Abstract
Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.
Introduction
NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark 1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel 2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks 5,6.
Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss 2 entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals 6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit.
Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender 10 isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.
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Protocol
Alle Tierverfahren werden von der Animal Care Committee der Universität Health Network, Toronto ON Kanada zugelassen, in Übereinstimmung mit den Richtlinien im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die Canadian Council on Animal Care vorbereitet etabliert. Für die Ernte der menschlichen Rückenmarksgewebe, wurde die Genehmigung der University Health Network Research Ethics Verwaltungsrat und von der Trillium-Gift of Life Foundation, die Organspende in Ontario, Kanada beaufsichtigt erhalten.
1. Herstellung von Dissection Puffer und Kultur Medien
- Für die Isolierung von Rattenrückenmark, bereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x PBS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. Für den menschlichen Rückenmark vorbereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern.
- Vorbereitung 100 ml serumfreies Medium (SFM) und warm bei 37 ° C. Um SFM vorzubereiten, fügen Sie 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin, 2% B27 und 10% Hormon Mix Neurobasal-A-Medium. Hormon-Mix anzusetzen, stellen eine 1: 1 DMEM / F12-Medium, das 0,6% Glucose, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml Insulin, 100 ug / ml Apo-Transferrin, 10 & mgr; M Putrescin, 30 nM Selen, und 20 nM Progesteron.
- Bereiten Sie die EFH Wachstumsfaktor-angereicherten Plattenmedien (zum SFM mit 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF und 2 ug / ml Heparin) und warm bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die menschliche EFH enthält humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien).
2. Holzernte und Dissektion der erwachsenen Ratte Periventrikuläre Rückenmarksgewebe
- Sterilisieren Sezieren Instrumente in Ethanol und spülen in steriler Kochsalzlösung oder Autoklav Instrumente im Voraus. Geben rat (6-8 Wochen alt) eine tödliche Injektion von Natriumpentobarbital (1 cc bei 65 mg / ml) oder Überdosierung von Narkose (dh 4% Isofluran) nach einem Institut des genehmigten Tier Protokoll. DOuse die Rückseite der Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut an der dorsalen Oberfläche mit großen Dissektion Schere.
- Halten der Schere senkrecht zur dorsalen Fläche quer geschnitten die Wirbelsäule über die Hinterbeine. Verwenden Sie kleinere Schere längs geschnitten die Rückenmuskel über der Wirbelsäule in einem rostral Richtung, um die Dornfortsätze aus.
- Beginnend an der exponierten kaudalen Ende, legen Sie Rongeure oder eine kleine stumpfe Knochenschneidinstrument extradural in der lateralen Seite des Spinalkanals in den Raum zwischen dem Rückenmark und Wirbelsäule. Machen Sie kleine Schnitte in die Lamina (knöcherne Bogen nach links und rechts von den Dornfortsätzen auf jeder Seite der Wirbel) und vorsichtig abziehen der Lamina des Rückenmarks (1A-D) aus. Stellen Sie sicher, der Winkel der Flügel flach ist und parallel zu der Schnur so die zugrunde liegende Rückenmark nicht beschädigt wird.
- Weiter Laminektomie im rostralen Richtung Ausstellungene die Brust- und Halsmark.
- Auszuschneiden vorsichtig das Rückenmark von der Wirbelsäule mit stumpfen Pinzette Gewebe und Nutzung Mikroschere, sorgfältig zu trennen, die Wurzeln, um das Kabel zu lösen. Legen Sie die ausgeschnittenen Rückenmark in eine Petrischale mit 4 ° C sterile Ratten Dissektion Puffer (oben in 1.1 beschrieben). Spülen Sie das Gewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Sezieren Puffer und mit einer Schere schneiden das Rückenmark in Querrichtung in 1 cm Segmente (1E).
- Für jedes Segment des Gewebes, mit einer Hand, um das Gewebe mit einer feinen Pinzette zu halten. Mit der anderen Hand, verwenden Mikroschere, um vorsichtig die darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz mit Hilfe einer Binokular. Alternativ können Sie feinen Pinzette (Dumont # 4), die meisten der grauen und weißen Substanz abziehen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks, die das Ependym und eine kleine Menge des umgebenden grauen Substanz (1F-H) umfasst.
- Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe in eine 10 cm sterile Petrischale mit kaltem Ratte Dissektion Puffer.
3. Ernte und Dissektion der erwachsenen Menschen Periventrikuläre Rückenmarksgewebe
Hinweis: Human Rückenmarksgewebe von erwachsenen Organtransplantation Spender geerntet (Spender waren im Alter von 2 bis 60 Jahre), nachdem die anderen Organe für Organtransplantation entfernt. Das Trillium-Gift of Life Programm erhält Zustimmung für die Entfernung von Gewebe für Forschungszwecke aus der Familie des Patienten und teilt unsere Ernteteam rechtzeitig, so dass wir in der Lage, um die Kabel innerhalb von 2 Stunden nach der Aorta Querspann ernten. Männlichen und weiblichen erwachsenen Spendern mit negativer Serologie und keine Infektionen werden akzeptiert.
- Ernte-Gewebe steril in den OP-Saal durch einen ventralen Zugang unter Verwendung der gleichen vorderen Exposition bereits für Organentnahme von der Orgel transp seziertlant Ernteteam.
- Setzen die vordere Wirbelsäule durch Abfahren mit großen Rippenverteiler und große Paddel Retraktoren der übrigen Gewebe und Organe, einschließlich der großen Blutgefäße.
- Verwenden eine Brustbeinsäge mit einer langen Klinge, um durch die Bandscheiben in den rostralen und kaudalen Enden der gewünschten Länge der Wirbelsäule geschnitten zu resezierenden montiert. Angle die Säge etwa 45 ° nach medial um eine dreieckige Trog von der Seitenteil der Wirbelkörper bis kurz vor den Wirbelkanal zu schneiden.
- Entfernen Sie en bloc die medialen Aspekte der Wirbelkörper der gewünschten Segmente mit Hilfe von gekrümmten Osteotome und Hammer wobei darauf zu vermeiden, schneiden durch die Dura. Heben Sie dann vorsichtig die Dura gedeckt Rückenmark mit Zahnzange und scharf einzuschneiden rostralen und kaudalen Enden der Schnur. Verwenden Sie lange Schere und Pinzette auf bilateraler Ebene durchschneiden die einzelnen Wurzeln.
- Legen Sie das ausgeschnittene Segment des Rückenmarks in 4 °; C sterile Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) in einem großen Teströhrchen für den Transport zum Zellkulturraum.
- Hinweis: Im Allgemeinen wird eine 3-6 cm Segment des Rückenmarks von der oberen Brust- und / oder mittleren bis niedrigen Niveau des Brustraums wird im Operationssaal unter sterilen Bedingungen entfernt so schnell wie möglich nach Beendigung der Durchblutung und in kalten sterilen Puffer abgelegt . Die Zeit zwischen der Einstellung der Zirkulation und Entfernung des Rückenmarks verstrichenen Zeit variiert mit der Zeit, die erforderlich, um die gezielte Spenderorgane ernten und ist von 45 Minuten bis 2 Stunden reicht. Wenn das Herz und die Lungen wurden ebenfalls entfernt wurde, kann die Dissektion weit rostral genommen, um einen Teil des unteren Halsmark sowie zu ernten.
- Sezieren des menschlichen Rückenmarksgewebe so bald wie möglich nach der Ernte in der Regel innerhalb von 3 Std. Entfernen Sie die Dura und andere Hirnhäute mit einer Pinzette. Spülen Sie die Rückenmarksgewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Dissektion Puffer undSchnitt quer in 1 cm Segmente.
- Mit Hilfe eines Binokular, Verbrauchs der darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz unter Verwendung von Gewebezange, feinen Pinzette und Mikroschere für jede Gewebesegment. Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe, das Ependym und eine kleine Menge von umliegenden grauen Substanz, in eine sterile 10 cm Petrischale mit kaltem menschlichen Dissektion Puffer enthält.
4. Isolierung und Kultivierung von adulten Ratten und Human Spinal Cord NSPC
- Führen Sie folgende Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer Steril.
