Abstract
Volwassen ratten en menselijk ruggenmerg neurale stam / progenitorcellen (NSPCs) gekweekt in growth factor-verrijkt medium maakt de proliferatie van multipotente, zelfvernieuwende en expandeerbare neurale stamcellen. In serum condities, zullen deze multipotente NSPCs differentiëren genereren neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Het geoogste weefsel enzymatisch gedissocieerd in een papaïne-EDTA-oplossing en vervolgens mechanisch gedissocieerd en gescheiden door een discontinue dichtheidsgradiënt met een enkele celsuspensie wordt uitgeplaat die in Neurobasal medium aangevuld met epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast growth factor waardoor (bFGF ) en heparine. Volwassen rat ruggenmerg NSPCs worden gekweekt als vrij zwevende neurospheres en menselijke ruggenmerg NSPCs volwassen worden gekweekt als adherente culturen. Onder deze omstandigheden, volwassen ruggenmerg NSPCs vermenigvuldigen, express markers van voorloper cellen, en kan continu worden uitgebreid op passage. Deze cellen kunnen be bestudeerd in vitro in reactie op verschillende stimuli, en exogene factoren worden gebruikt om lineage restrictie bevorderen neurale stamcel differentiatie te onderzoeken. Multipotente NSPCs of hun nageslacht kan ook worden getransplanteerd in verschillende diermodellen om regeneratief herstel te beoordelen.
Introduction
NSPCs zijn multipotent cellen toegewijd aan de neurale lijn die kan zichzelf vernieuwen en gemakkelijk uit te breiden in vitro. We verwijzen naar deze cellen als een gemengde populatie van neurale stamcellen / voorlopercellen, omdat ze geven eigenschappen van zelf-vernieuwing van multipotente stamcellen en meer beperkt voorouders. NSPCs worden gevonden in zowel de foetale en volwassen hersenen en het ruggenmerg 1,2. In de volwassen, NSPCs zijn doorgaans rustige en te verblijven binnen specifieke niches waaronder de subventriculaire zone langs de laterale ventrikels 2-4, en de periventriculaire regio rond het centrale kanaal van het ruggenmerg 5,6.
Gewoonlijk NSPCs gekweekt als vrij zwevende neurosferen of als hechtende monolagen in serumvrij medium aangevuld met EGF en bFGF, mitogenen die selecteren op de stam / voorlopercellen celpopulaties. De neurosphere assay oorspronkelijk ontwikkeld door Reynolds en Weiss 2, wordt het meest gebruikt om de cultuur en deuitbreiding van neurale stamcellen. NSPCs tonen multipotent wanneer ze uitgeplaat in growth factor-vrij medium dat serum, differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Multipotente, kan zelfvernieuwende NSPCs worden geïsoleerd en gekweekt uit het volwassen knaagdieren ruggenmerg wanneer de gekweekte weefsel omvat regio's van het centrale kanaal 6,7. Een potentieel voordeel bij het gebruik NSPCs gegenereerd uit het ruggenmerg volwassen tegenover genererende cellen uit andere gebieden is dat deze weefselspecifieke cellen meest op lijken cellen in het ruggenmerg die verloren gaan of beschadigd door verwonding of ziekte.
Eerder werk toonde aan dat neurosferen van het menselijk ruggemerg volwassen niet kon worden gepropageerd langdurige of gepasseerd om voldoende aantallen cellen te genereren 8,9. Echter, met wijzigingen in kweekomstandigheden, we meldde de uitbreiding en transplantatie van volwassen menselijke ruggenmerg afgeleid NSPCs, waaruit blijkt dat de zelf-vernieuwingen multipotent NSPCs kunnen worden geïsoleerd uit de menselijke ruggenmerg van orgaantransplantatie donors 10 volwassene. Vooral het verwijderen van de meeste witte stof tijdens dissectie en kweken van deze cellen op een hechtende substraat growth factor-verrijkt medium geselecteerd vanwege prolifererende menselijke spinal cord NSPCs volwassene. In dit protocol beschrijven we het oogsten van het ruggenmerg van volwassen rat en van mens orgaantransplantatie donors, dissectie van de periventriculaire weefsel, en het isoleren, kweken en uitbreiden van NSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures zijn goedgekeurd door de Animal Care Comite van de University Health Network, Toronto ON Canada, in overeenstemming met de in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren opgesteld door de Canadese Raad van Animal Care vastgesteld beleid. Voor het oogsten van de menselijke ruggenmerg weefsel, werd goedkeuring verkregen van de University Health Network Research Ethics Board en van de Trillium-Gift of Life Foundation die orgaandonatie toezicht houdt in Ontario, Canada.
