Abstract
Alkoholbruk lidelse (NOK) er en alvorlig helseutfordring. Til tross for en stor arvelig komponent til AUD, har få gener entydig innblandet i deres etiologi. Bananflue, Drosophila melanogaster, er en kraftig modell for å utforske molekylære-genetiske mekanismene bak alkoholrelatert atferd og derfor har store løftet for å identifisere og forstå funksjonen av gener som påvirker AUD. Bruken av Drosophila modell for disse typer studier er avhengig av tilgjengeligheten av analyser som pålitelig måling av atferdsmessige respons til etanol. Denne rapporten beskriver en analyse egnet for å vurdere etanol følsomhet og rask toleranse i fluer. Etanol følsomhet målt i denne analyse er påvirket av mengden og konsentrasjonen av etanol benyttes, en rekke tidligere rapportert genetiske manipulasjoner, og også lengden av tiden fluene er plassert uten mat umiddelbart før testing. I motsetning til dette, etanol sensitivity målt i denne analysen er ikke påvirket av kraft av fly håndtering, sex av fluer, og utfylling av vekstmedium med antibiotika eller levende gjær. Tre forskjellige metoder for å kvantifisere etanol følsomhet er beskrevet, alt som fører til vesentlige utvisket etanol følsomhet resultater. Den skalerbar natur av denne analysen, kombinert med dens generelle enkelhet å sette opp og relativt lav kostnad, gjør den egnet for små og store genetisk analyse av etanol følsomhet og hurtig toleranse i Drosophila.
Introduction
Alkoholbruk lidelse (NOK) er et enormt helseproblem over hele verden (anmeldt i 1). Selv om mekanismene ikke utviklingen av AUD er komplekse, disse forstyrrelsene har en større genetisk komponent (for eksempel 2). Den store arvbarhet på AUD og de konserverte atferdsmessige responser til etanol på tvers av mange arter (anmeldt i 3,4) har generert stor interesse i å bruke genetisk modellorganismer for å undersøke involvering av spesifikke gener i etanolrelatert atferd mot bedre forstå den molekylære grunnlaget for AUD. Bananflue, Drosophila melanogaster, har dukket opp som en ledende modellorganisme for å utforske molekylærgenetiske mekanismer for etanolrelatert atferd (anmeldt i 3,4). Studier i fluer har markert roller i flere signalveier i atferdsmessige reaksjoner til etanol (anmeldt i 5). Forbløffende nok noen av gener og trasé som påvirker atferds responses til etanol i fluer har også vært innblandet i gnager etanolrelatert atferd og / eller menneskelig NOK (f.eks 6-14). Bevaring av mekanismene kjøring etanolrelatert atferd på tvers av arter, kombinert med suite av genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila modellsystemet, understreker nytten av bananflue modell for å undersøke genetikk av atferdsmessige reaksjoner til etanol.
Følsomhet 15,16 og toleranse (anmeldt i 17) til etanol hos mennesker er knyttet til utviklingen av AUD. Begge disse atferdsmessige reaksjoner til etanol kan modelleres i flyr via en rekke laboratorieanalyser (anmeldt i 3,4). Alle de flue analyser som er kjent for forfatterne er basert på enten tidsavhengig etanol-indusert sedasjon / manglende koordinasjon eller tidsavhengig utvinning fra etanol sedasjon.