- Blatt vor den seziert Ratte oder des Menschen periventrikuläre Gewebe in 1 mm 3 Stück mit Mikroschere.
- Enzymatisch dissoziiert des zerkleinerten Gewebes mit proteolytischen Enzymen unter Verwendung des Papain-Dissoziierung Kit wie in der Tabelle von Materialien / Reagenzien angegeben. Hinweis: Reagenz Komponenten umfassen 4 Durchstechflaschen; Vial 1: Earles Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papain mit deg L-Cystein und EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: Ovomucoid Proteaseinhibitor mit Rinderserumalbumin (BSA).
Hinweis: Hinweis: Papain ist ein Sulfhydryl-Protease, die breite Spezifität für Proteinsubstrate hat. Die Papain hier wird aus dem Latex aus der Carica papaya Pflanze gewonnen und verschlechtert die meisten Proteinsubstraten umfangreicher als Pankreas-Proteasen. Während der Dissoziation Prozess gibt es einige Zellschäden verursachen DNA in die Dissoziation Medium, Viskosität zu erhöhen und machen Pipettieren schwierig erscheinen. Somit wird DNase in der Zellisolierungsverfahren eingeschlossen, um die DNA, ohne die intakten Zellen zu verdauen. Ovomucoide sind Glykoprotein-Protease-Inhibitoren verwendet, um die Papain-Aktivität nach der Dissoziation Schritt hemmen.
- Beim ersten Gebrauch rekonstituieren das Albumin Ovomucoid Inhibitormischung (Fläschchen 4) mit 32 ml EBSS (Flasche 1), und dann bei 4 ° C und verwenden Sie für die anschließende Isolierungen.Anmerkung: Dies ergibt eine Lösung mit einer wirksamen Konzentration von 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml.
- 5 ml EBSS (Gefäß 1) zu einer Papain Fläschchen (Ampulle 2), wodurch man eine Lösung mit 20 Einheiten Papain / ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Prüfen, ob der Papain-Lösung klar erscheint, wenn vollständig gelöst ist, da sonst die Küvette in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten, bis das Papain vollständig gelöst ist, um volle Aktivität des Enzyms zu gewährleisten.
- Fügen Sie 500 ul EBSS (Flasche 1) zu einer DNase Fläschchen (Fläschchen 3) und vorsichtig mischen, wie DNase ist empfindlich gegenüber Denaturierung zu scheren. Man 250 ul der DNase-Lösung in das Fläschchen, das die Papain, was zu einer Endkonzentration von etwa 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase. Speichern Sie die Balance des DNase Fläschchen für die spätere Verwendung.
- Legen Sie die gehackte Ratte oder menschlichen Gewebe in der Papain-Lösung, wie in Schritt 4.4 oben hergestellt. Für das menschliche Gewebe Isolierung, teilen Sie die zerkleinerte Gewebe gleichmäßig zwischen zweiPapain Fläschchen (etwa 0,2 g / Fläschchen).
- Inkubieren bei 37 ° C unter konstantem Rühren auf einer Schüttelplattform, um das Gewebe in der aktivierten Papainlösung dissoziieren. Inkubieren Rattengewebe für 45 min bis 1 h und menschlichem Gewebe für 1 bis 2 Stunden in Abhängigkeit von der Menge an zerkleinertem Gewebe, etwa 0,2 bis 0,4 g.
- Verreiben des Gemisches mit einer 10 ml-Pipette, um alle verbleibenden Gewebestücke zu trennen, um eine trübe Zellsuspension zu ergeben. Übertragen der Zellsuspension (keine Stücke undissoziierten Tissues) in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT.
- Resuspendieren der pelletierten Zellen in Medium, das Ovomucoid, eine Papain-Inhibitor.
- Vorbereiten des Ovomucoids durch Mischen von 2,7 ml EBSS (Gefäß 1) mit 300 ul des rekonstituierten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor (Fläschchen 4) in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie 150 ul DNase-Lösung (Fläschchen 3) in Schritt 4.4 oben gespeichert.
- Überstand verwerfen ausDie pelletierten Zellen und unmittelbar Zellpellet im verdünnten DNase albuminInhibitorGemisch.
