Introduction
Solide svulster spre på tre måter: direkte invasjon, lymfatisk spredt, og hematogenic spredt. Men det er en fjerde hjelp av kreften spredt som ofte oversett, formidling langs nerver. Kreft nevrale invasjon (CNI) er en velkjent rute for kreft spredning, spesielt i kreft i hode og hals, en prostata 2, 3 og bukspyttkjertel. 4-8 CNI forekommer hos mer enn 80% av personer med bukspyttkjertelen adenokarsinom, ledende til retroperitoneal tumor spres gjennom cøliaki ganglion nerver. Disse neurotropisk kreftcellene har en enestående evne til å migrere i én retning langs nervene mot sentralnervesystemet (CNS). 9. Dette funn tyder på at perinevral mikromiljøet kan utnyttes av kreftceller, som gir forhold som bidrar til ondartet vekst.
En av de få in vitro modeller for CNI forskning er ryggmargen (DRG) / kreftcelle modell. denne model blir ofte brukt for å studere den parakrine interaksjonen mellom neurale stromaceller og kreftceller. 10-18 I denne modellen, mus eller humane kreftcellelinjer blir dyrket i ekstracellulær matriks (ECM) som grenser til preparater av ferskt dissosiert dyrket DRG.
Denne videoen artikkelen viser anvendelsen av in vitro CNI i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fire til seks uker gammelt C57BL / CJ mus (Harlan, Jerusalem, Israel) ble brukt i forsøket i henhold til Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care spesifikasjoner. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité og Department of Agriculture forskrifter.
1. Høsting ryggmargen
- Avlive mus ved hjelp av en CO 2 kammer. Unngå halshugging som det kan forårsake skade på ganglion røtter på grunn av skjærkrefter. Herfra på, utføre alle trinnene under sterile forhold.
- Sug dyret ned med 70% etanol. Dette trinn er viktig for sterilisering og for å hindre håret fra å dra gjennom de indre organer.
- La musen til å tørke fra etanol. Unngå berøring av etanol med de indre organer på grunn av nevrotoksisitet.
- Etter tørking musen, plasserer den ved hjelp av pinner i liggende stilling(Forsiden ned). Sett pinnene på hver bakben og forbena.
- Bruk pinsett, lage en midtlinjen snitt strekker craniocaudally fra bakre nakken til korsryggen. Deretter heve dermal flaps bilateralt ved hjelp av pinsett og avsløre underhud.
- Palpate mus skallen til n kraniecervikal krysset. Ved hjelp av saks vinkelrett på dyr, skjære gjennom livmorhalsen muskler og ryggraden ved kraniocervikale kobling (7 th halsvirvler), ved hjelp av tunge tang. Dissekere ryggraden caudally Vesenet ryggen med tunge tang inntil nå lumbar nivå (hind lemmer nivå).
- Utfør en komplett haletran ved lumbalcolumna nivå (5. lumbale ryggvirvler) med tunge tang.
- Rull musen over (forsiden opp). Det er ikke nødvendig å dekke snittet siden DRG ekstraheres fra lavere nivåer, og vertebrale ikke den cervikale.
- Kutt ned på midtlinjen fra halsen til magen, trekkehud sidelengs og deretter kuttet for å åpne peritoneum.
- Fjern de indre organer inne i peritoneum (lever, milt, bukspyttkjertel, mage og tarm) en bloc. Deretter fjerner de retroperitoneale organer (dvs., nyrer og bukspyttkjertel). Kranialt, åpne brystveggen.
- Ved hjelp av pinsett og en kirurgisk kniv, kuttet ribbene, slik at 5 mm av ribber bilateralt bort fra ryggraden. Ved dette punktet, er ryggraden adskilt fra resten av kroppen.
- Vask virvelsøylen fra blod med kald (4 ° C) spyling med fosfatbufret saltvann (PBS) to ganger.
2. Å isolere de dorsale nerveknutene (DRG)
- Bruk en stereomikroskop med 4X forstørrelse.
- Plasser ryggraden på en ikke-klebende non absorberende plattform (Telfa / nylon). Plasser ryggraden forsiden opp på samme cranio-caudal orientering.
- Fjern eventuelle spinal muskler og bindevev. Bruk ribbeina som et landemerke for nerver som dela ryggraden. Ribs også beskytte nervene fra de kirurgiske verktøy. DRG er plassert på livmorhalsen, thorax og lumbale områder av ryggvirvlene.