I en tidligere artikkel fra vår gruppe på genetikk av etanol følsomhet og rAPID toleranse i Drosophila, ble en atferdsanalyse basert på etanoldamp-indusert sedasjon av fluer brukt 18. Testing i denne analyse ble initiert ved å overføre levende voksne fluer uten bedøvelse å tømme matvare ampuller, fangst flyr i hetteglass med et celluloseacetat plugg, tilsetning av etanol til toppen (dvs. ikke-fly siden) av celluloseacetat pluggen, og forsegling av ampullen inneholdende fluer, celluloseacetat plugg og etanol med en silikonpropp (se skjematisk i figur S3, referanse 18). Flere ampuller som representerer forskjellige grupper av fluer ble vurdert i parallell, noe som øker gjennomstrømningen av denne analyse. Ampuller fikk en anonym kode og forskere ble blindet for behandlingsgruppe for å hindre utilsiktet skjevhet i vurderingen av sedasjon. I en standard eksperiment, flyr i ampuller ble tappet forsiktig på 6 min intervaller, og etter en 30 sek utvinning, ble antall sedert fluer i hvert hetteglass telles og converted til prosent aktive fluer. Fluer absorbert etanoldamp fra celluloseacetat-pluggen på en tidsavhengig måte, forårsaker en progressiv økning i indre etanol 18 og sedasjon (cf referanse 18 og Figur 1A og 1B i denne rapport). Sedasjon i denne analysen ble operasjonelt definert som fluer (i) stående i fravær av å gå eller (ii) liggende på ryggen med eller uten flagrende vingene. Her er denne etanol sedasjon analysen beskrevet i detalj, er ytterligere driftsoptimalisering relevant å bruke det gitt, og analysen brukes til å adressere bidrag av mat tilskudd alternativer på utlegger sedasjon følsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dag Før analysen
- Samle fluer til fersk mat ampuller i grupper på 11 (single sex) under kort (1-5 min) CO 2.
- Tillat fluer for å gjenopprette O / N i matvarehetteglass på en miljømessig kontrollert rom (typisk 25 ° C, 60% relativ fuktighet, 12 timers lys / mørke-syklusen).
- Forbered etanolløsning (er) ved å fortynne rent (100%) etanol i renset (≥18 Megohm) vann til den endelige konsentrasjon (er) egnet for det planlagte forsøket. Tillat løsningen (e) for å komme tilbake til RT O / N.
Merk: Fortynning av etanol er eksoterm.
2. Dag av analysen
- For hvert hetteglass med fluer som skal testes, forberede (i) en ren, tom mat hetteglass; dvs. testing ampulle, (ii) en ny celluloseacetat plugg, (iii) en silikonpropp og (iv) 1 ml etanol-løsning (se tabell 3).
- Forberede testing rom ved å justere temperaturen til 20-25 ° C og relativ luftfuktighet på 55-65%.
- Har en annen arbeidstakertildele en unik kode til hver gruppe av ampuller og registrere koden for senere. Plassere kodede ampuller med fluer i testing rom for å akklimatisere seg for et par min.
- Merke tomme testing ampuller å matche koder på flue ampuller fra 2.3.
- Konstruer en papirkopi testing loggen ved å skrive inn kodene i kolonner (en kolonne / hetteglass) i et regneark som ligner på tabell 1.
- Bruke testing loggen som en guide, arrangere kodede mat ampuller med fluer og tomme testing ampuller i matchende arrays i testrommet.
Merk: En rimelig maksimalt antall hetteglass for å teste er 24 (dvs. 6 sett med 4 hetteglass hver). - Transfer flyr fra mat ampuller inn matchet / merket tom testing ampuller og umiddelbart sette inn cellulose acetate plugger inn i testing ampuller til cellulose acetate plugger er 2 cm under hetteglassplater.
- Heretter håndtere hver rad med fire ampuller som et sett på forskjøvet 1 minutts intervaller.
- For tiden 0 vurdering, forstå hvert hetteglass individuelt with tommel og pekefinger, trykk forsiktig på bordet tre ganger for å banke fluer til bunnen av flasken, vent 30 sek og deretter telle antall fluer som er immobile / død. Registrere antall immobile / døde fluer for hvert hetteglass på tidspunktet 0 min i papirkopi testing loggen.
- Start tidtaker telle opp kontinuerlig ved tid 0 og umiddelbart begynne å tilsette 1 ml av etanol til celluloseacetat plugger i ampullene for første rad / sett av fire ampuller. Tilsett 1 ml etanol til celluloseacetat plugger i ampuller på 5 sek intervaller i den rekkefølge de skal bli testet. Legg etanol til celluloseacetat plugger i en sirkulær bevegelse, slik at etanolen absorberes jevnt i celluloseacetat plugger. Når etanol har blitt lagt til alle fire test ampuller i settet, sette inn en silikon plugg i hvert hetteglass for å forsegle den.