- Separate intakten Zellen aus Zellmembranen durch Zentrifugation durch einen einzigen Schritt diskontinuierlichen Dichtegradienten.
- Vorbereitung der diskontinuierliche Dichtegradient durch Zugabe von 5 ml Albumin-Inhibitorlösung (Flasche 4) in ein 15 ml-Röhrchen und unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam Schicht der Zellsuspension (hergestellt wie oben in Stufe 4.8 beschrieben) auf der Oberseite das Albumin-Inhibitorlösung.
- Zentrifugieren bei 70 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur.
- Anmerkung: Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten leicht sichtbar zu sein, aber nur minimale Vermischung an dieser Grenze wirkt sich nicht auf das Ergebnis. Membranfragmente verbleiben an der Grenzfläche und dissoziierte Zellen Pellet am Boden des Röhrchens.
- Für Rattenzellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml Ratten EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt).Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einen T25 Kulturflaschen in einer Dichte von 10 Zellen / ul in EFH. Die typische Ausbeute an Zellen von Rattengewebe ist ungefähr 2 × 10 6 Zellen mit etwa 80% viability.If klonalen Kulturen erwünscht, Samenzellen in einer Dichte von weniger als 10 Zellen / ul. Die Kolben werden bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen wachsen ungestört für 1 Woche, um die Aggregation von Kügelchen zu vermeiden.
- Für menschliche Zellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 10 ml menschlichen EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt). Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Nylon Zellsieb anschließend mit 30 ml EFH Myelin und Zellmembranfragmente zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml EFH Medium.
- Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die menschlichen Zellen in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 10 5 Zellen / Vertiefung in einem Gesamtvolumenvon 5 ml EFH / well. Die typische Ausbeute von Zellen, die aus menschlichem Gewebe beträgt ungefähr 1 × 10 6 Zellen mit ca. 70% Lebensfähigkeit. Vorstrich Vertiefungen mit einer haftenden Substrat, wie Matrigel (siehe Anmerkung unten). Verdünne in einem Verhältnis von 40 ul Matrigel: 1 ml SFM.
- Anmerkung: Alternativ können andere adhärente Substrate, wie Poly-D-Lysin / Laminin, Fibronectin oder Kollagen verwendet werden.
- Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in 5% CO 2 und damit die Kulturen für 1 Woche ungestört wachsen.
5. Passagieren von Adult Ratte und Mensch Rückenmark NSPC
- Rat NSPC werden kleine Neurosphären etwa 70 & mgr; m im Durchmesser innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Aussaat zu bilden; Passage Ratte NSPC wöchentlich durch das Sammeln der Zellsuspension, Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min, und mechanisch Verreiben des Zellpellet, um die Neurosphären dissoziieren.
- Samen der dissoziierten Zellen in T25-Kolben mit frischem Ratten EFH Medium. Alternativverwenden 50% konditioniert Ratte Medium für Passagieren. Die typische Ausbeute aus Ratten NSPC bei Passagierung etwa 5 x 10 6 Zellen, die exponentiell mit der Durchlaufhäufigkeit steigt.
- Für die menschlichen Kulturen, eine Woche nach der ersten Beschichtung, ersetzen die Hälfte des Kulturmediums mit frischen EFH zweimal wöchentlich, um damit die Zellen an dem Substrat haften. Im Allgemeinen 1-2 Wochen später, wenn die Zellen an dem Substrat befestigt, ersetzen Sie das gesamte Volumen des Kulturmediums zweimal pro Woche mit frischen EFH.
- Subculture Zellen vor Erreichen der Konfluenz zwischen 4 - 8 Wochen.
- Subkultur-Zellen durch Ablösen Zellen aus dem Substrat enzymatisch (siehe Tabelle der Materialien) mit 2 ml Enzym pro Well für ca. 10 min bei 37 ° C inkubiert. Sammeln Zellsuspension, Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, und sanft Zellpellet in 1 ml frisch zubereitete EFH Medium.
