Abstract
酒精使用障碍（AUD）是一个严重的健康挑战。尽管大量的遗传成分澳元，一些基因已被明确地牵连的病因。果蝇， 果蝇 ，是一个功能强大的模式探索潜在的酒精有关的行为的分子遗传机制，因此保持着识别和理解基因影响澳元的作用巨大潜力。利用果蝇模型对这些类型的研究依赖于测定中，能可靠地测量的行为反应，以乙醇的可用性。这份报告介绍了适用于评估乙醇的灵敏度和快速耐受在果蝇的实验。在该测定中测得的乙醇灵敏度由体积和乙醇浓度使用，各种先前报道遗传操作，并且时间还长的影响苍蝇收容没有食物之前立即测试。与此相反，乙醇sensitivity在此测定法测量不受苍蝇处理，苍蝇的性别，并补充以抗生素或活酵母生长培养基的活力。三种不同的方法来定量乙醇灵敏度描述，所有领先的基本上没有区别乙醇的敏感性结果。该测定的可伸缩的性质，结合其总体简单性设置和相对低的费用，使其适合于乙醇的灵敏度和快速耐受在果蝇的小和大规模基因分析。
Introduction
酒精使用障碍（AUD）是一个巨大的健康问题的全球（1回顾）。虽然驱动澳元的发展机制是复杂的，这些疾病有重要的遗传成分（ 例如，2）。元和保守的行为反应的大遗传跨越许多物种（在3,4审查）已经产生在利用遗传模式生物，调查在乙醇相关的行为的特定基因的朝向更好地理解的分子基础的介入的强烈兴趣乙醇澳元。果蝇， 果蝇 ，已成为一个主要模式生物研究乙醇相关行为的分子遗传机制（3,4审查）。研究苍蝇突出角色的几个信号通路的行为反应，以乙醇（5审查）。有趣的是，某些基因和通路的影响行为respons下载到乙醇中蝇也被牵连在啮齿类乙醇相关的行为和/或人AUD（ 例如，6-14）。机制的保护驾驶乙醇相关的行为跨物种，加上在果蝇模型系统中可用的遗传工具套件，强调果蝇模型的效用调查的行为反应的遗传乙醇。
灵敏度15,16和公差（在17中综述）在人中乙醇被链接到元的发展。这两种行为反应的乙醇可在果蝇经由各种实验室测定法（在3,4综述）进行建模。所有已知的作者飞测定法是基于从乙醇镇静要么依赖于时间的乙醇诱导镇静/共济失调或依赖于时间的恢复。
从我们组对乙醇的灵敏度和r的遗传学以前的文章在果蝇 APID宽容的基础上，苍蝇乙醇蒸气引起镇静一个行为实验检测18。试验在该试验中被转印活成人发起蝇无需麻醉清空食品小瓶，诱捕苍蝇与醋酸纤维素插塞的小瓶中，加入乙醇到乙酸纤维素插塞的顶部（ 即，非飞边），并且密封含有苍蝇，醋酸纤维素插塞和乙醇用硅酮塞子的小瓶（参见示意图图S3中 ，参考18）。代表不同组的苍蝇的多个小瓶评估平行，提高吞吐量该测定的。小瓶给一个匿名代码和实验者被蒙蔽治疗组，以防止意外的偏见镇静的评估。在标准实验中，苍蝇在小瓶轻轻敲打以6分钟的间隔，并在30秒后恢复，镇静剂苍蝇在每个小瓶中的数目进行计数并转换器具d可％活性苍蝇。苍蝇吸收从醋酸纤维素插塞乙醇蒸汽以时间依赖的方式，导致逐步增加内部乙醇18和镇静（比照参考18和图1A和1B在本报告中）。镇静在此测定法操作上定义为果蝇（ⅰ）站立在没有步行或（ii）具有或不具有拍打翅膀躺在背上的。这里，这乙醇镇静测定进行详细说明，有关使用它进一步操作优化设置，并测定用于寻址的食物补充剂的选项上飞镇静灵敏度的贡献。
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Protocol
1天前分析
- 在简短（1-5分钟） 二氧化碳收集苍蝇进入生鲜食品小瓶中的11（单一性别）组。
- 允许蝇以回收的O / N的食品小瓶在环境受控的空间（通常为25℃，相对湿度60％，12小时光照/黑暗周期）。
- 制备乙醇溶液（S）稀释在纯化（≥18MΩ）水纯（100％）乙醇至最终浓度（多个）适当的计划实验。允许溶液（S）返回RT O / N。
注意：乙醇稀释是放热的。
第2天的测定
