrotondati e 0-0,5 sono stati portati a designare cellule allungate. Circa trecento cellule di almeno tre esperimenti indipendenti sono stati analizzati per ciascun poin dati t. Le differenze statistiche sono state calcolate sulla base di un'unica analisi fattoriale della varianza (ANOVA) dove insiemi di dati sono state considerate significativamente diversa quando p <0.05.
Figura 1. Rappresentazione schematica della preparazione gel di poliacrilammide su supporto plastico flessibile. La figura rappresenta le varie fasi coinvolte nella preparazione di gel PA su supporto plastico flessibile. Dopo il gel asciuga completamente, può essere tagliato o perforato in qualsiasi forma desiderabile. Un intero punzone (~ 6 mm di diametro) è più conveniente quando si prepara gel per una piastra a 96 pozzetti, mentre una taglierina pesante può essere utilizzato per forme quadrate o rettangolari. La figura evidenzia anche i bordi dei pozzi, con e senza un gel, per dimostrare che completa copertura ben inferiore può essere ottenuto con questo metodo. OAD / 52643 / 52643fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Rigidità PA idrogeli come misurato da reologia. (A) modulo di Rappresentante Young per cinque diverse concentrazioni A & B (vedere la Tabella 1 per acronimi); (B) di stoccaggio e modulo viscoso come funzione della frequenza misurata mediante reologia; (C) gel presentano lo stesso modulo di Young inizialmente (iniziale) e dopo che sono stati essiccati e reidratati (Re-idrato) indipendente dalla concentrazione di polimero precursore. Tutti i gel per le misure reologiche sono state preparate come lastre di diametro di 20 millimetri e 1-1,5 mm di altezza (su totale gonfiore).
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Figura 3. Rivestimento collagene su gel PA. Il rivestimento collagene (verde) viene distribuita in modo efficiente e trattenuta sul gel PA (rosso) superficie indipendente modulo idrogel rigidità di Young). Collagene marcato con Cy5 è stato usato per questi dati. Perline rosse fluorescenti sono stati incorporati nel idrogel PA alla visualizzazione aiuti. Immagini trasversali sono state scattate su un microscopio confocale (scala bar = 100 micron). Immagine adattato da Zustiak et. al. 5 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. contratto Phase (riga in alto) e fluorescenti (riga in basso) Immagini di MDA-MB-231 cellule seminate su gel PA per 24 ore. MDA-MB-231 cellule rimangono rotonda sul gel morbido (giovani 7; s modulo di 0,5 e 1 kPa), ma allungata su gel PA rigidi (modulo di Young di 100 kPa). Le cellule sono state seminate su gel per 24 ore, fissato in etanolo e colorati con arancio di acridina (AO - verde) per visualizzare il citoplasma della cellula e DAPI (blu) per visualizzare nucleo cellulare; scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. cellulare un'area diffusione e circolarità sono influenzati dalla rigidità del substrato sottostante. (A) cellule un'area diffusione MDA-MB-231 è aumentata notevolmente sul 100 kPa rispetto ai 0,5 kPa gel. (B) circolarità cellulare diminuisce con aumento PA gel rigidità. Asterischi indicano differenze significative; p <0.05.
Figura 6. Rappresentazione schematica di un'alternativa preparato gel di poliacrilammide su supporto plastico flessibile. La figura rappresenta le varie fasi coinvolte nella preparazione di gel PA su supporto plastico flessibile. Qui il supporto plastico flessibile viene inizialmente ritagli in "vetrini" in plastica di forma e dimensione desiderata. Questa tecnica funziona meglio per idrogel morbide. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Acronimo | Acrilamide% | Bis-acrilammide% | L'acrilamide dal 40% soluzione madre (ml) | Bis-acrilammide dal 2% soluzione madre (ml) | Acqua (ml) | G '± SD (kPa) | E ± SD (kPa) |
| PA1 | 5 | 0,025 | 625 | 62,5 | 4.312,5 | 0.62 ± 0.19 | 1.85 ± 0.57 |
| PA2 | 5 | 0.1 | 625 | 250 | 4125 | 3.55 ± 0.12 | 10.64 ± 0.36 |
| PA3 | 8 | 0.1 | 1.000 | 250 | 3750 | 9.71 ± 0.64 | 29.14 ± 1.93 |
| PA4 | 8 | 0.25 | 1.000 | 625 | 3375 | 22.00 ± 2.10 | 66.01 ± 6.31 |
| PA5 | 12 | 0.25 | 1,500 | 625 | 2875 | 37.42 ± 2.68 | 112.25 ± 8.03 |
Tabella 1. Le concentrazioni di acrilammide (A) e reticolante bis-acrilamide (B) e la risultante PA gel rigidità. Rigidità, qui rappresentati da G 'ed E, è stato misurato reologia. G 'è il modulo di stoccaggio a 1 Hz di frequenza. Modulo di Young, E, è stato calcolato dall'eq. 1. Deviazione standard (SD) è stato calcolato in base a tre esperimenti indipendenti con 3-5 campioni misurati per esperimento. Le sigle nella tabella corrispondono ai acronimi utilizzati nella Figura 2A.