- Deretter bruker saks kutte ryggvirvel kroppen i midtlinjen og eksponere ryggmargen og DRG røtter ved forsiktig lateral tilbaketrekking av ryggvirvel kroppen.
- I interkostalrom, følger det perifere nerve medialt langs ribbe lateralt for DRG.
- Identifiser DRG. Det ser ut som plommen i 'stekt egg' liggende på nerve.
- Skjær interkostalrom nerve distalt til den DRG forlater 2-3 mm av nerve distalt for ganglia, som skal brukes til tilbaketrekning. Denne "hale" vil bli fjernet etter høsting.
- Ta tak i nerve ved hjelp av pinsett. Klemming DRG kroppen i seg selv vil forårsake nervecelleskade og bør unngås.
- Tilnærming DRG proximally langs sin tilknytning til ryggmargen, via sin fremre og bakre røtter.
- Påfør forsiktig tilbaketrekking til DRG ved å trekke efskjellige nerve (interkostalrom nerve stubben) lateralt, og kutte fremre og bakre røtter nær DRG.
- Hold DRG i en 35 mm petriskål fylt med frisk, iskald DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), 1% penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 1% natriumpyruvat.
3. Implantasjon i petriskål
- Utfør de neste trinnene på isen ved hjelp av pre-avkjølt pipettespisser for å hindre ECM størkning.
- Under en stereomikroskop på 2-4x forstørrelse, plasser en 35 mm glassbunn petriskål på et papir rutenett.
VIKTIG: Arbeidet med is for å holde ECM i flytende tilstand. Skape en flekk 1 mm i diameter (ca. 20 ul) av vekstfaktor-utarmet ECM ved midten av risten. - Under direkte visualisering, plasser DRG i sentrum av ECM sted nær bunnen av fatet.
Merk: kreftceller som brukes i denne protokollen er murine bukspyttkjertelkreft celler (KPC) etahed fra nylig isolerte vevsprøver fra KPC mus som beskrevet andre steder 19. - Høste 40.000 kreftceller fra løpende kulturer, vaske dem en gang med PBS, og resuspender dem i 40 ul ECM på is.
- Under direkte visualisering av gitter ved hjelp av et stereomikroskop tiltak 500 um i hver retning fra DRG. På dette punktet sakte frø 10.000 celler / 10 mL ECM. Bruke en 2-10 mL forhåndsavkjølt spiss for å injisere cellene i nærheten av fatet bunnen, unngår deres spredning i matriksen eller løsgjøring av matrisen. (Figur 1).
- La fatet i en laminær strømningshette i 10-15 min for å størkne. Unngå ECM tørking.
- Tilsett langsomt DMEM, fremstilt som tidligere nevnt, mot sideveggen av platen. Tilsett nok medium til å dekke ECM (ca. 2 ml).
- Sett fatet tilbake til inkubator ved 37 ° C.
- Erstatt medium med frisk medium på den påfølgende dagen.
- Bytt medium hver 2 dager. </ Li>
4. Data Acquisition, Time-lapse Videomicroscopy
- På dag 7 etter implantasjon, ta parabolen for tiden lapse mikroskopi. Legg merke til at enkelte celler kan kreve oppkjøp tidligere på grunn av raskere migrasjon.
- Under direkte bildebehandling, sett formen i et lukket miljø ved en gjennomsnittstemperatur på 37 ± 0,1 ° C og 5% CO 2.
- Ta opp cellene ved hjelp av en ladningskoblet anordning kamera plassert på mikroskop.
- Ta digitaliserte bilder hver 10 min for opp til 72 timer for å følge cellebevegelse fra tre til seks forskjellige celler.
- Erstatt medium etter 24 timer.
- Utfør datainnsamling og enkel analyse ved hjelp av mikroskop programvare.
5. Data Analysis
- For mer avanserte applikasjoner (dvs. celle sporing i 2D eller 3D) bruke spesialisert programvare (for eksempel Imaris 4D). Merk: Denne programvaren bestemmer xy koordinatene til en celle påenhver tid, sammen med avstanden fra origo, og hastigheten av bevegelse.
- Beregn midlere hastighet ved å måle reiseavstanden mellom påfølgende stillinger i 10 min intervaller. Beregn Forward Migration Index (FMI), som er avstanden i cellen front fra neurite og beskriver den ensrettede bevegelse av cellene mot DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av videomikroskopi bildebehandling, kan DRG sees spirende neurites 5-7 dager etter implantasjon mens kreftcellene migrere bort fra sine kolonier mot DRG. Ved den 7. dagen etter implantasjon, kreftcellene kommer i berøring med neuritter (figur 2).
