Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En metode til Trigonometriske Modellering årstidsvariationernes demonstreret med multipel sklerose Relapse data

Published: December 9, 2015 doi: 10.3791/53169
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2
1Department of Neurology, Royal Melbourne Hospital, 2Department of Medicine (RMH), The University of Melbourne, 3Department of Neurology, Ulster Hospital, 4National Centre for Epidemiology and Population Health, Australian National University

Introduction

Den mest almindelige form af dissemineret sklerose (MS) er recidiverende-remitterende multipel sklerose (RRMS). RRMS er karakteriseret ved episodiske forringelser i neurologisk funktion, efterfulgt af delvis eller fuldstændig helbredelse. Globalt, forekomsten og udbredelsen af MS stige med stigende afstand fra ækvator i begge halvkugler. 1-3 Hvorvidt frekvensen af tilbagefald begivenheder, der opstår specielt i RRMS også variere med breddegrad, og om der er nogen underliggende sæsonvariation i en sådan forening, er fortsat uklart. Til dato undersøgelser udforsker sæsonudsving i tilbagefald timing har været begrænset til enkelte kliniske centre, begrænse eventuelle slutninger vedrørende sæsonmæssige tendenser i tilbagefald timing til ensomme geografiske placeringer og dermed ude af stand til at udforske bredere breddegrader påvirkninger. 4-14 Disse undersøgelser er blevet yderligere begrænset af lille prøve størrelser og sparsomme tilbagefald data. En 2000 meta-analyse af ti undersøgelser fra kliniske centre i Europe, USA og Canada, hvor hver undersøgelse omfattede mindst tredive sager rapportering sæsonen-of-debut af tilbagefald, beskrev en klar sæsonmæssige udvikling i timingen af tilbagefald debut, med tilbagefald topper i foråret og med en vinter trug 4 . Lignende cykliske årlige tendenser i debut er blevet observeret i efterfølgende, omend mindre, studier i både Japan 15 og Spanien 16. , En sammenlignelig USA undersøgelsen mislykkedes imidlertid at bekræfte dette mønster 17. Hidtil har disse undersøgelser og observationer er begrænset til den nordlige halvkugle. Den MSBase studiegruppe for nylig analyseret en stor global datasæt af MS tilbagefald tværs både nordlige og sydlige halvkugle til at udforske sæsonmæssige tendenser i timingen af tilbagefald debut i tillæg til breddegrader indflydelse på forholdet mellem peak tilbagefald sandsynlighed og sæsonbetonede ultraviolet stråling (UVR) trug 18 . Centralt for disse metoder var anvendelsen af ​​trigonometriske regressionat visualisere og evaluere tendenser i timingen af ​​tilbagefald debut og UVR distributioner.

Det overordnede mål med denne undersøgelse var at teste hypotesen om, at tidsmæssige variation i timingen af ​​tilbagefald debut i MS varierede forudsigeligt med sæsonen i både den nordlige og sydlige halvkugle, og denne sæsonudsving var påvirket af breddegrad. Begrundelsen for at anvende trigonometriske modellering for at undersøge disse spørgsmål var dens fleksibilitet til karakterisering to- eller tre-dimensionelle fænomener, der er kendt eller mistænkt for at beskrive diskrete, forudsigelige og konsistente figurer eller mønstre, såsom den årlige højdepunkter og lavpunkter almindeligt observeret i biologiske eller epidemiologiske fænomener besidder sæsonudsving. 19-22 En ulempe ved konventionel tidsserier analyser, herunder Fourier-analyse, er formodningen serien dengang er ofte præget af stokastiske processer. 21,23,24 Derimod inkorporerer trigonometriske funktioner Into en regression typen model har den fordel, at begge lette udforskningen af ​​regelmæssige og systematiske strukturer i periodiske data, samtidig med at udnytte regressionsmodellen struktur til at udforske andre korrelater eller justere for konfoundere af sæsonudsving.

Trigonometrisk regression har tidligere været anvendt bredt i den medicinske epidemiologiske litteratur at udforske temporalitet i emner så forskellige infektionssygdomme udbrud afsløring, rolle døgnrytmen i alt fra autonome nervesystem dysfunktion til præterm placenta abruption igennem til sæsonbestemte korrelater til medfødte misdannelser og timingen af præsentationer af ulykker og nødsituationer. 25-32 sådan modellering typisk kræver større stikprøvestørrelser end mere konventionelle tidsserier analyser og som sådan det er første gang det har været anvendt til et globalt datasæt MS tilbagefald debut. Trigonometrisk regression som beskrevet her er egnet værktøj til efterforskere udforske enhver phenomena som er kendt for eller mistænkt for at cykle systematisk over tid. Ikke alene kan en sådan modellering hjælp karakterisere og visualisere disse mønstre, er det endvidere tillader brugeren at udforske potentielle chauffører og korrelater til disse tendenser.