1. Bereiding van Dissection Buffers en cultuurmedia
- Voor de isolatie van rat ruggemerg, bereiden 100 ml dissectie buffer (1x PBS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) en koel. Voor menselijke ruggenmerg bereiden 100 ml dissectie buffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) en in de koelkast.
- Bereid 100 ml serumvrij medium (SFM) en verwarm bij 37 ° C. Om SFM te bereiden, voeg 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml penicilline-streptomycine, 2% B27 en 10% hormoonmengsel tot Neurobasal-A medium. Om hormoonmengsel bereiden, maak een 1: 1 DMEM / F12 medium dat 0,6% glucose, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml insuline, 100 ug / ml apo-transferrine, 10 uM putrescine, 30 nM selenium, en 20 nM progesteron.
- Bereid de EFH groei- factor verrijkte plating media (SFM voeg 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, en 2 ug / ml heparine) en verwarm bij 37 ° C. Zorg ervoor dat de menselijke EFH bevat humaan recombinant groeifactoren (zie tabel van Materials).
2. Oogst en Dissectie van volwassen rat periventriculaire ruggenmergweefsel
- Steriliseren ontleden instrumenten in ethanol en spoel in een steriele zoutoplossing, of autoclaaf instrumenten op voorhand. Geef ratten (6-8 weken oud) een letale injectie van natriumpentobarbital (1 cc bij 65 mg / ml) of overdosis verdovingsmiddel (ie, 4% isofluorane) volgens iemands orgaan goedgekeurd dierlijke protocol. DOuse de achterkant van de rat met 70% ethanol en verwijder de huid op het dorsale oppervlak met grote dissectie schaar.
- Houd de schaar loodrecht op het dorsale oppervlak dwars snijden de wervelkolom boven de achterpoten. Kleinere schaar om longitudinaal snijden de dorsale spier ligt over de wervelkolom in een rostraal richting om de doornuitsteeksels bloot te leggen.
- Vanaf het blootgestelde caudale einde plaatst rongeurs of een kleine stompe been cutting instrument extradurally in het laterale aspect van het spinale kanaal in de ruimte tussen het ruggenmerg en de wervelkolom. Maak kleine sneden in de plaat (benige bogen links en rechts van de doornuitsteeksels aan weerszijden van de wervels) en voorzichtig afpellen de lamina naar het ruggenmerg (Figuur 1A-D) blootstellen. Zorg ervoor dat de hoek van de schoepen is ondiep en evenwijdig aan het koord, zodat de onderliggende ruggenmerg niet beschadigd.
- Doorgaan laminectomie in de rostrale richting expoe de thoracale en cervicale ruggenmerg.
- Voorzichtig accijnzen het ruggenmerg van de wervelkolom met stompe weefsel pincet en gebruik microscissors zorgvuldig te verbreken de wortels aan het snoer los. Plaats de uitgesneden ruggenmerg in een petrischaal met 4 ° C steriele rat dissectie buffer (beschreven in 1.1). Spoel het weefsel in vers bereide 4 ° C ontleden buffer en met een schaar snijden het ruggenmerg dwars in 1 cm segmenten (figuur 1E).