Fremover-migrasjon indeks på kreft i bukspyttkjertelen celler anvendt i protokollen er 3-4 ganger høyere enn for andre cellelinjer (QLL2, B16F) (Figur 3a). Figur 3b viser en representativ X og Y koordinat graf som viser oppgraderingsveg av en KPC kreftcelle i kontakt med nerve; time-lapse videomicroscopy analyse viste forskjeller i bevegelse fremover, men ikke hastighet mellom KPC celler og ikke-invaderende celler (Figur 3c-d).
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 52990 / 52990fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skjematisk illustrasjon av protokollen Steps Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Cancer Cell Invasion Langs neuroner fra DRG (a) DRG (øverst) og kreftceller (nederst) på dag 0 etter poding (5X forstørrelse). (B) DRG og kreft celler på dag 7 etter såing (5x forstørrelse). (C) Kreftceller vandrer langs DRG nevroner (piler). Alle stolper representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Dorsal Root Ganglion (DRG) Nerveceller Frem CNI (a) Nerve invasjon indeks over MiaPaCa2 kreftceller, KPC celler, QLL2 og NIH3T3 celler. (B) Et koordinatsystem kurve som viser migrering banen til en kreftcelle KPC i kontakt med nerve (rød) og QLL2 celle (purpur). Y og X-koordinatene vises. (N = 12-20 i hver gruppe). (C) Analyse av avstanden fra opprinnelsen til å migrere QLL2 kreftceller med aksonal kontakt og (d) KPC kreftceller (n = 20). Retningen av migrasjon var stadig mot nerve ganglion. P-verdier i (a) ble beregnet ved tosidige Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer en in vitro modell som sammenfatter kreftmikromiljøet i det nevrale nisje, DRG-modellen. Videoen viser alle trinnene fra og gjenkjenne anatomiske landemerker som for eksempel DRG i musen, sin utvinning, og til slutt, dens dyrking i ECM. Co-dyrking DRG sammen med kreftceller blir også presentert. Det er ingen andre modeller for in vitro perinevral invasjon forskning beskrevet i litteraturen, noe som gjør denne modellen avgjørende for å studere den perinevral nisje mikromiljøet in vitro.
Protokollen presenteres i videoen har to kritiske trinn. Først bør man være forsiktig når du holder fast nerve ved siden av DRG kroppen (trinn 2.7 i protokollen). Fatte eller knipe på DRG kan føre til irreversible mekanisk eller iskemisk skade på DRG hindrer den fra å vokse og spirende når seedet i petriskål. Den andre kritiske trinn er implantasjonav kreftceller i petriskål inne i ECM. Det er viktig å frø cellene langsomt og forsiktig, for å unngå den flytende celler og deres spredt over petriskålen. Formålet med implantasjon er å lokalisere cellene på ett sted, for å lette sporing av sin bevegelse (avstand og retning).
Når etablert modellen mikromiljøet kan modifiseres i henhold til den testede hypotesen. For eksempel legge til en tredje cellekultur til petriskål (for eksempel ikke-kreftceller) gjør det mulig for forskeren å sammenligne neurotropic migrasjon egenskapene til ulike celler. Videre kan forskeren bruke forskjellige tilstander (dvs. temperatur, fuktighet, løselige faktorer, etc.) og undersøke deres virkning på celler invasjonen evne.
DRG-modellen gjør det mulig for forskeren å studere samspillet mellom kreftceller og nerver. Det er også brukt for tiden lapse eksperimenter der morfologiskendringer i perinevral nisje er demonstrert i en tidsmessig måte. Videre kan neuroinvasive cellene bli utsatt for ulike behandlinger og deres effekt på samspillet med neurites av ganglia kan vurderes.
Ikke alle cellelinje som er egnet for den DRG-modellen. De bør være kreftceller med den iboende evne til å invadere gjennom nerve og å degradere ECM. Videre er oppmerksom på at hver kreftcelletype har forskjellige invasjons egenskaper og slik at tiden cellene forventes å komme i kontakt med den DRG neuritter varierer. For eksempel, The KPC cellene brukte vi trenger ca 7 dager for å invadere gjennom ECM mot DRG mens MiaPaca celler (humane bukspyttkjertelen adenokarcinomceller) trenger bare 72-96 timer å lage den kontakten.