- 对于要测试的苍蝇的每个小瓶中，制备（ⅰ）一个干净的空的食品小瓶;即，测试小瓶中，（ii）一种新的醋酸纤维素插塞，（ⅲ）一个硅胶塞及（iv）将1ml乙醇溶液（ 见表3）。
- 通过调节温度至20-25℃，相对湿度55-65％准备测试室。
- 有另一名工人分配一个唯一的代码给每个组小瓶并记录代码购买。将编码小瓶苍蝇在试验室，以适应少数分钟。
- 标签的空瓶子测试从2.3匹配飞瓶代码。
- 通过以类似于表1中的电子表格输入码成列（1列/小瓶）构造一个硬拷贝测试日志。
- 使用测试日志为指导，安排编码食品小瓶苍蝇和空测试小瓶入考场匹配阵列。
注：小瓶测试的合理的最大数量为24（ 即 6组，每组4瓶）。 - 转让航班从食品到小瓶匹配/标记空测试小瓶，立即将醋酸纤维素插头插入测试小瓶，直到醋酸纤维素插头2厘米以下的小瓶顶部。
- 此后，处理好四个小瓶每排为一组，在交错1分钟的间隔。
- 对于时间0评估，单独瓦特掌握每个小瓶第i个拇指和食指，轻轻拍打桌子上三次敲苍蝇瓶的底部，等待30秒再算上苍蝇是不动/死亡人数。记录静止/死苍蝇为每小瓶的数量在时间0分钟的硬拷贝测试日志。
- 启动定时器持续计数在时刻0，并立即开始加入1毫升乙醇到乙酸纤维素塞小瓶用于第一行/组4的小瓶。加入1毫升乙醇的醋酸纤维素插塞在小瓶以5秒的间隔在它们将被测试的顺序。加乙醇到乙酸纤维素塞的圆周运动，使乙醇在整个醋酸纤维素插塞均匀吸收。当乙醇已被添加到在该组的所有4测试小瓶，插入一个硅胶塞在每个小瓶密封。
- 在时间1，2，3，4，5分钟，加入1毫升乙醇到第二，第三，第四，第五和第六组的4小瓶，分别。继续后插入硅胶瓶塞加入乙醇至每组4小瓶中。
- 在时间6分钟，通过抓住每个小瓶用拇指和食指，轻轻拍打在桌子上三次敲苍蝇到小瓶的底部，等待30秒，然后计数并记录的总数测试所述第一组的4小瓶被麻醉苍蝇。得分苍蝇作为镇静剂，如果他们（我）站在瓶的地板，但不走或（ii）趴在自己的背上有或无拍打自己的翅膀。
- 处理使用进度表2中的组在5秒的时间间隔内的每个小瓶中。
- 在时间7，8，9，10和11分钟，测试所述第二，第三，第四，第五和第六组小瓶，分别作为完成对于第一组。
- 在时间12分钟，再次测试所述第一组的4小瓶如在2.12中描述，并继续在13，14，15，16和17分钟，测试所述第二，第三，第四，第五和第六组的小瓶，分别。
- 在2.12描述，直到所有的苍蝇有s继续进行测试飞行edated。
- 在硬拷贝测试记录每个小瓶进入蝇的总数。从蝇的总数审查动/死苍蝇在时间0。
- 计算在每个评估时间点的％活性苍蝇和情节数据作为％活性蝇（y轴）对时间（x轴）。通过从三阶多项式或S形曲线拟合内插镇静时间50的值（ST50，时间70％的镇静）或曲线下面积的计算定量乙醇的镇静。
- 汇编从解码小瓶数据并执行统计分析（ 例如，单向ANOVA与Bonferroni多重比较检验）以适合的实验设计。
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Representative Results
从该乙醇的镇静测定的原始数据是蝇被镇静剂如乙醇蒸汽暴露时间的函数的数字。原始数据转换为％的活性苍蝇作为时间的函数（主要数据， 图1A，B，D - F）。灵敏度对乙醇的镇静从主数据可从曲线拟合来定量为镇静时间50（ST50），成为曲线（AUC）下的镇静剂或AEA所需苍蝇的50％的时间，通过内插。先前报道18三阶多项式曲线拟合的主数据以及预期的（平均，R 2 = 0.934，N = 24， 图1A），尽管S形曲线拟合主数据稍好（平均，R 2 = 0.997，N = 24; 图1B）。作为替代，从曲线拟合确定ST50值，从初级数据乙醇的镇静灵敏度也可以被定量为区域曲线下面积（AUC，％活性蝇×时间）（ 图1C）。