Med hensyn til det specifikke eksempel MS tilbagefald debut præsenteres her, brug af scatter og resterende grunde til at visualisere og vurdere, hvor tæt en hypotese trigonometriske model formular passer dataene udgør det afgørende skridt i fastlæggelsen: 1) hvorvidt de observerede data giver tilstrækkelige beviser til støtte for en hypotese om sæsonudsving eller andre tidsmæssige tendenser i timingen af ​​tilbagefald debut; og 2) hvorvidt hyppigheden og arrangement af sinus og cosinus funktioner, som definerer en bestemt trigonometrisk model er tilstrækkelig til at tillade brug af denne model til efterfølgende inferens og forudsigelse. Regression modellering tillader også kontrol for vigtige konfoundere af enhver observerede sæsonbestemte eller bredde- effekt såsom patient-niveautilbøjeligheder til tilbagefald, især faktorer, som i sig selv er tid varierende såsom varigheden af ​​præ-tilbagefald eksponering for sygdomsmodificerende lægemiddel (DMD) behandling. Isolering uafhængige geografiske og tidsmæssige prædiktorer og korrelater af tilbagefald debut timing i MS har potentiale til at guide biologisk undersøgelse af mekanismerne for tilbagefald begivenheder, som igen kan informere udviklingen af ​​fremtidige behandlingsindsatser henblik på at forebygge eller forsinke sygdommens forværring.

Den MSBase Registry

MS-patienter, der bidrager tilbagefald data til denne analyse blev indkøbt fra den internationale MSBase registreringsdatabasen. Etableret i 2004, registreringsdatabasen på langs samler demografiske, aktivitet sygdom, klinisk undersøgelse og efterforskning egenskaber og målinger fra samtykkende patienter deltog MS klinik ved hjælp af en internet-baseret, læge-ejet og drevet system. 33 medlemsstater centre følge en fælles protocol, der definerer den minimale datasæt, der skal uploades med aftalte regelmæssige mellemrum for at sikre resultatet data, såsom tilbagefald begivenheder er konsekvent og prospektivt kompileret. Datoen for tilbagefald debut indgår som et obligatorisk minimum datasæt variabel. Derudover er almindeligt indsamles relevante kliniske data i forbindelse med disse tilbagefald begivenheder, herunder kortikosteroidbehandling og funktionelt system påvirkes. Brugen af ​​den fælles IMED dataindtastning systemet yderligere sikrer en ensartet tilgang på tværs af centre til indsamling og rapportering af data. Dette projekt rummer menneskelige forskningspotentiale etiske komité godkendelse eller dispensation ved hver medvirkende center. Informeret samtykke i henhold til lokale love fra alle patienter inkluderet i analysen er obligatorisk.

Inklusionskriterier

I alt 9811 patienter, der bidrager 32,762 tilbagefald begivenheder blev inkluderet i analysen. Klinisk MS centre med et minimum af 20 registrerede patienter givet samtykke, uploaded og spores i registreringsdatabasen, som den 1. december 2013 (dato for dataindsamling) var berettiget til optagelse i analysen. For at sikre, at alle tilbagefald begivenheder indgår i analysen, blev prospektivt observeret, kun tilbagefald indledninger dateret efter den første indspillede patient vurdering handicap (ved hjælp af Kurtzke Expanded Disability Status Score (EDSS)) blev inkluderet i analysen. Alle patienter, der bidrager tilbagefald data til analysen tilfredse formelle diagnostiske kriterier for MS. 34,35

Resultatmål

Denne undersøgelse betragtes to primære udfald: 1) hvorvidt der var tidslige variation i sandsynligheden for tilbagefald indtræden på niveau med den geografiske placering, halvkugle og / eller globalt; og 2) om der var en sammenhæng mellem bredde og forsinkelse, i måneder, mellem timingen af ​​sæsonbestemte UVR trug og den efterfølgende peak tilbagefald sandsynlighed dato. Den MSBase Study gruppe hypothedimensioneret, at som absolutte D-vitamin er lavere i områder længere væk fra Ækvator og stedspecifikke sæsonmæssige populationsniveau vitamin D nadir er sandsynligvis nået tidligere efter vintersolhverv i sådanne distale steder, så effekten af ​​lave D-vitamin-niveauer på øget MS tilbagefald sandsynlighed ville ligeledes beskrive sådanne tidsmæssige og breddegrader mønstre.