- Til tider er 1, 2, 3, 4 og 5 min, tilsett 1 ml etanol til den andre, tredje, fjerde, femte og sjette sett av fire ampuller, respektivt. Fortsett å sette inn silikon propper ettertilsetning av etanol til hvert sett av fire ampuller.
- På tide 6 min, teste det første settet med 4 hetteglass ved å gripe hvert hetteglass med tommel og pekefinger, banke forsiktig på bordet tre ganger for å banke fluer til bunnen av flasken, venter 30 sekunder og deretter telle og registrere det totale antallet fluer som er bedøvet. Score flyr som bedøvet om de (i) stå på gulvet i hetteglasset, men ikke gå eller (ii) ligge på ryggen med eller uten flagrende vingene.
- Håndtere hvert hetteglass innenfor settet på 5 sek intervaller ved hjelp av planen i Tabell 2.
- Til tider 7, 8, 9, 10 og 11 min, å teste den andre, tredje, fjerde, femte og sjette sett av ampuller, henholdsvis, som utført i det første sett.
- Ved tid 12 min, teste det første sett av fire ampuller på nytt som beskrevet i 2.12, og fortsetter å teste den andre, tredje, fjerde, femte og sjette sett av ampuller på 13, 14, 15, 16 og 17 min henholdsvis.
- Fortsett testing fluer som beskrevet i 2.12 til alle fluene er sedated.
- Angi det totale antall fluer i hvert hetteglass i papirkopi testing loggen. Sensurere immobile / døde fluer på tidspunktet 0 fra det totale antall fluer.
- Beregn prosent aktive flyr på hver vurderingstidspunkt og plottedata som% aktive fluer (y-akse) som funksjon av tid (x-aksen). Quantitate etanol sedasjon ved å interpolere Sedasjon Tid 50 verdier (ST50, tid til 50% sedasjon) fra tredje polynomet eller sigmoidkurven passer eller beregne arealet under kurven.
- Sammenstille data fra dekodet ampuller og utføre statistiske analyser (f.eks enveis ANOVA med Bonferroni multippel sammenligningstest) som passer for eksperimentell design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata fra denne etanol sedasjon analysen er antallet fluer som er bedøvet som en funksjon av etanoldamp eksponeringstid. Rådata omdannes til de prosentvise aktive fluer som en funksjon av tiden (primærdata, figur 1A, B, D - F). Følsomhet for etanol sedasjon fra primærdata kan kvantifiseres som Sedasjon Tid 50 (ST50), den tiden som kreves for 50% av fluene til å bli bedøvet eller AEA under kurven (AUC), via interpolering fra kurven passer. Tidligere rapportert 18 tredje-ordens polynom kurver passer primærdataene vel som forventet (gjennomsnittlig R2 = 0,934, n = 24, figur 1A), selv om sigmoidale kurver passer primærdataene noe bedre (gjennomsnittlig R2 = 0,997, n = 24; Figur 1B). Som et alternativ til å bestemme ST50 verdier fra kurve passer, kan etanol sedasjon følsomhet fra de primære dataene også bli kvantifisert som arealunder kurven (AUC,% aktive fluer x tid) (figur 1C). Resultatene fra disse tre metoder for kvantifisering korrelerer meget godt med hverandre (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24), og er i det vesentlige umulig å skille (figur 1C), selv om enhetene er nødvendigvis er forskjellig for ST50 (min) og AUC (% aktive fluer x tid). Detaljer om alle beregninger, regneark brukes, etc. er tilgjengelig fra tilsvarende forfatter. Vær oppmerksom på at høyere og lavere verdier av ST50 (eller AUC) viser avstumpet og økt følsomhet til etanol sedasjon, henholdsvis. For konsistens med forrige rapport 18, ble ST50 verdier avledet fra tredje-ordens polynom kurve passer brukt gjennom resten av denne study.Importantly, oppdager analysen effektene av RNAi mot Cnx14D (figur 1D) og mutasjoner i SCB (figur 1E) , Aru og Hppy (figur 1F),