| Intensità UV = 15 mW / cm 2 | Tempo di esposizione = 300 sec | ||
| Time (s) | E (kPa) ± SD | Intensity (mW / cm 2) | E (kPa) ± SD |
| 75 | 0.14 ± 0.03 | 15 | 28.05 ± 2.62 |
| 100 | 6.98 ± 2.34 | 26 | 21.13 ± 3.01 |
| 125 | 19.11 ± 2.29 | 37 | 20.01 ± 2.38 |
| 300 | 28.05 ± 2.62 | 66 | 19.35 ± 2.86 |
Tabella 2. polimerizzazione UV è un'alternativa e un metodo rapido per PA preparazione gel quando le condizioni di gelazione vengono ottimizzate; PA3 (vedi tabella 1) gel è raffigurato. La tabella riassume modulo la risultante di Young quando sia tempo di esposizione (a sinistra due colonne) o intensità UV (due colonne a destra) sono molteplici per la stessa soluzione. Sulla base dei risultati della tabella risulta che 300 sec tempo di esposizione e 15mW / cm 2 intensità UV dare la massima rigidità gel PA, che è paragonabile alla rigidità del gel tradizionalmente polimerizzata come riportato in Tabella 1.
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Discussion
Gel di poliacrilammide, originariamente sviluppati per elettroforesi, 28 sono oggi utilizzati di routine come substrati di coltura cellulare per studiare gli effetti di substrato rigidità sulla morfologia delle cellule, la motilità e la comunicazione 3,24,29 tra le altre caratteristiche cellulari. Poliacrilammide consente la manipolazione del substrato rigidità che comprende la rigidità di tutti i tessuti molli del corpo (0,3 - 300 kPa) 1 con una semplice variazione della concentrazione di polimero precursore (Figura 2, Tabella 1, anche vedere riferimenti 17,25,26). Accoppiato al fatto che i gel PA sono piuttosto economica e semplice da preparare, sono diventati piattaforme indispensabili nello studio delle interazioni cellula-materiale rigidezza-dipendente. Tuttavia, anche se semplice, la tecnica attuale di preparazione gel PA è limitata a piccoli lotti. Questo limitazioni derivano dalla natura della gelificazione idrogel, che è una polimerizzazione a radicali liberi catalizzata da ammonio persolfatoe TEMED. 30 Poiché la reazione è una catena di polimerizzazione a radicali liberi, può essere inibita da qualsiasi elemento che funge da trappola di radicali liberi, come l'ossigeno. Pertanto, poiché la diffusione di ossigeno nella soluzione polimerica deve essere evitata durante la polimerizzazione - che potrebbe richiedere fino a 45 min per i gel morbide - semplicemente pipettando gel PA in una piastra multipozzetto aperta non è fattibile. Inoltre, per essere utilizzato come bidimensionale (2D) substrato cellulare, la superficie del gel PA deve essere piatta. Entrambi i suddetti requisiti dettano che per produrre gel PA come substrati cellulari 2D, soluzione di gel precursore PA devono essere racchiusi tra due superfici piane in polimerizzazione - per inibire diffusione dell'ossigeno e appiattire la superficie del gel. Inoltre, la superficie superiore deve essere tale da poter facilmente staccare dal gel esponendo la superficie per l'adesione delle cellule. Questo è tipicamente ottenuto rivestimento idrofobo di una superficie di vetro. Infine, quando posizionato in the pozzetti di una piastra multipozzetto, i gel PA dovrebbero coprire l'intera superficie ben e limitarsi a galleggiare. Completa copertura della superficie di fondo pozzo è particolarmente importante nelle applicazioni in cui i test utilizzati per valutare le cellule sono il tipo che tiene conto della popolazione cellulare complesso nel pozzetto (es, MTT). Se il gel PA non copre l'intera superficie adeguatamente bene, bisogna fare attenzione per bloccare l'adesione delle cellule alla superficie ben esposto come cellule potrebbero facilmente cadere dal gel sul vetro o plastica. Se necessario, BSA blocco secondo protocolli standard o utilizzando off-the shelf kit blocco di adesione cellulare basato BSA-dovrebbero essere sufficienti a bloccare l'adesione delle cellule al fondo della piastra bene. Ad esempio, per preparare una superficie coperta di BSA, 0,5 mg / ml soluzione di BSA in PBS, pH 7,4 dovrebbe essere adsorbito sul piatto di coltura tissutale per 20 minuti a RT, sciacquati con PBS e utilizzati immediatamente o conservato a 4 ° C per fino a 2 settimane. BSA ha dimostrato di bloccare l'adesione delle cellule of colture cellulari di mammifero su entrambe le superfici di polistirene idrofili e idrofobi, riducendo notevolmente le forze di adesione cellulare, come misurato mediante microscopia a forza atomica. 31 BSA è stata utilizzata di routine per bloccare l'adesione delle cellule di mammifero e creare cellule superfici modellate. 32,33