Tilbagefald definition og datoer

En tilbagefald blev defineret som forekomst af nye symptomer eller forværring af eksisterende symptomer der varer i mindst 24 timer, i mangel af samtidig sygdom eller feber, og forekommer mindst 30 dage efter en tidligere angreb. Denne definition har tidligere været anvendt i en MSBase tilbagefald fænotype analyse. 36 opfølgningsperiode for hvert støtteberettiget patient på tværs af hvilke tilbagefald hændelser kunne observeres blev defineret som den periode, der spænder fra datoen for første EDSS vurdering igennem til datoen for den senesteIndspillede EDSS vurdering i registreringsdatabasen, før dataene data ekstrakt og kompilering. I tilfælde, hvor den nøjagtige dag for tilbagefald debut var utilgængelig eller ude af stand til at bestemmes for en bestemt måned, klinikker anvendes enten den 1. eller 15. i måneden som standard datoer. Af de 32,762 tilbagefald analyseret i denne rapport, blev der 7913 (24,2%) og 4594 (14,0%), optaget på 1. og 15. dag i måneden henholdsvis væsentligt højere end de andele er optaget på en hvilken som helst anden dag i den måned, der lå fra 0,8% ved 5,6%. For at korrigere for dette, tilbagefald optaget på enten 1. af 15. dag i måneden blev randomiseret til en dag inden for en 15 dages interval på hver side af begge disse standardindstillinger datoer. Den interne validitet af denne tilgang blev bekræftet via følsomhedsanalyser som viste, at den modellerede estimat af top tilbagefald dato under standard dato randomisering var ikke signifikant forskellig fra en model ved hjælp af enten den oprindelige rapporterede datoer eller eksklusive standardindstillinger datoerne helt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Hvert trin beskrives svarer til et afsnit af Stata kode med samme nummer i koden filen forudsat. Stata kommando navne er blevet kursiveret i følgende protokol.

1. Forbered og Plot Observeret Relapse Onset data

  1. Åbn en gør-fil ved at klikke på knappen "Ny Gør-fil Editor" og bruge generere kommando til at beregne antallet af tilbagefald indledninger dateret til hver af de tolv kalendermåneder for hver af de tre geografiske niveauer, der skal modelleres: beliggenhed, halvkugle og global. Handling kommando ved at klikke på "execute (gør)" gør-fil action knappen i gør-fil.
  2. Brug swilk eller sktest kommando til at teste den underliggende fordeling af tilbagefald tæller for normalitet ved hjælp af en Shapiro-Wilk eller modificeret Jarque-Bera test for placering aggregerede tilbagefald data eller disaggregere patientdata niveau tilbagefald data hhv. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    38,39.
  3. Brug generere kommando til at oprette en ny variabel "north_month" for sydlige halvkugle kalendermåneder opvejet af 6 for at tillade plotning af både nordlige og sydlige halvkugle tilbagefald efter sæson langs den samme vandrette akse. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    1. Graf en Scatterplot af observerede månedlige tilbagefald indledninger med tilbagefald frekvens på y-aksen og kalendermåned på x-aksen for hver halvkugle ved hjælp af tovejs scatter kommando. Gentag for hvert sted. Overhold mønster af toppe og dale i tilbagefald debut i løbet af kalenderåret ved at se hver parcel i grafen fremviser den åbner automatisk til skærmen.
  4. Brug radar kommando tiltrække radar plots af fordelingen af ​​tilbagefald frekvens ved kalendermåned med hver radar akse opfange en enkelt måned bestilt i urets måde. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    1. Gentag for alle websteder. Overhold mønster af toppe og dale i tilbagefald debut i løbet af kalenderåret ved at se hver parcel i grafen fremviser den åbner automatisk til skærmen.
  5. Kør seast kommando for at anvende en Edward test af sæsonudsving på tværs af de observerede tilbagefald data. 40-42 Gentag for alle geografiske niveauer.