- Voor elk segment van weefsel, gebruik maken van een hand om het weefsel met fijne tang te houden. Met de andere hand gebruikt microscissors de bovenliggende hersenvliezen, witte stof, en de meeste van de grijze stof voorzichtig verwijderd met behulp van een dissectie scope. Alternatief Gebruik fijn pincet (Dumont # 4) om de meeste van de grijze en witte stof afgepeld, waardoor alleen de periventriculaire gebied van het ruggenmerg die ependyma en een kleine hoeveelheid omgevingslicht grijze stof (figuur 1F-H) omvat.
- Pool de ontleed periventriculaire weefsel in een 10 cm steriele petrischaal met koude rat dissectie buffer.
3. Oogst en Dissectie van volwassen menselijke periventriculaire ruggenmergweefsel
Opmerking: Menselijk ruggemerg weefsel wordt verzameld uit volwassen orgaantransplantatie donoren (donoren varieerden in leeftijd 2-60 jaar) na elkaar ingewanden verwijderd orgaantransplantatie. De Trillium-Gift of Life Programma verkrijgt toestemming voor het verwijderen van weefsel voor onderzoeksdoeleinden van de familie van de patiënt en waarschuwt ons oogsten team in een tijdig, zodat we in staat zijn om de touwen te oogsten binnen 2 uur van de aorta cross-klemmen zijn geweest. Mannelijke en vrouwelijke volwassen donoren met een negatieve serologie en er geen infecties worden geaccepteerd.
- Harvest weefsel in een steriele mode in de operatiekamer via een anterieure benadering met dezelfde voorste blootstelling al ontleed voor orgel verwijdering door het orgel transplant oogsten team.
- Expose de anterieure wervelkolom door de terugtrekking met grote rib spreaders en grote peddel retractors van de overige weefsels en organen, inclusief de grote bloedvaten.
- Gebruik een sternale zaag gemonteerd lange mes doorsnijden de tussenwervelschijven in de rostrale en caudale uiteinden van de gewenste lengte van de wervelkolom moet worden weggesneden. Angle de zaag ongeveer 45 ° mediaal een driehoekige trog van het laterale deel van de wervels te stoppen net voor het wervelkanaal te snijden.
- Verwijder en bloc de mediale aspecten van de wervels van de gewenste segmenten met behulp van gebogen Osteotomen en hamer zorg om te voorkomen dat het doorsnijden van de dura. Til voorzichtig de dura bedekt ruggenmerg met getande tang en scherp incise de rostrale en caudale uiteinden van het snoer. Gebruik lange schaar en tang om bilateraal doorsnijden van de individuele wortels.
- Plaats de uitgesneden segment van het ruggenmerg bij 4 °; C steriele buffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) in een grote reageerbuis voor het transport naar de weefselkweek kamer.
- Opmerking: In het algemeen, een 3-6 cm segment van het ruggenmerg van de thoracale en / of midden-tot-laag thoracaal los zijn in de operatiekamer onder steriele omstandigheden zo snel mogelijk na het staken van de circulatie en in koude steriele buffer . De tijd tussen het stoppen van de circulatie en verwijdering van het ruggenmerg varieert met de tijd die nodig is om de beoogde organen voor donatie oogsten en varieerde van 45 min tot 2 uur. Als het hart en de longen werden ook verwijderd, kan de dissectie ver rostraal worden om een gedeelte van de onderste cervicale snoer oogsten ook.
- Ontleden menselijke ruggenmergweefsel zo snel mogelijk na het oogsten, in het algemeen binnen 3 uur. Verwijder de dura en andere meninges met een pincet. Spoel het ruggenmerg weefsel in vers bereide 4 ° C dissectie buffer engesneden dwarsrichting in 1 cm segmenten.
- Met behulp van een dissectie scope, uitsnijden van de bovenliggende hersenvliezen, witte stof, en de meeste van de grijze materie met behulp tissue tang, fijne pincet en microscissors voor elk weefselsegment. Verzamel de periventriculaire ontleed weefsel, waarbij de ependyma en een kleine hoeveelheid omgevingslicht grijze materie, in een 10 cm steriele petrischaal met koude menselijke dissectie buffer omvat.