从这三个定量方法的结果相关联非常好彼此（皮尔逊R 2≥0.998，N = 24），并基本上是无法区分（ 图1C），虽然单位不一定用于ST50（分钟）和AUC（％活性不同苍蝇×时间）。可从相应的笔者对于所有的计算细节，使用电子表格等。注意，ST50（或AUC）的更高和更低的值表示了钝化和增强的灵敏度分别为乙醇的镇静。对于与前一报告18一致性，从 第三阶多项式曲线拟合而得ST50值在整个这个study.Importantly其余被使用，化验检测RNA干扰在渣打银行的影响对Cnx14D（ 图1D）和突变（ 图1E） ， 阿鲁和hppy（ 图1F）
在常规使用该测定的，攻丝小瓶润湿2ml乙醇醋酸纤维素插塞引起的醋酸纤维素插塞朝向一些小瓶的底部在少数个体实验（未示出）行进，从而潜在地改变了果蝇的自由空间和乙醇蒸气的浓度。此外，大约乙醇0.25毫升到达底部（ 即，飞边）的醋酸纤维素插塞时，被弄湿2毫升乙醇（ 图2A），提高的苍蝇在这些测定暴露于乙醇液中加入的可能性乙醇蒸气。减少在醋酸纤维素插塞乙醇的体积为2毫升至1毫升消除cellulos的向下迁移在试验过程中E乙酸酯插头即使经过剧烈攻丝（未示出），并且还消除了对醋酸纤维素插塞（ 图2A）的塔底乙醇溶液可测量的量。蝇镇静是乙醇即使体积小于1毫升（ 图1A - C）的使用量敏感。用1ml乙醇因此有助于保持苍蝇测定期间以恒定的开放空间，并确保液体乙醇不被摄入。因此蝇想必暴露于单纯乙醇作为在该测定中的蒸气。将1ml 85％的乙醇（ 即，1毫升85％（体积/体积）乙醇蒸汽）和1-5天龄瓦特〔A〕苍蝇在这里报告，除非另外指出，否则所有的后续研究中使用。
在24瓶的实验中，苍蝇轻轻拍了拍6分钟的间隔，让实验者评估（ 即循环）在一个合理的，规定所有正点瓶即从具有使用较少的小瓶和5分钟的间隔控制苍蝇研究ST50s则相当于ST50s从具有6分钟的间隔研究（数据未显示）。蝇攻丝以允许实验者时间挖掘一组四个小瓶中序列之前确定所述苍蝇在每个小瓶的镇静状态后评估镇静30秒。要确定是否在窃听影响乙醇镇静敏感，在男性和女性的控制苍蝇ST50值后攻的活力和恢复时间的差异进行测量，而被窃听正常（正常）或极显着（硬）和一个标准的30秒或更长的时间60秒后，恢复。攻丝活力（ 图2B）和恢复时间（ 图2C）具有在控制男性或女性上ST50值没有可测量的效果。
抗生素可用于抑制细菌生长在飞食品平台。要确定是否补充抗生素食品中的乙醇会影响镇静敏感，ST50值的测定在果蝇饲养1代中存在或不存在的三种抗生素（氨苄青霉素，100微克/毫升;四环素，20微克/毫升;氯霉素，125微克/毫升）。饲养苍蝇在这些三种抗生素对乙醇的镇静敏感性（ 图2D）没有影响。
蝇转移至空的食品小瓶-并因此被暴露于乙醇蒸汽在镇静测定之前被剥夺食物和水〜5分钟，立即。如果要判断时光飞逝量保持在空的食品小瓶启动试验影响乙醇镇静敏感之前，苍蝇被饿死6小时（至少70倍的正常的），然后ST50值进行了测量。饥饿6小时，男性和女性的控制苍蝇（ 图2E）的显著下降ST50s。虽然饥饿对ST50的效果相对较小（在这些实验中9-14％），所需的时间量蝇SPE次空药瓶之前暴露于乙醇蒸汽的检测应在一个实验，也实验之间举行跨团体制服。
实验室飞食品可以用活酵母来补充（ 如 18,20,23,24），以促进生产的后代。例如，食品的小瓶补充有活酵母（ 酿酒酵母 ）早于那些与热灭活酵母或无活酵母（比较D10-D11，白条， 图3A）产生的成年人，尽管生产20天以上的子代的总数目是难以区分在小瓶补充有活和热灭活酵母（ 图3A）。为了解决这一活酵母产生的飞食品乙醇有意义量的可能性，测定对（ⅰ）乙醇在食品介质，（ⅱ）在乙醇苍蝇，和（iii）在果蝇乙醇镇静灵敏度活酵母的影响。食物中补充活酵母包含的子相比食品补充有热灭活或无酵母（ 图3B）stantial量的乙醇。然而，控制苍蝇生长在培养基中的活，死亡或无酵母不加区别了低浓度乙醇的内部（ 图3C）的。此外，乙醇的镇静灵敏度为区分在生长于培养基中补充有加热灭活的或活酵母（ 图3D）控制苍蝇。