- Graf lebende Zellen mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in 6-Well-Kulturplatten (pre-coATED wie oben in Schritt 4.12) in einer Dichte von 10 5 Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 5 ml EFH / Vertiefung. Die typische Ausbeute an Human NSPC bei Passagierung etwa 2 x 10 6 Zellen und in der Regel wird dies mit dem Durchgang zu verdoppeln. Im Allgemeinen halten die Kulturen mit 50% konditioniertem Medium EFH 2-3 mal pro Woche zwischen Passagieren.
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Representative Results
Erwachsenen Ratte Rückenmark-Zellen in Suspensionskultur in EFH Medium gezüchtet werden kleine Neurosphären (Kolonien von undifferenzierten Zellen) innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Plattierung zu bilden. In Primärkulturen, die meisten Zellen ausplattiert sterben und Wachstumsfaktor-responsive Stammzellen proliferieren und werden in der EFH Medium ausgewählt. Durch den Durchgang 3, wird es zahlreiche frei schwebenden Neurosphären etwa 100 & mgr; m im Durchmesser (2A) sein. Neurospheres sind rund und Phasen hell und bei starker Vergrößerung sind Zilien artigen micro gesehen von Zellen auf der Außenseite der Kügelchen, die charakteristisch für die Neurosphären Gegensatz Klumpen von Zelldebris (2B) hervorstehen. Die typische Ausbeute an Zellen von Rattengewebe ist ungefähr 2 × 10 6 Zellen mit ca. 80% Lebensfähigkeit. Die Neurosphären sollte nicht bei einer zu hohen Dichte ausgesät werden, um die Aggregation von Zellclustern zu vermeiden. Außerdem werden große Neurosphären schwer distanzieren und Zellen werdennekrotischen im Mittelpunkt der Kugel. Dies wird auch auftreten, wenn Kulturen werden zu lange, bevor Passagieren. In EFH Kultur, erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC vermehren (2C) und Express Nestin (2D) eine Markierung für Vorläuferzellen, und das niedrige Niveau der reifen neuronalen Marker (Daten nicht gezeigt).
Erwachsenen menschlichen Rückenmarks NSPC Kulturen nicht so schnell wachsen, wie Ratte NSPC Kulturen. Wenn die menschliche Rückenmark-Zellen werden zunächst in Suspension kultiviert werden sie Aggregate und unregelmäßige Cluster kleiner Anzahlen von Zellen in Verbindung mit Schmutz (3A) zu bilden. Nachfolgende Passagierung dieser Kulturen fördert nicht Anreicherung des NSPC Bevölkerung. Jedoch, wenn die menschlichen Zellen in EFH auf einer anhaftenden Monoschicht überzogen, die Wachstumsfaktor-responsive NSPC dem Substrat (3B) und nachfolgende Medienersatz anhaften entfernt Myelin und Zelldebris (3C). Die typische Ausbeute von cells aus menschlichem Gewebe beträgt ungefähr 1 × 10 6 Zellen mit ca. 70% Lebensfähigkeit. Wenn die menschliche NSPC Kulturen geworden auch als Anhänger Monoschicht hergestellt, die NSPC kann dann auch in Suspensionskulturen überzogen werden, um frei schwebende Neurosphären zu bilden. In EFH Kultur, Erwachsene Rückenmark NSPC menschlichen vermehren (3D) und Express Nestin (3E) und Sox2 (3F), ein Transkriptionsfaktor, dargestellt von neuralen Stammzellen, und ein sehr niedriges Niveau der reifen neuronalen Marker (Daten ausgedrückt werden nicht gezeigt).