4. Isolatie en kweken van volwassen rat en Human Spinal Cord NSPCs
- Voer de volgende stappen aseptisch in een laminaire stroming kap.
- Hak de ontleed rat of menselijke periventriculaire weefsel in 1 mm 3 stuks met microscissors.
- Enzymatisch dissociëren gehakt weefsel met proteolytische enzymen met de papaïne dissociatie kit zoals aangegeven in de tabel van materialen / reagentia. NB: reagens componenten zijn 4 flesjes; Vial 1: Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papaïne met dagram L-cysteïne en EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: ovomucoïd proteaseremmer bovine serum albumine (BSA).
Opmerking: Opmerking: Papaïne is een sulfhydryl protease dat brede specificiteit voor eiwitsubstraten heeft. De papaïne hierin wordt afgeleid uit de latex van de Carica papaja vaste degradeert meest eiwitsubstraten uitgebreider dan alvleesklier proteases. Tijdens het dissociatieproces er een celbeschadiging veroorzaakt DNA dat moet worden vrijgegeven in de dissociatie medium dat viscositeit verhogen en pipetteren moeilijk. Aldus DNase is opgenomen in de cel isolatiewerkwijze het DNA verteren zonder schade aan de intacte cellen. Ovomucoids zijn glycoproteïne proteaseremmers gebruikt om de papaïne-activiteit na de dissociatiestap remmen.
- Bij het eerste gebruik, reconstrueren de albumine ovomucoïde remmer mengsel (flacon 4) met 32 ml EBSS (flacon 1) en bewaar bij 4 ° C en gebruik voor de daaropvolgende isolaties.Opmerking: Dit levert een oplossing voor een effectieve concentratie van 10 mg ovomucoid remmer en 10 mg per ml albumine.
- Voeg 5 ml EBSS (vial 1) een papaïne flacon (vial 2), waarbij een oplossing 20 eenheden papaïne / ml in 1 mM L-cysteïne met 0,5 mM EDTA. Controleer dat de papaïne oplossing wordt helder volledig is opgelost, het flesje enigerlei andere wijze in een 37 ° C waterbad gedurende tien minuten tot de papaïne volledig is opgelost volledige activiteit van het enzym te garanderen.
- Voeg 500 pl EBSS (vial 1) een DNase flacon (vial 3) en meng voorzichtig zoals DNase gevoelig is voor denaturatie afschuiving. Voeg 250 ul van DNase oplossing van de injectieflacon met papaïne, wat resulteert in een eindconcentratie van bij benadering 20 eenheden / ml papaïne en 0,005% DNase. Sla het saldo van de DNase flacon om later te gebruiken.
- Plaats gehakt ratten of menselijk weefsel in de papaïne oplossing bereid in stap 4.4. Voor het menselijk isolatie weefsel, verdeeld gehakt weefsel even tussen tweepapaïne flacons (ongeveer 0,2 g / flacon).
- Incubeer bij 37 ° C onder constant roeren op een rocker platform om het weefsel dissociëren in de geactiveerde papaïne oplossing. Incubeer rat weefsel voor 45 min tot 1 uur, en menselijk weefsel gedurende 1-2 uur afhankelijk van de hoeveelheid van gehakt weefsel, ongeveer 0,2 - 0,4 g respectievelijk.
- Tritureer het mengsel met een pipet 10 ml geven overblijvende weefselstukken dissociëren om een troebele celsuspensie verkregen. Breng de celsuspensie (geen enkele stukjes gedissocieerde weefsel niet inbegrepen) in een steriele 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer de gepelleteerde cellen in medium dat ovomucoid een papaïne inhibitor.
- Bereid de ovomucoïde oplossing door het mengen van 2,7 ml EBSS (flacon 1) met 300 ul van de opgeloste albumine-ovomucoïde inhibitor oplossing (flacon 4) in een 15 ml conische buis. Voeg 150 ul van DNase oplossing (flacon 3) opgeslagen in stap 4.4 hierboven.