图1（AC）镇静化验数据分析选项。控制 W [A]女性（附1118等基因，印第安纳州布卢明顿果蝇库存中心股票＃5905）暴露从85％（体积/体积）乙醇的指示卷蒸气。（A）镇静时间过程数据拟合与三阶阶多项式。（B）镇静时间过程数据拟合与S形曲线。（℃）乙醇的镇静灵敏度定量如（左Y轴）ST50从三阶多项式内插的曲线下的值和S形曲线或（右Y轴）面积（AUC，％活跃的苍蝇×时间）。乙醇体积，但不分析方法，影响乙醇灵敏度（双因素方差分析;体积的效果，P <0.0001;分析方法，纳秒的效果; N = 8 /组;变换1/100的AUC数据以说明在差分从这些值的大小）。（DF）代表时间过程数据（D）的 Cnx14D RNA干扰在中枢神经系统（ELAV-GAL4 / v5597）钝化，以对照（灵敏度相对乙醇表达v5597 / +和ELAV-GAL4 / + ）。 s CB（SCB VOL2）和阿鲁 （E和F）突变（ARU 8.128）增强乙醇的镇静敏感性和hppy突变（hppy与对照组相比KG5537）钝化乙醇镇静灵敏度。在EF数据之前被报道为ST50值18。
图2.评估在镇静测定操作参数。乙醇（A）中 ，在底部2毫米的醋酸纤维素插塞金额。乙醇的体积加入到醋酸纤维素插塞的顶部具有乙醇，在一个模拟60分钟的实验（单向ANOVA，P <0.0001移入底部2毫米的醋酸纤维素插塞的体积上的显著影响; *邦弗朗尼多重比较检验，将2ml比0和1ml，P <0.05，N = 4）。乙醇定量如醋酸纤维素插头的质量变化。（B）无论攻小瓶时活力测试（正常，硬），也不性别苍蝇测试受影响ST50s（2-W唉ANOVA;攻丝，NS的效果;性别，NS的效果; N = 12），（C）无论恢复时间攻也不性爱对ST50s（双向ANOVA显著影响后;恢复时间，ns的作用;性别，NS的效果;抗生素N = 6），（D）纳入在生长介质中;（ATC氨苄青霉素，四环素和氯霉素）对ST50s没有整体的效果，但有性别对ST50（双因素方差分析的效果; ATC，纳秒的效果;性，对效果= 0.001;相互作用，NS;饥饿的N = 6）（E）对乙醇的镇静敏感。 ST50s是显著降低苍蝇剥夺食物和水6小时（饥饿）相比，通常美联储（FED）苍蝇;在男性和女性ST50s均不可区分整体（两因素方差分析;饥饿的效果，P <0.0001;的性别，纳秒效果; N = 12; * Bonferroni多重比较检验，饥饿的男性和女性的效果，P <0.05） 。
图上生长，乙醇含量和镇静敏感活酵母3.影响。（A）由含有补充了无酵母（无Y）食品中小瓶成年后代，热杀死酵母（杀Y）或活酵母（直播Y）。白条，成年后代在10-11天出现;灰条，12-20天。总体而言，酵母处理对后代的生产（单向方差分析一个显著效果;所有（10-20）天，P <0.0001; 10-11天，P <0.0001;天12-20，p值= 0.0002; N = 5 ）。在所有（10-20）天生产后代的总数为更大的小瓶杀Y和现场ÿ比没有Y（Bonferroni多重比较检验，P <0.05）。在10-11天，小瓶直播Ÿ产生更多的后代比杀Y和小瓶杀Ÿ产生比没有ÿ更多的后代（白条，Bonferroni多重比较测试，P <0.05）。在12-20天，小瓶无线日打死Ÿ生产比小瓶无Y或现场Ÿ更多的后代（灰条，Bonferroni多重比较检验，P <0.05）。（B）乙醇在食品中是显著高于小瓶辅以现场Ÿ比小瓶无Y和杀Y（单因素方差分析，P <0.0001，N = 5; Bonferroni多重比较检验，P <0.05），（C）在W [A]雌性果蝇并没有显著受补充酵母内部乙醇（之一。往来港澳ANOVA，NS，N = 5-10）。在B和C的乙醇含量测定如所述图 18（D）的 ST50值不显著受到生长培养基的补充酵母在男性或女性W [A]（双因素ANOVA;酵母，纳秒的效果;效果性别，纳秒; N = 12）。