Under rutinemessig bruk av denne analysen, tapping av ampuller med celluloseacetat plugger fuktes med 2 ml etanol forårsaket celluloseacetat plugger for å reise mot bunnene av enkelte hetteglass i noen få individuelle eksperimenter (ikke vist), for derved potensielt å endre fluene frie plass, og konsentrasjonen av etanoldamp. I tillegg er omtrent 0,25 ml etanol nådd bunnen (dvs. fly side) av celluloseacetat pluggene når de ble fuktet med 2 ml etanol (figur 2A), øke muligheten for at fluer i disse analyser ble eksponert til etanol væske i tillegg til etanoldamp. Reduksjon av volumet av etanol i celluloseacetat pluggen fra 2 ml til 1 ml eliminert nedad migrering av cellulosee acetat plugger under analysen, selv etter kraftig banking (ikke vist) og også elimineres målbare mengder etanol løsning på bunnene av celluloseacetat plugger (figur 2A). Sedering av fluene var sensitiv til volumet av ethanol brukes selv med volum mindre enn 1 ml (figur 1A - c). Ved hjelp av 1 ml etanol bidrar derfor opprettholde en konstant åpen plass for fluene i løpet av analysen, og sikrer at væske etanol ikke blir inntatt. Fluer er derfor antagelig eksponert til etanol utelukkende som en damp i denne analysen. En ml av 85% etanol (dvs. damp fra 1 ml 85% (vol / vol) etanol) ble og 1-5 dagers gammel w [A] fluene som brukes i alle etterfølgende studier rapportert her, med mindre annet er angitt.
I forsøk med 24 ampuller, er fluer bankes forsiktig på 6 min intervaller for å tillate eksperimentator å vurdere (dvs. bla gjennom) alle hetteglass på en rimelig, foreskrevet schedule. ST50s fra studier med kontroll fluer ved hjelp av færre hetteglass og 5 min intervaller var sammenlign ST50s fra studier med 6 min intervaller (data ikke vist). Fluer vurderes for sedasjon 30 sek etter tapping for å tillate eksperimentator tid å tappe et sett med fire ampuller i rekkefølge før bestemme sedasjon status av fluer i hvert hetteglass. For å avgjøre om forskjeller i tappe vigør eller utvinning tid etter tapping innvirkning etanol sedasjon følsomhet, ST50 verdier i mannlige og kvinnelige kontroll fluer ble målt mens de tappet normalt (Regular) eller svært kraftig (Hard) og etter en standard 30 sek eller lengre 60 sek utvinning. Tapping vigør (figur 2B) og utvinning tid (figur 2C) hadde ingen målbar effekt på ST50 verdier i kontroll menn eller kvinner.
Antibiotika kan brukes til å undertrykke bakterievekst i flue mat medium. For å avgjøre om tilskudd av mat medium med antibiotika påvirker etanol sedasjon følsomhet,ST50-verdier ble målt i fluer alet for en generasjon, i nærvær eller fravær av tre antibiotika (ampicillin, 100 ug / ml; tetrasyklin, 20 ug / ml; kloramfenikol, 125 ug / ml). Oppdrett fluer på disse tre antibiotika hadde ingen effekt på etanol sedasjon følsomhet (figur 2D).
Fluer er overført til tom mat-ampuller og er derfor fratatt mat og vann i ~ 5 min-umiddelbart før den blir utsatt for etanoldamp i sedasjon analysen. For å avgjøre om mengden av tiden flyr holdes i tom mat ampuller før igangsetting analyse virkninger etanol sedasjon følsomhet, ble fluer sultet i 6 timer (minst 70 ganger av normal) og deretter ST50 verdier ble målt. Sult for 6 hr betydelig redusert ST50s i både mannlige og kvinnelige kontroll fluer (Figur 2E). Selv om effekten av sult på ST50 var relativt lite (9-14% i disse eksperimenter), mengden av tiden flyr spend i tomme ampuller før de blir utsatt for etanoldamp i analysen, skal holdes jevnt på tvers av grupper innenfor et eksperiment, og også mellom eksperimentene.