En begrensning av denne modellen inkluderer mulig inkompatibilitet med menneskeceller. På grunn av sin bruk av mus DRG, mus-human protein-protein interaksjon kan ikke alltid bli demonstrert når humenneske kreftceller blir anvendt. Når planlegger å bruke denne modellen, sammen med de to forskjellige arter, bør det homologi av det undersøkte proteinet skal testes, og hvis det er høy homologi analysen er ment å være egnet for evaluering av protein-protein interaksjoner. I tillegg bør det tas i betraktning at den DRG-analysen som foreslått i denne protokollen representerer det neurale mikromiljøet, inkludert andre celler, ikke bare nevroner (dvs. Schwannske celler, fibroblaster, makrofager, etc.). Derfor kan spesifikke cellepopulasjoner ikke testes spesifikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Operating microscope | Leica | M205 | |
| Time Lapse System | Zeiss | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Surgical blade | Sigma-Aldrich | Z309036 | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3271 | |
| 35 mm Petri dishes, glass bottom | de groot | 60-627860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| 70% ethanol | Sigma | ||
| Cold PBS | Biological industries | 02-023-1A | |
| DMEM | Biological industries | 01-055-1A | |
| FCS | Rhenium | 10108165 | |
| Penicillin and streptomycin | Biological industries | 01-031-1B | |
| Sodium Pyruvate | Biological industries | 03-042-1B | |
| L-Glutamine | Biological industries | 03-020-1B | |
| Growth factor-depleted matrigel | Trevigen | 3433-005-01 |
References
- Carter, R. L., Foster, C. S., Dinsdale, E. A., Pittam, M. R. Perineural spread by squamous carcinomas of the head and neck, a morphological study using antiaxonal and antimyelin monoclonal antibodies. J Clin Pathol. 36, 269-275 (1983).
- Beard, C. J., et al. Perineural invasion is associated with increased relapse after external beam radiotherapy for men with low-risk prostate cancer and may be a marker for occult, high-grade cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 19-24 (2004).
- Maru, N., Ohori, M., Kattan, M. W., Scardino, P. T., Wheeler, T. M. Prognostic significance of the diameter of perineural invasion in radical prostatectomy specimens. Hum Pathol. 32, 828-833 (2001).
- Ceyhan, G. O., et al. Pancreatic neuropathy and neuropathic pain--a comprehensive pathomorphological study of 546 cases. Gastroenterology. 136, 177-186 (2009).
- Ceyhan, G. O., et al. The neurotrophic factor artemin promotes pancreatic cancer invasion. Ann Surg. 244, 274-281 (2006).
- Takahashi, T., et al. Perineural invasion by ductal adenocarcinoma of the pancreas. J Surg Oncol. 65, 164-170 (1997).
- Zhu, Z., et al. Nerve growth factor expression correlates with perineural invasion and pain in human pancreatic cancer. J Clin Oncol. 17, 2419-2428 (1999).
- Hirai, I., et al. Perineural invasion in pancreatic cancer. Pancreas. 24, 15-25 (2005).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- Kelly, K., et al. Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 effectively treats prostate carcinomas with neural invasion while preserving nerve function. FASEB J. 22, 1839-1848 (2008).
- Dai, H., et al. Enhanced survival in perineural invasion of pancreatic cancer, an in vitro approach. Hum Pathol. 38, 299-307 (2007).
- Ayala, G. E., et al. Cancer-related axonogenesis and neurogenesis in prostate cancer. Clin Cancer Res. 14, 7593-7603 (2008).
- Ayala, G. E., et al. Stromal antiapoptotic paracrine loop in perineural invasion of prostatic carcinoma. Cancer Res. 66, 5159-5164 (2006).
- Ceyhan, G. O., et al. Neural invasion in pancreatic cancer, a mutual tropism between neurons and cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 374, 442-447 (2008).
- Bapat, A. A., Hostetter, G., Von Hoff, D. D., Han, H. Perineural invasion and associated pain in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 11, 695-707 (2011).
- Ketterer, K., et al. Reverse transcription-PCR analysis of laser-captured cells points to potential paracrine and autocrine actions of neurotrophins in pancreatic cancer. Clin Cancer Res. 9, 5127-5136 (2003).
- Gil, Z., et al. Nerve-sparing therapy with oncolytic herpes virus for cancers with neural invasion. Clin Cancer Res. 13, 6479-6485 (2007).
- Gil, Z., et al. Paracrine regulation of pancreatic cancer cell invasion by peripheral nerves. J Natl Cancer Inst. 102, 107-118 (2010).
- Weizman, N., et al. Macrophages mediate gemcitabine resistance of pancreatic adenocarcinoma by upregulating cytidinedeaminase. Oncogene. 33, 3812-3819 (2014).