| 小瓶→ | 1 | 2 | 3 | 4 | 五 | 6 | 7 | 8 |
| 代码→ | ||||||||
| 总＃→ | ||||||||
| 0分 | ||||||||
| 6分钟 | ||||||||
| 12分钟 | ||||||||
| 18分钟 | ||||||||
| 24分钟 | ||||||||
| 30分钟 | ||||||||
| 36分钟 | ||||||||
| 42分钟 | ||||||||
| 48分钟 | ||||||||
| 54分钟 | ||||||||
| 60分钟 |
表1：典型的测试日志 。见协议的步骤2.5。
| 小瓶 | 龙头 | 评估 |
| 1 | 6分0秒 | 6分30秒 |
| 2 | 6分5秒 | 6分35秒 |
| 3 | 6分10秒 | 6分40秒 |
| 4 | 6分15秒 | 6分45秒 |
表2：典型的攻和测试安排请参见协议的步骤2.13。
| 材料/设备名称 | 公司 | 目录编号 | 评论/说明 |
| 食品瓶 | VWR | 89092-772 | 窄 |
| Flugs | 杰纳西/ flystuff.com | 49-102 | 窄 |
| 硅胶塞 | Fisher Scientific公司 | 09-704-1l | ＃4 |
| 乙醇 | 药理AAPER | 111000200 | 200度 |
表3：材料。
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Discussion
简单的实验是重复定量有意义的表型是对行为的分析具有重要价值。这里所描述的工作涉及测量乙醇镇静敏感和快速耐受果蝇的实验的几个实际问题。虽然这项工作不是一个焦点，行为分析是通过维持对环境和遗传背景常数为测试对象的研究中变得容易。此外，比较通常应苍蝇饲养和测试并排侧的组之间进行比较。为此，从个人实验之内的所有的苍蝇在这项工作中有相同的遗传背景和均匀的环境条件（25℃，相对湿度60％，12小时光照/黑暗周期）与标准食品介质下进行饲养并排（10 ％蔗糖，3.3％玉米粉，2％酵母和1％琼脂），除了那些在其中食物介质被明确操纵实验。
该ETH这里描述anol镇静测定需要很少的材料（塑料瓶，醋酸纤维素插塞，硅酮塞子和乙醇），所有这些都是廉价且容易地从商业来源获得（ 表3）。这种乙醇镇静测定类似于并基于先前报道的方法（ 例如，6,20,25-27，全面在3,28中综述），在很大程度上。虽然所有这些测定的具有实用性，用于测量乙醇的镇静灵敏度，测定的优势在这里描述的包括（i）苍蝇未在试验过程中暴露于液体乙醇，（ii）该拥有降低可能性会变得缠结在棉花或其它材料在测定过程中的测试小瓶中，（ⅲ）的能力，以测试在并行苍蝇许多组，以及（iv）三种选择从主数据集乙醇灵敏度的客观定量。总之，这些优点在很大程度上消除了苍蝇喝乙醇的可能性，塔吨乙醇可润湿蝇从而抑制它们的整体运动的能力的外表面，和苍蝇在测定的该性能可以通过在测试环境缠结材料有关的困难被混淆。此外，这些优点增加了测定的总吞吐量和可重复性。此外，在该试验中测得的乙醇灵敏度的表达不影响内源性白色或转基因标记迷你白 18，使它适于与果蝇基因分析常用的转基因和遗传背景的研究。