Laboratorieflue mat kan suppleres med levende gjær (f.eks, 18,20,23,24) for å fremme produksjon av avkom. For eksempel matvarer ampuller supplert med levende gjær (Saccharomyces cerevisiae) fremstilt voksne tidligere enn de med varmedrepte gjær eller ingen levende gjær (sammenlign D10-D11, hvite streker, figur 3A), selv om det totale antall avkom som produseres i løpet av 20 dager var utvisket i ampuller supplert med levende og varme drept gjær (figur 3A). For å undersøke muligheten for at levende gjær produsere meningsfulle mengder etanol på utlegger mat, ble effekten av levende gjær på (i) etanol i næringsmediet, (ii) etanol i fluer, og (iii) etanol sedasjon følsomhet i fluer målt. Mat medium supplert med levende gjær inneholdt subdelige mengder av etanol i forhold til mat supplert med varme-drepte eller ingen gjær (figur 3B). Likevel kontroll fluer dyrket på medium supplert med levende, drept eller ingen gjær hadde indistinguishably lave konsentrasjoner av intern etanol (Figur 3C). Videre etanol sedasjon følsomhet var utvisket i kontroll fluer dyrket på medium supplert med varme drept eller levende gjær (Figur 3D).
Figur 1. (AC) Sedasjon analysedataanalyse. Kontroll w [A] hunner (w 1118 isogen, Bloomington Indiana Drosophila Stock senter lager # 5905) ble utsatt for damp fra de angitte volumer av 85% (vol / vol) etanol. (A) Sedasjon tids kurs data passer med tredje- ordens polynomer. (B)Sedasjon tids kurs data passe med sigmoidale kurver. (C) Etanol sedasjon følsomhet kvantifisert som (venstre Y-akse) ST50 verdier interpolert fra tredje-ordens polynomer og sigmoidale kurver eller (høyre Y-aksen) område under kurven (AUC,% aktive fluer x tid). Etanol volum, men ikke analysemetode, påvirket etanol følsomhet (to-veis ANOVA; virkningen av volum, p <0,0001, virkningen av analysemetoden, ns; n = 8 / gruppe; AUC-data transformert 1/100 til rede for forskjellen i Størrelsen på tallene). (DF) Representant tidskursdata fra. (D) Expression of Cnx14D RNAi i nervesystemet (elav-Gal4 / v5597) avstumpet etanol følsomhet i forhold til kontroller (v5597 / + og elav-Gal4 / + ). (E og F) Mutasjon av s cb (SCB Vol2) og Aru (Aru 8,128) forbedret etanol sedasjon følsomhet og mutasjon av Hppy (HppyKG5537) avstumpet etanol sedasjon sensitivitet sammenlignet med kontroller. Data i EF ble tidligere rapportert som ST50 verdier 18.
Figur 2. Vurdering av driftsparametre i sedasjon analysen. (A) Mengde etanol i de nederste 2 mm av celluloseacetat plugger. Volumet av etanol tilsatt til toppen av celluloseacetat plugger hadde en signifikant virkning på volumet av etanol som beveget seg inn i de nederste 2 mm av celluloseacetat plugger under en uekte 60 min eksperimentet (enveis ANOVA, p <0.0001; * Bonferroni multiple sammenligningstest, 2 ml vs 0 og 1 ml, p <0,05 n = 4). Etanol ble kvantifisert som en endring i massen av cellulose acetat plugger. (B) Verken handlekraft for å klikke på hetteglassene under testing (Regular, Hard) og heller ikke sex av fluene testet berørte ST50s (to-way ANOVA; Effekten av å tappe, ns; Effekten av sex, ns; n = 12) (C) Verken utvinning tid etter tapping eller sex hadde signifikante effekter på ST50s (to-veis ANOVA;. effekten av utvinning tid, ns, effekten av kjønn, ns;. n = 6) (D) Inkludering av antibiotika (ATC; ampicillin, tetracyklin og kloramfenikol) i vekstmediet ikke hadde noen effekt på total ST50s, men det var en effekt av kjønn på ST50 (to-veis ANOVA; effekten av ATC, ns; effekten av kjønn, p = 0,001; interaksjon , ns;. n = 6) (E) Virkning av sult på etanol sedasjon følsomhet. ST50s var betydelig lavere i fluer fratatt mat og vann i 6 timer (Starved) sammenlignet med normalt matet (Fed) flyr; ST50s hos menn og kvinner ble utvisket samlet (to-veis ANOVA; effekten av sult, p <0,0001; effekten av sex, ns; n = 12; * Bonferroni flere sammenligningstester, effekten av sult hos menn og kvinner, p <0,05) .