2. Model Building og Selection

  1. Brug generere kommandoen til at angive de årlige cyklus sinus og cosinus trigonometriske funktioner, der skal anvendes i regressionen. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  2. Brug tilbagegang kommandoen specificere form af basismodellen med tilbagefald tæller som den afhængige resultat variabel og sinus og cosinus vilkår beregnedei trin 2.1 som de primære forklarende variabler.
    1. Tilføj stedspecifikke UVR 37 til base model som en yderligere justering kovariat og bruge den analytiske vægt Avægt mulighed at vægte model for antallet af patienter har bidraget med hvert sted. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
      BEMÆRK: Optag modellen determinationskoefficienten (R2), og den resterende fejl i resultater vindue, der automatisk åbner for at screene. Ultraviolet stråling: Daglig gennemsnitlig erythemally-vægtet omgivende UVR for hver måned 1979-2004 inklusive blev indkøbt fra National Aeronautics and Space Administration Earth Probe Total Ozone Mapping spektrometer for alle individuelle lokaliteter indgår i analysen 37.
  3. Opbevar modellen forudsagde månedlige log (tilbagefald) ved hjælp af forudsige kommandoen. Konverter log tilbagefald tilbage til heltal tilbagefald tæller ved exponentiating log (tilbagefald) ved anvendelse af den genespiste kommando. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)". Gentag for alle websteder.
  4. Overlay de exponentiated forudsagte månedlige tilbagefald estimater fra 2,3 i løbet af de observerede månedlige tilbagefald data ved hjælp af tovejs scatter kommando. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    1. Gentag for alle websteder. Se hver parcel i grafen fremviseren.
  5. Brug tilbagegang kommandoen til at udvide modellen i 2.2 ved at tilføje en ekstra harmonisk sinus / cosinus par. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    BEMÆRK: Optag det resterende fejl og determinationskoefficienten. Gem og omdanne modelestimaterne pr 2,3 og plot model estimerer løbet observerede data som pr 2.4. Gentag for alle websteder.
  6. Brug tilbagegang kommandoen til yderligere at udvide modellen i 2.2 ved at tilføje yderligere to harmoniske sinus / cosinus par. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    BEMÆRK: Optag residualerne og koefficienten forbestemmelse. Sammenlign denne model direkte med basismodel anvendelse af et likelihood ratio test. Brug ESTAT ic post-estimering kommando til at generere Akaike og Bayesian Information Criteria. Gem og omdanne modelestimaterne pr 2,3 og plot model estimerer løbet observerede data som pr 2.4. Gentag for alle geografiske niveauer.

3. Estimering Peak Relapse Sandsynlighed

  1. Brug den ikke-lineære kombination af estimatorer funktion (nlcom) til at beregne det punkt estimat og 95% konfidensinterval for fase-skift, ved hjælp af den bedst-montering model identificeret fra trin 2.1 gennem 2.6. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
    1. Konvertere disse point skøn og tilhørende konfidensintervaller til numre, der repræsenterer kalender datoer for peak tilbagefald frekvens (T max) og trug tilbagefald frekvens (T min), hvor 1 = 1. januar og 365 = 31. December og T max = fase-shift + (365/4) ogT min = fase-shift + ((365/4) * 3). Gentag for alle geografiske niveauer. Match T max og T min til en kalender dato via Excel Opslag fil.
  2. Brug generere kommandoen til at beregne peak-to-trough forskel (T max minus T min) for hver placering, standardiseret for hver 100 patienter pr webstedet. Brug en Wilcoxon rank-sum test til sammenligning standardiseret peak-to-trough forskel ved breddegrad rækkevidde. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".

4. Modellering Ultraviolet stråling data

  1. Kør brug kommandoen til at indlæse UVR data. Beregn median månedlige UVR for hver placering ved hjælp af own kommandoen. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  2. Tegne en Scatterplot månedlige UVR (y-aksen) ved kalendermåned (x-aksen) for hver placering ved hjælp af tovejs scatter funktion. Se hver parcel i grafen fremviser den åbner automatisk til skærmen.
  3. Repspiser trin 1.2 for UVR data og bruge tilbagegang kommandoen til at angive en base model af location-niveau årlig UVR trend, hvor månedlige UVR er angivet som de afhængige resultatvariabler og sinus og cosinus trigonometriske funktioner som specificeret i trin 2.1 er indarbejdet i modellen som de forklarende variable.
  4. Gentag trin 2.4 gennem 2.6 for UVR model og begrænset til stedspecifikke kun modeller. Dette indebærer du kører det tovejs scatter kommandoen til at overlejre forudsagte estimater på observerede data og brug af tilbagegang kommandoen til at køre de udvidede harmoniske model alternativer.
  5. Brug den bedste pasform model af stedsspecifikke månedlige UVR identificeret i trin 4.2 gennem 4.4 bruge generere kommando til at beregne den fase-shift point estimat og tilhørende 95% konfidensinterval for UVR ved igen at anvende de dobbelte vinkler formler angivet i trin 3.1 . Beregn T min (dato for trug UVR) for hver placering ved hjælp the formel beskrevet i trin 3.1. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".