- Verwijder het supernatant vande celpellets en onmiddellijk resuspendeer de celpellet in het verdunde DNase albumine-inhibitor mengsel.
- Afzonderlijke intacte cellen van celmembranen door centrifugatie door een discontinue stapsgewijze gradiënt dichtheid.
- Bereid de discontinue gradiënt dichtheid door toevoeging van 5 ml van albumine-inhibitor oplossing (flacon 4) in een 15 ml buis en pipetteren 5 ml, voorzichtig en langzaam laag de celsuspensie (bereid zoals hierboven beschreven in stap 4.8) bovenop het albumine-remmeroplossing.
- Centrifugeer bij 70 xg gedurende 6 min bij RT.
- Opmerking: De interface tussen de twee lagen van het verloop moet duidelijk zichtbaar zijn, hoewel minimaal mengen bij deze grens heeft geen invloed op het resultaat. Membraanfragmenten blijven op het grensvlak en gedissocieerde cellen pellet op de bodem van de buis.
- Voor cellen rat, gooi het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml rat EFH medium (voorverwarmd bij 37 ° C).Telling levende celdichtheid met een hemocytometer en plaat van de cellen in een T25 kolf met een dichtheid van 10 cellen / ul in EFH. De typische opbrengst aan cellen van rattenweefsel is ongeveer 2 x 10 6 cellen met ongeveer 80% viability.If klonale cultures gewenst, zaadcellen met een dichtheid van minder dan 10 cellen / ul. Incubeer de kolven bij 37 ° C in 5% CO 2 en laat de kweken groeien ongestoord gedurende 1 week om aggregatie van bollen te voorkomen.
- Voor humane cellen, gooi het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml humaan EFH medium (voorverwarmd bij 37 ° C). Filter de celsuspensie door een 40 pm nylon celzeef gevolgd door 30 ml EFH tegen myeline en celmembraan fragmenten te verwijderen. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in 1 ml EFH medium.
- Telling levende celdichtheid met een hemocytometer en plaat het humane cellen in 6-putjes bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in een totaal volumevan 5 ml EFH / goed. De typische opbrengst aan cellen uit menselijk weefsel is ongeveer 1 x 10 6 cellen met ongeveer 70% levensvatbaarheid. Pre-coat putten met een aanhanger substraat zoals Matrigel (zie opmerking hieronder). Verdun in een verhouding van 40 pl Matrigel: 1 ml SFM.
- Opmerking: Als alternatief kunnen andere hechtende substraten zoals poly-D-lysine / laminine, fibronectine of collageen gebruikt.
- Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO 2 en laat de kweken ongestoord groeien 1 week.
5. Passage van volwassen rat en de menselijke ruggenmerg NSPCs
- Rat NSPCs zullen kleine neurospheres ongeveer 70 micrometer in diameter binnen 1 week van de initiële zaaien vormen; passage rat NSPCs wekelijks door het verzamelen van de celsuspensie, centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min, en mechanisch wrijven de celpellet de neurosferen dissociëren.
- Zaad van de gescheiden cellen in T25 kolven met verse rat EFH medium. Als alternatief,Gebruik 50% geconditioneerd medium rat voor passage. De typische opbrengst van NSPCs rat bij passage is ongeveer 5 x 10 6 cellen die exponentieel toeneemt met de passage nummer.
- Voor de menselijke culturen, één week na de eerste plating, vervangt de helft van het kweekmedium met verse EFH tweemaal per week om de cellen te hechten aan het substraat. In het algemeen 1-2 weken later nadat de cellen aan het substraat hebben gehecht, vervangt het gehele volume cultuurmedium tweemaal per week met verse EFH.
- Subcultuur cellen voordat confluentie tussen 4-8 weken.
- Subcultuur cellen door het losmaken van de cellen enzymatisch substraat (zie tabel of Materials) met 2 ml enzym per put gedurende ongeveer 10 minuten bij 37 ° C. Verzamel celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 min, en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 1 ml vers bereide EFH medium.