Abbildung 1. Laminectomy von Rattenrückenmark und Dissektion periventrikuläre Region. (A) an der freiliegenden kaudalen Ende des Rückenmarks, rongeurs sind extradural in der lateralen Seite des Wirbelkanals eingelegt. (B) kleine Einschnitte in die Lamina an jedem Side der Wirbel und der Lamina wird vorsichtig abgezogen, um das Rückenmark aus. (C) Das freigelegte Halsmark nach Laminektomie. (D) Schematische Darstellung des Brustwirbelquerschnitt, der das Rückenmark und die Lage der Schnitte für Laminektomie gemacht (dargestellt mit roten gestrichelten Linien). Die Plättchen und Dornfortsatz (schattierter Bereich) entfernt werden. (E) Das Rückenmark ist in Querrichtung in 1 cm Segmente geschnitten. (F) der darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz und die meisten der grauen Substanz wird vorsichtig mit Mikroschere entfernt. (G ) Gehacktes periventrikuläre Gewebe. (H) Horizontalschnitt von Rattenrückenmark mit Luxol schnell blau und Hemotoxylin und Eosin mit gestrichelten Linien zeigen seziert periventrikuläre Region gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Adult Rattenrückenmark NSPC. (A) durch den Durchgang 3 sind zahlreiche Neurosphären beobachtet, wenn Rattenrückenmark NSPC sind in frei schwebende Suspensionskultur gezüchtet. (B) Neurospheres phasen hell und micro aus den Neurosphären vorsteht (Pfeile ) sind offensichtlich bei hoher Vergrößerung. (C) dissoziierten Neurosphären (Durchgang 3, Tag 4) auf Matrigel beschichteten Vertiefungen in EFH Medium plattiert, fixiert und immungefärbt und mit Hoechst gegengefärbt, um Zellkerne (blau) zu visualisieren. In EFH Bedingungen vermehren erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC (wie bei Ki67 Immunfärbung gezeigt) und (D) in erster Linie express Nestin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Adult menschlichen Rückenmark NSPC. (A) Bei der zunächst in Kulturflaschen überzogen, weiß menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen nicht gut zu wachsen. Primäre frei schwebenden Kulturen in EFH Medium (13 Tage nach der Plattierung) zeigen Aggregate von Zellen und Zelltrümmer. (B) im Gegensatz dazu in der Primär adhärenten Kulturen in EFH NSPC wurden dem Matrigel Substrat (Pfeile) befestigt ist, um 17 Tage nach der gezeigten Überzug, und (C) mit 41 Tagen in vitro. (D) In EFH Medium menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen vermehren, wie mit Ki67 Immunfärbung gezeigt (26 Tagen in vitro gezeigt) und in erster Linie express (E) Nestin (26 Tage vitro gezeigt) und (F) Sox2 (66 Tage in vitro gezeigt). Kerne mit Hoechst (blau) gegengefärbt./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße Substanz ablösen werden.
Zur Isolierung Verfahren NSPC verwendeten wir ein Papain-EDTA Dissoziation Verfahren kombiniert mit mechanischen Verreibung den Ratten- und menschlichen Gewebe des Rückenmarks zu dissoziieren. Im Vergleich zu anderen Proteasen, Papain ist weniger schädlich aber effektiv, wie sie zuvor mit Dissoziation des postnatalen kortikale Neuronen der Ratte 11 gezeigt. Wir fanden, daß Dissoziation nur mechanische Verreibung, oft mit fötalem Gewebe verwendet wird, ist nicht so effektiv mit dem Gewebe von Erwachsenen. Nach the enzymatische Dissoziation, mechanische Zerreiben ist wichtig, um die verbleibenden Gewebefragmente aufzubrechen. Verreiben mit sich wiederholenden Zelldispersion mit einer Pipette durchgeführt werden sollte, so dass keine verbleibenden intakten Gewebefragmente was eine trübe Zellsuspension. Jedoch sollte Verreiben nicht zu stark ausgeführt werden, um eine Blasenbildung des Zellsuspension und der resultierenden Zelltod zu verhindern.
Für Passagieren werden Ratten- Neurosphären in eine Einzelzellsuspension über mechanische Zerreiben dissoziiert, wie ursprünglich beschrieben 2. Jedoch kann auch unter Verwendung von Neurosphären enzymatische Methoden, wie Trypsin-EDTA nicht Zelloberflächenrezeptoren beschädigen oder Kugelbildung solange enzymatische Belichtung kurz 12 getrennt werden.