5. Modellering UVR-trough-til-tilbagefald-peak Lag

  1. Føje den model-anslået dato for sæsonmæssige UVR trug fra trin 4.5 og tilbagefald peak datoer fra trin 3.1 for hver placering ved hjælp af kommandoen fusionere. Brug generere kommando til at beregne den tid gået i måneder mellem UVR trug dato og efterfølgende tilbagefald peak dato. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  2. Brug sktest kommando til at teste UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse variabel for væsentlige afvigelser fra normalitet ved hjælp af en Shapiro-Wilk test Vælg kode og klik på "Udfør (gør)".
  3. Append placering-niveau breddegrad data til datasæt ved hjælp af kommandoen fusionere. Konverter relativ råderum til absolut breddegrad ved hjælp af abs (x) funktion. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  4. Ved hjælp af tilbagegang kommandoen, teste lineariteten of forholdet mellem lag og absolutte bredde ved at køre både lineære og kvadratiske regressioner og sammenligne residualer. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  5. Ved hjælp af tilbagegang, angive en lineær betyde regressionsmodel med UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse som den afhængige resultat variabel og absolut breddegrad i enheder på 10 grader som prædiktor variabel. Vægt modellen for antallet af patienter bidraget med hvert sted ved hjælp af de aweights relatere mulighed. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  6. Brug tovejs scatter kommandoen til at plotte absolutte bredde på y-aksen mod UVR-trough-til-tilbagefald-forsinkelse i måneder på x-aksen. Overlay en linje af bedste tilpasning ved hjælp lfit graf mulighed. Visualiser de relative patient vægte af hvert sted ved hjælp af Avægt analytiske vægte mulighed. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".

6. Følsomhed Analyser af Patient-niveau Relapse Propensities

  1. Brug mepossion kommandoen til at angive et blandet effekter Poisson regression, hvor månedlige tilbagefald tæller er den afhængige resultat variabel, de sinus og cosinus trigonometriske funktioner som specificeret i trin 2.1 igen indarbejdet i modellen som de faste variabler, baseline EDSS, alder ved MS debut og før udsættelse for MS specifik sygdomsmodificerende behandling indgår som potentielle konfoundere og specifik patientidentifikation er angivet som en tilfældig effekt. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  2. Gentag trin 2.4 gennem 2.6 for at identificere den bedst passer Poisson-model. Dette indebærer du kører det tovejs scatter kommandoen til at overlejre forudsagte estimater på observerede data og brug af tilbagegang kommandoen til at køre de udvidede harmoniske model alternativer.
  3. Brug den ikke-lineære kombination af estimatorer funktion (nlcom) til at beregne det punkt estimat og 95% konfidensinterval for fase-skift og beregne datoenaf top tilbagefald frekvens. Sammenligne resultater med den primære analyse.
  4. Brug generere kommando til at genberegne UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse i måneder for hvert sted som beskrevet i trin 5.1, ved hjælp af patienten niveau Poisson model estimater af peak tilbagefald dato afledt i trin 6.3. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".
  5. Brug tilbagegang kommandoen til at omforme absolut breddegrad som en indikator for forsinkelse, som beskrevet i trin 5.5 og sammenligne resultaterne med den primære analyse. Vælg koden og klik på "Udfør (gør)".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Anvendelsen af ​​trigonometriske regression til 32,762 tilbagefald hændelser stammer fra 46 kliniske centre i 20 lande var grundlaget for at levere et forsvarligt statistisk argument for den iagttagelse, at timingen af ​​tilbagefald debut i MS er cyklisk og sæsonbetonede tværs begge halvkugler, og at varigheden mellem sæsonbestemt UVR trug og efterfølgende tilbagefald peak korrelerer med breddegrad. Kritisk til dette var tillid til plot-analyse til at styre nødvendigvis iterative model udvikling, evaluering og raffinement.