La tecnica descritta in questo articolo, soddisfa tutti i requisiti di cui sopra consentono la produzione di massa di uniformi gel PA di formato personalizzato e forma. La tecnica è più semplice e più efficiente rispetto allo standard attuale di sandwich soluzione di gel precursore PA tra due vetrini. Inoltre, esso non richiede attrezzature sofisticate e quindi è facilmente adottabile da qualsiasi laboratorio di ricerca. È anche più conveniente in quanto non richiede l'utilizzo di lastre di vetro o di vetrini, che non sono solo costoso, ma anche venire in dimensioni limitate. La tecnica è anche più rapido per diverse ragioni. Innanzitutto, non comporta alcun passo pretrattamentotipico per superfici vetrate in quanto il supporto plastico flessibile è progettato con due superfici distinte - una parte idrofila che si attacca permanentemente poliacrilammide e un lato idrofobico che potrebbero essere facilmente staccata dopo la formazione del gel. In secondo luogo, poiché il supporto di plastica è flessibile, è più facile e più veloce per staccare il gel formatosi: quando gel sottili si formano tra due vetrini, staccava la diapositiva idrofoba superiore è difficile e spesso provoca la rottura che compromette anche il gel. Infine, a causa della trasparenza supporto plastico flessibile, polimerizzazione UV più veloce può essere impiegato in contrapposizione alla polimerizzazione a base di TEMED standard, che potrebbe richiedere fino a 45 min (Tabella 2). I dati in Tabella 2 dimostra che quando il tempo di polimerizzazione e l'intensità della luce UV sono ottimizzati rigidità simile può essere ottenuto con entrambi i metodi di polimerizzazione TEMED e UV.
Gli idrogel sono preparati a pl flessibileSupporto astic come illustrato in Figura 1. Si consiglia di eseguire la gelificazione in una camera di degasaggio per evitare polimerizzazione incompleta dei bordi gel (cioè, effetti di bordo) a causa della diffusione di ossigeno tra le due superfici che racchiudono la soluzione polimerica. L'obiettivo è quello di creare un grande film di idrogel in cima al supporto plastico flessibile, in tal modo, lastra di vetro di ogni misura sarebbe opportuno, ma detterà le dimensioni di pellicola di poliacrilammide che può essere raggiunto. Il vetro può essere rivestito con qualsiasi rivestimento idrofobo o, in alternativa, il lato idrofoba del supporto plastico flessibile potrebbe essere usato al posto. Una volta che un film di gel PA si forma, si è asciugato, tagliato in forme desiderate, e poi ri-idratato prima dell'uso. Una volta asciutto, i gel possono essere conservati a tempo indeterminato. È stato confermato dalla reologia, che il gel rigidità PA è invariato su reidratazione anche quando i gel sono memorizzati allo stato secco per diversi mesi (Figura 2C). Tuttavia, per molto soft gel (≤ 1 kPa in modulo di Young) essiccazione e reidratazione cordonatura superficie esacerbare o incrinature. Questo comportamento è comune per i gel molli che subiscono de-idratazione e la successiva re-idratazione pur essendo geometricamente vincolato. 34,35 Non tutti i gel piega o crack, quindi, è possibile esaminare visivamente le idrogel prima dell'uso e utilizzare solo i campioni che visualizzano una superficie liscia. Per evitare completamente la formazione di pieghe e screpolature, un metodo alternativo per preparare idrogel morbide è raffigurato in Figura 6. Qui, il supporto plastico flessibile è pre-tagliato nella forma desiderata e il gel PA è formata sulla parte superiore, in tal modo, i gel no devono essere de-idratato ma può essere utilizzato come preparati. Un ulteriore vantaggio di questa strategia alternativa è che ~ 2,5 più gel possono essere prodotti dallo stesso volume di soluzione di idrogel precursore (la stima si basa sulla preparazione gel per una piastra a 96 pozzetti standard, come descritto nella sezione del protocollo). Una cautela quandopreparare idrogel in questo modo è prendersi cura per evitare infiltrazioni di ossigeno, soprattutto per i gel di minori dimensioni (ad esempio, gel da utilizzare in una piastra a 96 pozzetti). Anche quando la soluzione di gel precursore viene completamente degassata, cioè, ossigeno libero, ossigeno sarà diffondendo tra le due superfici che racchiudono la soluzione PA. Pertanto, al fine di evitare effetti di bordo o formazione di gel incompleta lungo i bordi, è meglio consentire la polimerizzazione avvenga in assenza di ossigeno. Nella nostra esperienza, una camera a vuoto funziona bene, anche se un ambiente di gas inerte, potrebbe essere utilizzato con uguale successo.