Figur 3. Effekt av levende gjær på vekst, etanol innhold og sedasjon følsomhet. (A) Voksen avkom fra hetteglass med mat medium supplert uten gjær (No Y), varme drept gjær (Killed Y) eller levende gjær (Live Y). Hvite striper, voksen avkom dukker opp i løpet av dagene 10-11; grå barer, dager 12-20. Total, hadde en signifikant effekt på avkom produksjon (enveis ANOVAs gjær behandling, alle (10-20) dager, p <0,0001, dager 10-11, p <0,0001, dager 12-20, p = 0,0002; n = 5 ). Totalt antall avkom som produseres under alle (10-20) dager var større fra ampullene med Drept Y og Y Lever enn No Y (Bonferroni multiple sammenligningstest, p <0,05). I løpet av dagene 10-11, ampuller med Live-Y produsert mer avkom enn Drept Y og ampuller med Drept Y produsert mer avkom enn No Y (hvite striper, Bonferroni flere sammenligningstester, p <0,05). I løpet av dagene 12-20, ampuller with Killed Y produsert mer avkom enn ampuller med No Y eller Live-Y (grå søyler, Bonferroni multippel sammenligningstest, p <0,05). (B) Etanol i maten medium var betydelig høyere i ampuller supplert med Live-Y sammenlignet med ampuller med No Y og Y Drept (enveis ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni multiple sammenligningstest, p <0,05) (C) Interne etanol i w [A] hunnfluer ikke ble signifikant påvirket av kosttilskudd med gjær (en. veis ANOVA, ns, n = 5-10). Etanolinnhold i B og C bestemt som beskrevet 18 (D) ST50 verdier ble ikke signifikant påvirket av tilskudd av vekstmediet med gjær i mannlig eller kvinnelig w [A] (to-veis ANOVA;. Effekten av gjær, ns; virkning sex, ns; n = 12).
| hetteglass → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| kode → | ||||||||
| total # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabell 1: Typisk testing loggen. Se protokoll trinn 2.5.
| Vial | Tap | Vurdere |
| 1 | 6 min 0 sek | 6 min 30 sek |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sek |
| 3 | 6 min 10 sek | 6 min 40 sek |
| 4 | 6 min 15 sek | 6 min 45 sek |
Tabell 2:. Typisk tapping og testing tidsplan Se protokoll trinn 2.13.
| Navn av materiell / utstyr | Selskap | Catalog Number | Kommentarer / beskrivelse |
| mat ampuller | VWR | 89092-772 | smal |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | smal |
| silikonpropp | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanol | Farmakoterapeutisk Aaper | 111000200 | 200 bevis |
Tabell 3: Materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkle analyser som reproduserbart kvanitfisere menings fenotyper er av stor verdi for analyse av atferd. Arbeidet er beskrevet her løser flere praktiske aspekter av en analyse for å måle etanol sedasjon følsomhet og rask toleranse i Drosophila. Selv ikke et fokus på dette arbeidet, er atferdsanalyser tilrettelagt ved å opprettholde miljøet og genetisk bakgrunn konstant for testpersonene innenfor en studie. Videre sammenligninger bør vanligvis utføres mellom grupper av fluer alet og testet side-ved-side. For dette formål er alle fluene i løpet av individuelle eksperimenter i dette arbeidet hadde samme genetiske bakgrunn og ble oppdrettet side ved side under ensartede miljøbetingelser (25 ° C, 60% relativ fuktighet, 12 timers lys / mørke syklus) med standard mat medium (10 % sukrose, 3,3% maismel, 2% gjær og 1% agar) med unntak av de eksperimenter hvor maten medium eksplisitt ble manipulert.