Analyse af tilbagefald frekvens ved kalendermåned scatter plots af de observerede data, foreslog en årlig cyklus med en fjeder højdepunkt og efteråret lavpunkt på tværs af alle geografiske niveauer. Radar plots af de globale tilbagefald data bekræftede nordlige halvkugleformet tilbagefald toppede i maj (figur 1A). Dette forår peak fortsatte når sydlige halvkugle tilbagefald onset data blev kombineret med de nordlige data <strong> (figur 1B), med de sydlige steder demonstrerer et højdepunkt November. Autumnal trug blev også registreret i begge halvkugler med den laveste frekvens af nordlige og sydlige halvkugleformet tilbagefald observeret i november og maj hhv. En Edward test yderligere bekræftet, at tilbagefald debut demonstrerede væsentlige afvigelser fra en ensartet, ikke-sæsonbetinget fordeling. Samlet set viser disse resultater antydede, at den periodiske tidsmæssige variation observeret i MS tilbagefald indtræden på alle tre niveauer af geografi bedst beskrives en enkelt årlig cyklus bestående af en enkelt top og en enkelt trug adskilt af en regelmæssig seks måneders interval. Således vil en trigonometrisk regressionsmodel angivet med et enkelt par sinus og en cosinus funktioner blev valgt som basisscenariet model på tværs af begge hemisfærer (figur 2). Sammenlignet med konkurrerende trigonometriske modelløsninger udvidet til at omfatte to eller tre periode harmoniske, basismodellen tværs nordlige halvkugleformet Loctioner minimeres den resterende square error og returneres en overlegen pasform af de observerede data (p <0,0001, justeret R2 = 0,263) sammenlignet med enten en model inkorporerer et yderligere harmoniske (p = 0,0001, justeret R2 = 0,198) eller en yderligere to harmoniske (p = 0,0014, justeret R2 = 0,181). Tilsvarende samme basismodel ud-udført udvidet harmoniske alternativer, når det påføres den sydlige halvkugle med basismodel (p <0,0001, justeret R2 = 0,241) igen minimere de resterende forskelle mellem de observerede og anslåede data i forhold til model, som indeholder yderligere to harmoniske (p <0,0001, justeret R2 = 0,167); den ene-yderligere harmoniske model beskrev en lignende pasform i forhold til basen (p <0,0001, justeret R2 = 0,243). Vigtigere for modellering af stedspecifikke breddegrad som en indikator for UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse, basismodellen igen ud-udføres enten af ​​den forlængede-harmonic modeller på niveau med de enkelte geografiske lokationer.

Brug basismodellen angivet på en enkelt sinus / cosinus par, fase-skift på tværs af alle tilbagefald globalt blev anslået til -24,8 (95% CI -45,8, -3,9), oversætte til en anslået nordlige hemisfærisk peak tilbagefald debut datoen for 7 th marts (95% CI: 10. februar, 28. marts) og en sydlig halvkugleformet højdepunkt datoen den 5. september (95% CI: 10 th August, 26. September). Der var ingen forskel i fase-skift estimat med halvkugle (test af interaktion: p = 0,254). Mean (SD) standardiseret peak-to-trough tilbagefald forskel var 7,6 (6,6) tilbagefald 100 patienter. Selv om centre beliggende på et absolut bredde på 40 grader eller mere optaget et større peak-to-trough forskel (gennemsnit 8,6, SD 7.6) i forhold til der ligger inden for en absolut bredde mellem 20 til 39 grader (gennemsnit 5,7, SD 3.3), denne forskel var ikke statistically signifikant (p = 0,135).

Scatterplot analyse af UVR ved kalendermåned foreslog, at basismodellen defineret på en enkelt sinus / cosinus harmoniske par, som beskrevet ovenfor var ligeledes passende for UVR sæsonudsving, på alle geografiske niveauer. Som illustration, Figur 3 viser de regression modelleret månedlige UVR skøn oven på den observerede UVR data for fire udvalgte individuelle steder, to fra hver halvkugle. Hvad kan blive værdsat af disse grunde er bare, hvor tæt de modellerede estimater, baseret på en årlig cyklus enkelt top og trug sinus regression, giver til de observerede data. Den UVR basismodellen igen overgået nogen af ​​de udvidede-harmoniske modeller i form af minimering residualer og en overlegen determinationskoefficienten.

Overliggende den cykliske UVR sinusoid kurve over tilsvarende kurve for tilbagefald debut foreslog, at lavpunktet UVR forud konsekvent peak tilbagefald debut probabiheden. Desuden denne forsinkelse syntes at skrumpe yderligere nord eller syd et bestemt sted blev placeret væk fra ækvator. Anvendelse af en lineær regression af middelværdien, hver 10 breddegrader væk fra ækvator i enten halvkugle var forbundet med en statistisk signifikant fald i denne forsinkelse på 28,5 dage i UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse (95% CI: 3,29, 53,7; p = 0,028). Som figur 4 viser, som absolut bredde øges fra ækvator på begge halvkugler, jo hurtigere tilbagefald toppede efter vinteren UVR truget. Der var ingen forskel i denne sammenhæng ved halvkugle (test af interaktion p = 0,811).