Es gibt eine Anzahl von Vorteilen bei der Verwendung der Neurosphäre Assay zur Kultur NSPC. Es ist relativ einfach, reproduzierbar und erlaubt die rasche Expansion der neuronalen Stamm cells 2,12. Jedoch sind Neurospheres heterogenen primär von Vorläuferzellen, die mehr eingeschränkt und nur eine kleine Anzahl von Stammzellen besteht. Mehrere Faktoren, wie Zelldichte und Passagierung Technik kann der Phänotyp der Kulturen beeinflussen und Neurosphären können auch aus Vorläuferzellen 13 bilden. Neurosphären sind sehr beweglich und kann sogar unter Bedingungen niedriger Zelldichte 14 zu verschmelzen. Somit muss die Anzahl der Neurosphären in Kultur nicht um die Anzahl von Stammzellen. Neuralen Stammzellen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden, sollte man die neural-Kolonie-bildenden Zellassay 15,16 zu verwenden.
Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC gut wachsen als Neurosphären in Suspensionskultur in EFH ergänzten Medium und sind leicht erweiterbar. Im Gegensatz dazu haben wir gefunden, dass erwachsenen menschlichen Rückenmarks NSPC besser wachsen als adhärente Monolayer 10. Menschlichen Gehirn stamm neuralen Stammzellen kann langfristig in Mono Kult aufrechterhalten werdenure in einem chemisch definierten Medium in Gegenwart von Mitogenen, die ihre proliferative Kapazität 17,18 fördern. Dem in diesem Protokoll beschrieben, kann NSPC aus adulten menschlichen Rückenmark von Organtransplantat Spendern isoliert und passagiert werden, und als Haftmonolayer in Gegenwart von EGF, bFGF und Heparin 10 erweitert. Es ist einfacher, NSPC von jüngeren als bei älteren Spendern zu isolieren, wenn die Zellen schneller ausbauen, obwohl NSPC konnte immer noch von Spendern isoliert werden bis zu unserem maximalen Alter von 60 Jahren 10. Wir haben eine Vielzahl von anhaftenden Substraten wie Matrigel, Fibronectin, Collagen Typ I und Poly-D-Lysin / Laminin untersucht und gefunden, diese wirksam zur Anhaftung von erwachsenen menschlichen Rückenmarks NSPC 10 betragen. Zunächst sowohl Neurosphäre und adhärenten Kulturen enthalten Zellaggregaten, Schmutz und abgestorbene Zellen. Doch diese Trümmer fortschreitend mit Subkultivierung und dem Wachstumsfaktor-angereicherten Neurobasalmedium wählt für die wuchernden NSPC entfernt. Auch Schmutz und Myelin Kontamination mit sorgfältiger Dissektion und Entfernen der weißen Substanz aus dem Rückenmark Gewebesegmente reduziert werden. Filtrieren der resultierenden Zellsuspension durch ein Sieb vor dem Plattieren entfernt auch Myelin.
Wir haben kultivierten menschlichen Kabel NSPC als adhärente Monolagen für mindestens 9 Monate Erwachsener Rücken mit etwa 10 Passagen, auch wenn in älteren Kulturen gibt es ein erhöhtes Risiko für karyotypischen Anomalien. Wir führten Karyotyp-Analyse auf die menschliche NSPC für 4 Monate kultiviert und fand einen normalen diploiden Karyotyp ohne Chromosomenanomalien (Daten nicht gezeigt). Wir fanden auch, daß die Zellproliferation und die Fähigkeit, zu Oligodendrozyten differen sank mit erhöhter Zeit in Kultur. Zum Beispiel der relative Anteil der O4-positive Zellen verringerte sich von 1,3% nach 1 Monat in der Kultur 0,01% nach 4 Monaten in Kultur 10. Sowohl Ratte und Mensch NSPC zugänglich sind Kryokonservierung unter Verwendung von Standard Einfrieren erfülltHods und zeigen keine signifikanten Unterschiede in phänotypische Profil.
Die Isolierung und Expansion multi NSPC in Kultur ermöglicht für mehrere in-vitro-Anwendungen einschließlich der Prüfung verschiedener Faktoren auf adulten neuralen Stammzelldifferenzierung. Eine erhöhte Anzahl von NSPC kann in vitro erzeugt und in Tiermodellen transplantiert wie Rückenmarksverletzung, Schlaganfall, neurodegenerative Erkrankungen, die reparative Reaktion dieser Nervenstammzellen in vivo zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
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- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
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