几个关键参数应该被控制，以获得从乙醇的镇静测定可靠的结果。除了控制生长环境和菌株的遗传背景进行测试（见上文），体积及乙醇浓度当然乙醇sensitivi的定量极其重要TY。需要注意的是乙醇在水中的稀释度是放热的。因此，稀释的乙醇溶液，应使其平衡至RT镇静测定的开始之前。应横跨被测试的组均匀的附加参数是时间苍蝇开始之前，所述镇静测定收容在空食品小瓶的长度。两个附加参数也应加以控制。蝇每小瓶的数目最好应（一）在所有的小瓶和组是相同的，（B）
一个数字，能迅速容易地进行计数，和（c）一种数足够大，以允许相对光滑镇静时间课程。十一过得/瓶行之有效的在我们的实验室，是一个建议的出发点。最后一个参数要考虑的是镇静实验用果蝇的年龄。尽管年龄对乙醇的镇静灵敏度在1-10天龄的苍蝇没有重现的效果，已经发现（数据未显示），利用年轻年龄匹配的动物似乎合理考虑到大量文献年龄相关的行为改变在果蝇29,30。
其他参数测试使用这里描述的参数范围内控制苍蝇的时候似乎并没有镇静试验的关键，至少。这里描述的测性别，攻的实力，从攻恢复时间，并补充飞食品用抗生素（氨苄青霉素，四环素和氯霉素），或活酵母不改变乙醇的敏感性。类似地，通过从三阶多项式曲线，从S形曲线插值，或从主镇静时间过程数据判定的AUC的插补定量乙醇灵敏度导致基本上没有区别的解释。虽然被始终如一地在这里所描述的研究中观察到的性别没有效果，已经报道了对乙醇灵敏度性在几个果蝇遗传背景的影响31。因此，它是可能的性别影响是只需在W遗传变异[A]背景这里使用屏蔽。可替代地，可能的是在果蝇的行为反应性测量的效果需要身份不明测定法或生长条件。在任何情况下，该建议是使所有的参数尽可能均匀镇静测定法，包括任何组的性别被明确地比较。
鉴于活酵母产生的飞食品乙醇相当大的数额，这有点令人惊讶的是食物补充活酵母并没有增加国内乙醇的苍蝇。一种可能的解释是，乙醇不能均匀产生整个食品的表面和苍蝇因此可能选择性地摄取食物没有或相对低浓度的乙醇。另外的研究将要求解决这个问题和其它可能的解释这一发现。
大量的修改，测定describ编在这里是可能取决于正在执行的实验的目标。例如，小瓶的数目在一个实验中测试，苍蝇在每个小瓶测试的数量，浓度和乙醇体积用乙醇曝光的持续时间，镇静评估，年龄和苍蝇的性别之间的时间间隔检测和标准镇静都可以修改，以适应个别实验室的需要。该建议是开始与一个或两个基团的4小瓶当初始学习实验，然后扩展到使用提供项目所需的吞吐量小瓶的数量。如果意外或长或短ST50s观察，这将是很好的做法，以保证测试的苍蝇经受短（1-5分钟）麻醉时间，被允许从麻醉中O / N收回，进行了不到10天，分别为处理过程中，并没有用乙醇溶液湿润不是物理损坏，并没有运动障碍。
只因此测定法测量乙醇的镇静灵敏度不是设计或适合用于评估其他行为反应的乙醇。像所有已知乙醇的行为范式苍蝇，此法需要苍蝇有很大程度上正常的运动能力，因此受损的运动基因型不应该被测试。该测定的另一限制是，乙醇蒸气在管形瓶中的浓度大概连续从醋酸纤维素栓药物挥发上升。虽然果蝇的内部乙醇随时间逐渐上升在所有飞行乙醇行为分析，似乎可能的是递送乙醇蒸气的浓度固定于苍蝇能改善从该测定结果的一致性。一种用于递送乙醇蒸气的固定浓度的方法尚未查明，将允许在此描述的刻度中使用的测定法。
乙醇镇静这里描述测定法是非常适合乙醇灵敏度和快速耐受18的遗传分析。的生长环境，遗传背景，浓度和乙醇体积，时间苍蝇的量在空食品小瓶花，和苍蝇使用的数量和年龄都应该被控制。假设这些参数被适当地控制，则镇静测定应适合于扭转和转发调查对于行为反应在果蝇乙醇的分子基础遗传方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A.
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L.
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