Patienten-level blandet virkninger Poisson forlængelse af den primære trigonometriske sinus regression returnerede meget lignende resultater med en top tilbagefald dato anslået til blot to dage senere end anslået af den primære basismodellen (9. marts sammenlignet med den 7. marts for nordlige halvkuglesteder, 7. September versus 5. September til sydlige lokationer). Tilsvarende UVR-trough-til-tilbagefald peak forsinkelse var sammenlignelig under enten de primære eller følsomhed modeller, med patienten niveau Poisson forlængelse demonstrerer en gennemsnitlig kun 4,1 dag anderledes i lag (gennemsnitlig forsinkelse = 24,8 dage, 95% CI 2,0, 49,2 ) i forhold til den primære lokation niveau model. Igen var der ingen forskel i denne sammenhæng ved halvkugle (test af interaktion, p = 0,671).

Figur 1
Figur 1. Radar plots af observerede globale tilbagefald frekvens efter måned. (A) nordlige halvkugle, (B) kombineret nordlige og sydlige halvkugle Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 2. Base model forudsagde vs observerede tilbagefald. Plots sammenligner observerede månedlige tilbagefald ved halvkugle med forudsagte tilbagefald ved hjælp base-sagen trigonometriske model, der beskriver en enkelt årlig cyklus af én top og en trough adskilt af seks måneder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Base model forudsagde vs observerede tilbagefald Plots sammenligne observerede median månedlige UVR med basismodel forudsagde UVR til Montreal, Canada.; Melbourne, Australien; Bari, Italien & Buenos Aires, Argentina. Klik her for at se alArger version af denne figur.

Figur 4
Figur 4. Vægtet linje af bedste tilpasning mellem absolut breddegrad og UVR-trough-til-tilbagefald-peak forsinkelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den heri beskrevne protokol detaljer en systematisk regression baseret teknik, styret af visuel plot analyse af globale MS tilbagefald debut data. Det tager som udgangspunkt en relativt simpel beskrivende analyse af tilbagefald data fra 20 lande i hele begge halvkugler, så brugeren kan udforske teorier om temporalitet for tilbagefald debut timing i MS og test disse teorier formelt gennem brug af trigonometriske modeller. Gennem en trinvis proces med først plotte globale tilbagefald debut data og derefter systematisk grafer og vurdere kandidat geometriske anfald af de observerede data blev en breddegrad-afhængig sammenhæng mellem årstidens trug UVR og efterfølgende peak tilbagefald debut sandsynlighed observeret, en sammenhæng hidtil uden fortilfælde i MS epidemiologi. Desuden ved at kombinere trend visualisering med formel statistisk modellering, denne analyse bekræftede også tidligere metaanalyse tyder sæsonudsving blev en faktor i tilbagefald debut timingpå den nordlige halvkugle, og også for første gang, udvidet denne observation til den sydlige halvkugle.

Trigonometrisk regression modellering er et fleksibelt værktøj til formelt at udforske cykliske, tids- eller sæson-afhængige periodiske fænomener, tillader statistisk karakterisering af trend data, der er i overensstemmelse med geometriske former, såsom den årlige cykliske sinusoid kurve observeret i både tilbagefald debut timing og UVR data udforskede i denne rapport. Men i betragtning af den række former og strukturer, komplicerede, multifaktorielle epidemiologiske udvikling fænomener såsom tilbagefald indtræden timing kan potentielt antage, visualisering af både de oprindelige data og forskellene mellem disse observerede data og dem forudsagt af en bestemt model (dvs.., residualerne) er kritiske for både hypotese-generering (tilbagefald debut timing varierer sæsonmæssigt hele året) og hypotese-test faser af denne undersøgelse (denne sæsonudsving er forudsigelig og værest beskrives ved hjælp af en sinus regression). Resultatet er en suite af roman, empirisk-jordet slutninger vedrørende den potentielle globale indflydelse af sæson og breddegrad i sygdommen forværring mønstre i MS.