Un'ultima attenzione durante la preparazione PA idrogeli come substrati cellulari per testare le risposte delle cellule rigidità-dipendente, è che lo spessore del idrogel risultante è importante: per i gel molto sottili, le cellule sono in grado di rilevare il substrato sottostante 36 Uso teoria ed esperimento,. Lin et al. hanno dimostrato che la profondità a cui le cellule possono feel il substrato sottostante dipende dalla dimensione laterale della cella. 29 Poiché la ricerca attuale è contraddittori, identificando lo spessore minimo richiesto per impedire alle cellule di rilevamento substrato "nascosto" per essere da alcuni micron 36 fino a 60 micron, 37 uno spessore gel minimo di 100 micron dovrebbe mirare per.
Durante il montaggio il gel PA in una piastra multipozzetto, una piccola goccia di PDMS è utilizzato per fissare il gel sul fondo del pozzo. PDMS è stato scelto perché agisce colla permanente su di indurimento, è completamente trasparente e non interferisce con successivi esperimenti di microscopia, è completamente non citotossica, e guarisce in circa 4 - 8 ore lasciando tempo sufficiente per il montaggio piastra. Sicuro fissaggio degli idrogel al fondo degli aiuti e nella movimentazione delle cellule: per esempio, il lavaggio vigorosa potrebbe dislocare idrogel se non saldamente. Se il cambiamento frequente nella cella media non è un problema, allora i gel possono essere fissate temporaneamente bene la superficie da una piccola goccia di un liquido non-citotossica e altamente viscoso come glicerina.
Le fasi finali prima semina cellulare comportano rivestimento ECM del gel e poi la sterilizzazione. Qui rivestimento collagene tipo I è illustrato (figura 3), anche se la stessa tecnica può essere applicata a qualsiasi altra proteina ECM. Il bi-funzionale crosslinker solfo-SANPAH viene utilizzato per ottenere uno strato uniforme monostrato. Precedenti ricerche hanno dimostrato che tale legame covalente produce un rivestimento più uniforme rispetto proteina semplice adsorbimento e permette anche di sintonizzazione 12 volte della quantità di proteina collegata tramite una semplice soluzione proteica di diversa concentrazione. 6 Infine, la lastra di gel multipozzetto assemblato è sterilizzato ai raggi UV nella cappa coltura tissutale per un massimo di 2 ore. La sterilizzazione UV consente per il saggio a essere montato su un banco di laboratorio fuori del cappuccio,rende il processo logisticamente più semplice e più veloce complessiva.
Le figure 4 e 5 illustrano alcuni risultati rappresentativi di cellule MDA-MB-231 di cancro al seno in coltura su flessibili in plastica di sostegno collegata PA gel di diversa rigidezza. MDA-MB-231 cellule sono state scelte per dimostrare l'utilità metodo perché essi hanno dimostrato di reagire al substrato sottostante rigidità da cambiamenti misurabili nella loro morfologia. 5,12 Come previsto, le cellule erano più allungata e aveva una zona più ampia diffusione sulla le rigide 100 kPa gel PA rispetto alle morbide 0,5 e 1 gel kPa PA (figure 4 e 5). La fila inferiore in Figura 4 mostra anche l'uso di due coloranti fluorescenti che macchiano il nucleo cellulare e citoplasma della cellula, mostra il fatto che il supporto plastico flessibile non interferisce con l'imaging fluorescente microscopio.
In sintesi, un metodo semplice per preparare idrogel di poliacrilamide in unFormato piastra multipozzetto è presentato. La tecnica è più veloce, più efficiente e meno costoso rispetto ai metodi attuali per preparare gel PA per essere utilizzati come substrati cellulari e consente la preparazione di gel di formati personalizzati non altrimenti disponibili. Poiché non richiede attrezzature specializzate, il metodo può essere facilmente adottata da qualsiasi laboratorio di ricerca e sarebbe particolarmente utile nella ricerca focalizzata sulla comprensione delle risposte cellulari rigidità-dipendente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution — Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent: Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 ml conical tubes | Fisher Scientific | 3181345107 | |
| 15 ml conicals tubes | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 ml: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scientific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml) | Fisher Scientific | 1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Fisher Scientific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
References
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