Den ethmetanol tilsettes sedasjon analyse beskrevet her krever meget få materialer (plast ampuller, celluloseacetat plugger, silikon stoppere og etanol), som alle er billig og lett tilgjengelig fra kommersielle kilder (Tabell 3). Dette etanol sedasjon analysen er lik, og i stor grad basert på tidligere rapporterte metoder (for eksempel 6,20,25-27, omfattende anmeldt i 3,28). Selv om alle disse analysene kan anvendes for å måle etanol sedasjon følsomhet, fordelene ved analysen beskrevet her innbefatter (I) fluer ikke utsettes for væske etanol under analysen, (ii) den reduserte mulighet for at fluer kan bli viklet inn i bomull eller annet materiale i test ampulle under analysen, (iii) evnen til å teste mange grupper av fluer i parallell, og (iv) tre alternativer for målet kvantifisering av etanol følsomhet fra primære datasett. Sammen utgjør disse fordelene i stor grad eliminere muligheten for at flyr drikke etanol, that etanol kan fukte de utvendige overflatene på fluer og dermed hemmer deres generelle bevegelses evner, og at resultatene av fluer i analysen kan bli forvirret av problemer forbundet med hemmende materiale i testmiljøet. I tillegg er disse fordeler øke den totale gjennomstrømning og reproduserbarheten av analysen. Videre er etanol følsomhet målt i denne analysen ikke er påvirket av ekspresjon av endogene hvit eller den transgene markøren mini-white 18, noe som gjør den egnet for studier med transgener og genetiske bakgrunner som vanligvis brukes i Drosophila genetiske analyser.
Flere viktige parametere bør kontrolleres for å oppnå pålitelige resultater fra etanol sedasjon analyser. I tillegg til å kontrollere veksten miljø og genetisk bakgrunn av stammer som testes (se ovenfor), volumet og konsentrasjonen av etanol er selvfølgelig svært viktige for kvantifisering av etanol sensitivity. Legg merke til at fortynning av etanol i vann er eksoterm. Følgelig bør fortynnet etanolløsninger få lov til å ekvilibrere til romtemperatur før initiering av sedering-analyser. En ytterligere parameter som skal gjøres lik i gruppene blir testet er lengden av tiden som fluer er plassert i tom mat ampuller før start av sedering-analysen. Ytterligere to parametere bør også kontrolleres. Antall fluer per hetteglass bør ideelt sett være (a) den samme i alle ampuller og grupper, (b)
et tall som lett kan telles raskt, og (c) et tall stort nok til å tillate relativt glatte sedasjon tids kurs. Eleven flyr / hetteglass fungerer godt i vårt laboratorium, og er en foreslått utgangspunkt. En siste parameter for å vurdere er en alder av fluene som brukes i sedasjon analyser. Selv om ingen reproduserbare effekter av alder på etanol sedasjon følsomhet i 1-10 dager gamle fluer ble funnet (data ikke vist), synes bruken av små alderstilpassede dyrberettiget gitt det store litteraturen om aldersrelaterte atferdsendringer hos fluer 29,30.