- Telling levende cellen met een hemocytometer en plaat de cellen in 6-well kweekplaten (pre-coated zoals beschreven in stap 4.12) bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in een totaal volume van 5 ml EFH / putje. De typische opbrengst van de menselijke NSPCs bij passage is ongeveer 2 x 10 6 cellen en in het algemeen zal dit verdubbelen met een passage. Algemeen onderhouden culturen 50% geconditioneerd medium EFH 2-3 maal per week tussen passage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volwassen rat ruggenmerg cellen gekweekt in suspensie cultuur in EFH medium zullen kleine neurosferen (kolonies van ongedifferentieerde cellen) binnen 1 week van de eerste platen vormen. In primaire kweken, de meeste van de cellen uitgeplaat sterven en growth factor-responsieve stamcellen prolifereren en worden geselecteerd in de EFH medium. Bij passage 3, zal er tal vrij zwevende neurospheres ongeveer 100 urn in diameter (figuur 2A). Neurospheres zijn rond en fase-licht en sterk vergroot worden cilia-achtige microspikes uit steekt cellen aan de buitenkant van sferen die kenmerkend neurosferen tegenstelling klontjes celresten (figuur 2B) zijn. De typische opbrengst aan cellen van rattenweefsel is ongeveer 2 x 10 6 cellen met ongeveer 80% levensvatbaarheid. De neurosferen mag niet geënt bij te hoge dichtheid aggregatie van celgroepen voorkomen. Ook grote neurospheres geworden moeilijk te scheiden en de cellen zullen wordennecrotische in het midden van de bol. Dit zal ook gebeuren als culturen te lang voordat passage worden gelaten. In EFH cultuur, volwassen rat ruggenmerg NSPCs proliferatie (figuur 2C) en nestine tot expressie (Figuur 2D) een marker voor voorlopercellen en lage niveaus van volwassen neurale markers (data niet getoond).
Volwassen mens ruggenmerg NSPC culturen niet zo snel groeien als de rat NSPC culturen. Als menselijke spinal cord cellen aanvankelijk worden gekweekt in suspensie, zullen ze aggregaten en onregelmatige clusters van kleine aantallen cellen in combinatie met puin (figuur 3A) te vormen. Latere passage van deze culturen is niet bevorderlijk voor verrijking van de NSPC bevolking. Wanneer de humane cellen worden uitgeplaat in EFH op een hechtende monolaag, de groeifactor reagerende NSPCs hechten aan het substraat (Figuur 3B) en daaropvolgende vervanging van media verwijdert myeline en celresten (Figuur 3C). De typische opbrengst aan cel van menselijk weefsel is ongeveer 1 x 10 6 cellen met ongeveer 70% levensvatbaarheid. Wanneer de mens NSPC culturen raken zowel gevestigd als een aanhanger monolaag, de NSPCs kan dan ook worden verzilverd in suspensie culturen vrij zwevende neurosferen vormen. In EFH cultuur, volwassen menselijke spinal cord NSPCs proliferatie (Figuur 3D) en nestine tot expressie (Figuur 3E) en Sox2 (figuur 3F), een transcriptiefactor aangetoond door neurale stamcellen, en zeer lage niveaus van volwassen neurale markers (gegevens worden uitgedrukt niet laten zien).