Andre parametre synes ikke like kritisk i sedasjon analyser, i hvert fall når jeg tester kontroll fluer ved hjelp av utvalgene av parametere som er beskrevet her. Sex, styrke for å tappe, utvinning tid fra tappe, og utfylling av fly mat med antibiotika (ampicillin, tetracyklin og kloramfenikol) eller levende gjær endrer ikke etanol følsomhet målt som beskrevet her. Tilsvarende quantitating etanol følsomhet ved interpolering fra tredje-ordens polynom kurver, interpolering fra sigmoidale kurver, eller fastsettelse av AUC fra primær sedasjon tidsforløpet data fører til vesentlige utvisket tolkninger. Selv om ingen effekt av sex ble konsekvent observert i studiene som er beskrevet her, har effekten av sex på etanol følsomhet i flere Drosophila genetiske bakgrunn blitt rapportert 31. Således er det mulig at sex effektene varbare maskert av genetisk variasjon i w [A] bakgrunnen brukes her. Alternativt er det mulig at måle sex effekter på atferdsmessige reaksjoner i Drosophila krever foreløpig uidentifiserte analyse eller vekstvilkår. I alle fall er anbefalingen for å gjøre alle parametere så ensartet som mulig i sedasjon analyser, inkludert sex av eventuelle grupper er eksplisitt sammenlignet.
Gitt at levende gjær produsere betydelige mengder etanol i fly mat, det var litt overraskende at tilskudd av mat med levende gjær ikke økte interne etanol i fluer. En mulig forklaring er at etanol er ikke produsert jevnt over overflaten av maten og fluer kan derfor selektivt innta mat med ingen eller forholdsvis lave konsentrasjoner av etanol. Ytterligere studier vil være nødvendig for å løse dette og andre mulige forklaringer på dette funnet.
Et stort antall modifikasjoner av analysen described her er mulig avhengig av målene for forsøket utføres. For eksempel testet antall ampuller i et eksperiment, antall fluer som ble testet i hver ampulle, konsentrasjonen og volumet av ethanol anvendes, varigheten av etanol eksponering, tidsintervallet mellom sedasjon vurderinger, alder og kjønn av fluene undersøkt , og kriteriene for sedasjon kan alle bli endret for å dekke behovene til den enkelte laboratorium. Anbefalingen er å starte med en eller to grupper med fire ampuller når utgangspunktet lære analysen og deretter skalere opp til å bruke antall hetteglass som gir kapasiteten som kreves for prosjektet. Skulle uventet korte eller lange ST50s holdes, det ville være god praksis for å sikre at test fluer ble utsatt for kort (1-5 min) anestesi ganger, fikk lov til å komme seg etter anestesi O / N, ble det mindre enn 10 dager gamle, var ikke fysisk skadet under håndtering, ikke ble fuktet av etanol løsning, og ikke har bevegelsesvansker.
Analysen måler etanol sedasjon følsomhet bare og derfor ikke er konstruert eller egnet for å vurdere andre atferdsmessige reaksjoner til etanol. Som alle kjent etanol atferds paradigmer i fluer, krever denne analysen fluer å ha stort sett normale bevegelses evner og derfor genotyper med nedsatt bevegelse bør ikke testes. En annen begrensning av analysen er at konsentrasjonen av etanoldamp i hetteglasset er antagelig stiger kontinuerlig som legemiddel forflyktiges fra celluloseacetat pluggen. Selv fluene interne etanol stiger progressivt med tiden i alt fly etanol atferdsmessige analyser, synes det mulig at levere en fastsatt konsentrasjon av etanoldamp for fluer kan forbedre konsistensen av resultatene fra denne analyse. Har ennå ikke blitt identifisert En fremgangsmåte for å levere en fast konsentrasjon av etanoldamp som ville tillate assay som kan brukes på skalaen beskrevet her.
Etanol sedasjonAnalysen som beskrives her er velegnet for genetisk analyse av etanol følsomhet og hurtig toleranse 18. Vekstmiljø, genetisk bakgrunn, konsentrasjonen og volumet av ethanol, er mengden av tiden flyr tilbringer i tom mat ampuller, og antallet og alder av fluene som brukes bør alle bli styrt. Antar disse parametrene er under tilstrekkelig kontroll, bør sedasjon analysen være egnet for både bakover og fremover genetiske tilnærminger som undersøker det molekylære grunnlaget for atferdsmessige reaksjoner til etanol i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