Figuur 1. Laminectomie van rat ruggenmerg en dissectie van periventriculaire regio. (A) Bij het blootgestelde caudale einde van het ruggenmerg worden rongeurs extradurally ingebracht in de laterale zijde van het wervelkanaal. (B) kleine sneden gemaakt in de lamina op elke side van de wervels en de lamina wordt zorgvuldig afgepeld naar het ruggenmerg blootstellen. (C) De blootgestelde ruggenmerg na laminectomie. (D) Schematische voorstelling van thoracale wervel dwarsdoorsnede toont spinal cord and location deelstukken Bij laminectomie (afgebeeld met rode stippellijnen). De laminae en processus spinosus (gearceerde gebied) worden verwijderd. (E) Het ruggenmerg overdwars gesneden in 1 cm segmenten. (F) De overliggende meninges, witte stof, en de meeste van de grijze stof wordt zorgvuldig verwijderd met microscissors. (G ) Gehakt periventriculaire weefsel. (H) dwarsdoorsnede van de rat ruggenmerg gekleurd met Luxol snel blauw en hemotoxyline en eosine met gestippelde lijnen tonen ontleed periventriculaire regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Volwassen rat ruggemerg NSPCs. (A) door passage 3 worden talrijke neurosferen waargenomen bij ratten ruggenmerg NSPCs worden gekweekt in vrij zwevende suspensiekweek. (B) Neurosferen zijn fase-licht en microspikes uitsteekt uit het neurospheres (pijlen ) zijn duidelijk zichtbaar bij een hoge vergrotingsfactor. (C) los neurosferen (doorgang 3, dag 4) worden uitgeplaat op Matrigel-beklede putjes in EFH medium, vaste en immunostained en tegengekleurd met Hoechst om kernen (blauw) te visualiseren. In EFH omstandigheden, volwassen rat ruggenmerg NSPCs vermenigvuldigen (zoals getoond met Ki67 immunokleuring), en (D) in de eerste plaats uitdrukkelijk nestin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figuur 3. volwassen mens ruggenmerg NSPCs. (A) Als aanvankelijk vergulde in de cultuur flessen, weet de menselijke ruggenmerg NSPCs volwassene niet goed groeien. Primaire vrij zwevende culturen EFH medium (13 dagen na uitplaten) vertonen aggregaten van cellen en afval. (B) In tegenstelling, in primaire adherente culturen EFH, NSPCs hebben de Matrigel substraat (pijlen) bevestigd, getoond bij 17 dagen na plating, en (C) en 41 dagen in vitro. (D) In EFH medium menselijk ruggemerg NSPCs volwassen prolifereren, zoals getoond met Ki67 immunokleuring (26 dagen in vitro), en voornamelijk express (E) nestin (26 dagen vitro) en (F) Sox2 (66 dagen in vitro). Kernen zijn tegengekleurd met Hoechst (blauw)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens de dissectie van de rat ruggenmergweefsel zorg moet worden genomen het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het uitvoeren van de laminectomie. Het is gemakkelijker om de periventriculaire weefsel te isoleren wanneer de ruggenmergsegmenten intact. Het weefsel segmenten moet volledig worden ondergedompeld in de dissectie buffer en de bovenliggende hersenvliezen en witte stof kan worden weggesneden als longitudinale stroken met microscissors. Als alternatief kan fijn weefsel tang worden gebruikt om de witte stof afpellen.
Voor de isolatie procedure voor NSPCs, gebruikten we een papaïne-EDTA dissociatie methode gecombineerd met een mechanische trituratie aan de rat en de mens ruggenmergweefsel distantiëren. In vergelijking met andere proteasen, papaïne minder schadelijk maar effectief, zoals eerder aangetoond met dissociatie van postnatale ratten corticale neuronen 11. We vonden dat dissociatie slechts mechanische trituratie, vaak met foetaal weefsel is niet zo effectief bij weefsel van de volwassene. Na the enzymatische dissociatie, mechanische trituratie belangrijk te breken van de resterende weefsel fragmenten. Trituratie met repetitieve cel dispersie met een pipet moet worden uitgevoerd zodat er geen resterend intact weefselfragmenten resulteert in een bewolkte celsuspensie. Echter, fijnwrijven dient niet te sterk uitgevoerd om borrelen van de celsuspensie en de resulterende celdood voorkomen.
Bij passage wordt neurospheres rat gedissocieerd in een suspensie van losse cellen door mechanische trituratie, zoals oorspronkelijk werd beschreven 2. Echter, neurospheres worden gedissocieerd met behulp van enzymatische methoden zoals trypsine-EDTA dat niet celoppervlakreceptoren zal beschadigen of bol vorming zolang enzymatische blootstelling korte 12.
Er zijn een aantal voordelen in het gebruik van de neurosphere assay cultuur NSPCs. Het is relatief eenvoudig, reproduceerbaar en maakt de snelle expansie van neurale stamcellen CELls 2,12. Echter, neurospheres zijn heterogene bestaan voornamelijk uit voorlopercellen die beperkter en slechts een klein aantal stamcellen. Verschillende factoren zoals celdichtheid en passage techniek kan het fenotype van de culturen beïnvloeden en neurosferen kan ook deel van voorlopercellen 13. Neurospheres zijn zeer beweeglijk en kunnen smelten zelfs bij lage celdichtheid 14. Zo hoeft het aantal neurosferen in kweek niet het aantal stamcellen vertegenwoordigen. Neurale stamcellen te onderscheiden van progenitorcellen, moet men de neurale kolonievormende cel assay 15,16 gebruiken.
Volwassen rat ruggenmerg NSPCs groeien evenals neurospheres in suspensie cultuur in EFH aangevuld medium en zijn gemakkelijk uit te breiden. Daarentegen hebben wij gevonden dat volwassen menselijke spinal cord NSPCs beter groeien als hechtende monolayer 10. Menselijke hersenen afgeleide neurale stamcellen kunnen worden gehandhaafd op lange termijn in monolaag culture in een chemisch gedefinieerd medium bij aanwezigheid van mitogenen die hun proliferatievermogen 17,18 promoten. Zoals beschreven in dit protocol, kan NSPCs worden geïsoleerd uit de humane volwassen ruggenmerg van orgaantransplantatie donors en gepasseerd en uitgebreid als een hechtende monolayer in de aanwezigheid van EGF, bFGF en heparine 10. Het is gemakkelijker om NSPCs jongere dan oudere donoren te isoleren als de cellen sneller groeien, hoewel NSPCs nog zou kunnen worden geïsoleerd van donoren aan onze maximale leeftijd van 60 jaar 10. We hebben verschillende hechtende substraten zoals Matrigel, fibronectine, collageen type I en poly-D-lysine / laminine onderzocht en hebben deze effectief voor hechting van volwassen menselijke spinal cord NSPCs 10 zijn. Aanvankelijk zowel neurosphere en adherente culturen bevatten celaggregaten, puin en dode cellen. Maar dit puin wordt geleidelijk verwijderd met subkweken en de groei-factor verrijkt Neurobasal medium kiest voor de uitdijende NSPCs. Ook puin en myeline verontreiniging kan worden verminderd met een zorgvuldige dissectie en verwijdering van de witte stof van het ruggenmerg weefsel segmenten. Filteren van de resulterende celsuspensie door een zeef voorafgaand aan plating verwijdert ook myeline.
We hebben gekweekte volwassen mens ruggenmerg NSPCs als aanhangend monolagen gedurende ten minste 9 maanden met ongeveer 10 passages, maar bij oudere culturen is er een verhoogd risico op karyotypische afwijkingen. We voerden karyotype analyse van menselijke NSPCs gekweekt gedurende 4 maanden en vond een normale diploïde karyotype zonder chromosomale afwijkingen (data niet getoond). We vonden ook dat celproliferatie en het vermogen om te differentiëren tot oligodendrocyten af met verhoogde tijd in kweek. Bijvoorbeeld, de relatieve percentage O4 positieve cellen daalde van 1,3% bij 1 maand in kweek tot 0,01% na 4 maanden in kweek 10. Zowel de rat en menselijke NSPCs vatbaar zijn voor cryopreservatie met behulp van standaard bevriezen voldaanhods en vertonen geen significante verschillen in fenotypische profiel.
De isolatie en uitbreiding van multipotente NSPCs in cultuur zorgt voor verschillende in vitro toepassingen, waaronder het onderzoek van verschillende factoren op volwassen neurale stamcellen differentiatie. Verhoogde aantallen NSPCs kunnen worden gegenereerd in vitro en getransplanteerd in diermodellen zoals ruggenmergletsel, beroerte, neurodegeneratieve ziekte en de respons van deze herstellende neurale stamcellen in vivo onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