Det kritiske skridt i protokollen var måske den enkleste at udføre, visualisering af de observerede tilbagefald debuterende data ved hjælp af simple deskriptive scatterplots. I betragtning af den mangfoldighed og diversitet af mulige tidsmæssige strukturer periodiske data kan tage, enkle grafer af observerede data giver både et empirisk grundlag for at danne en hypotese omkring tilbagefald debut mønstre samt udgangspunkt for opbygning af modeller, der bedst fange disse tendenser og som kan efterfølgende anvendes til statistisk inferens og forudsigelse. Et centralt modifikation manipuleret ind i protokollen var den systematisk sammenligning af basismodellen mod alternative modeller inkorporere yderligere trigonometriske harmoniske funktioner. "Bedste" fit er en relativ stat og only ved at teste effektiviteten af ​​basismodellen mod plausible alternativer var bedste pasform i dette tilfælde kan bestemmes. Det andet afgørende skridt var at kopiere hver af tilbagefald sandsynlighed og UVR modeller på alle tre forskellige niveauer af geografi - globalt, halvkugle og placering. Ikke kun gjorde dette giver intern validering af de primære resultater (de højere drevne tendenser på globalt og Hemi niveauer blev gentaget på det sted niveau) det også tilladt fejlfinding af kode, der bruges til at køre plots og modeller. Uventede resultater eller usandsynlige model passer, ikke altid indlysende på niveau med det globale eller halvkugleformet analyse, afledt på niveau med placeringen blev brugt som et rødt flag for kvalitet kontrol af koden bruges over alle niveauer af geografi. Dette gav tillid til, at de sæsonbestemte cyklusser og breddegrad mønstre observeret globalt var ikke et artefakt af data sammenlægning eller forkert kodning. En yderligere fordel ved denne protokol er, at ikke alene kan det capture og beskrive sæsonudsving og indflydelsen fra halvkugle og breddegrad med en passende robusthed, justerer også disse foreninger for potentiel confounding fra patient-niveau tilbøjeligheder for tilbagefald, herunder forskellige niveauer af handicap og varierende sygdomsmodificerende lægemiddel eksponering før tilbagefald. Dette giver os mulighed for bedre at isolere sæson og bredde som selvstændige prædiktorer for tilbagefald sandsynlighed resulterer i estimater af, at bedre tilnærme sandheden. Dette er især vigtigt i betragtning af de potentielle kliniske konsekvenser af denne forskning.

Observation af en forudsigelig, bredde-afhængige forsinkelse mellem vinteren trough UVR niveauer og senere recidiv topfrekvens kan delvist vedrører en påvirkning af skiftende D-vitaminstatus på et givet geografisk placering, hver med sin egen unikke UVR profil. Adskillige vitamin D-medieret immunmodulerende korrelerer med MS tilbagefald debut sandsynlighed er tidligere blevet observeret herunder shifTing T hjælper lymfocytter væk fra en proinflammatorisk Th1-profil til mindre inflammatoriske Th2 43-46 og inhibering af dendritiske celler og IgM / IgG-antistof produktion 43,47-50. Kobling dette til observation af en potentiel rolle for både sæson og breddegrad i kinetikken for tilbagefald timing, dette tyder på en rolle i klinisk praksis for breddegrad-specifik, placering-passende D-vitamin for at reducere sandsynligheden for fremtidige tilbagefald. Selvfølgelig trods dette forslag, har MSBase undersøgelsen ikke indsamler tidsseriedata om patient-niveau D-vitamin-status eller formelle UVR hudeksponering kvantificering og dermed dette teoretiseret inverse korrelation mellem D-vitamin status og efterfølgende tilbagefald sandsynlighed forbliver præcis det, kun en hypotese. Formelle, passende drevet randomiserede kliniske forsøg er forpligtet til at etablere kausalitet. To sådanne forsøg med D-vitamin monoterapi, den australske / New Zealand PREVANZ forsøg (registrering ACTRN12612001160820), ogden franske "D-lå MS" studie (registrering PHRC-N / 2012 / ET), er i øjeblikket i gang.

Måske især, denne undersøgelse er illustrerende for den mulige synergi rådighed for epidemiologer fra kombinationen af ​​formelle statistisk modellering og diagnostik med data visualiseringsteknikker. Betydningen af ​​denne teknik i forhold til andre former for tidsserier analyserer løgne med sin afvisning af den antagelse af serien konventionel tid analyser, eventuelle underliggende temporalitet er overvejende en tilfældig proces. Til sammenligning trigonometriske regression udtrykkeligt opsøger strukturer i den tidsmæssige variation af cykliske, periodiske fænomener som MS tilbagefald. Som sådan trigonometriske modeller er udsøgt afhængige af systematisk visualisering af både observerede data og modellerede estimater til at vejlede og bekræfte den modelbygning og evalueringsproces, hvert skridt på vejen. Hverken visualisering eller modellering ville have været tilstrækkeligt i isoning - plot analyse var nødvendig for at etablere realistiske hypoteser om tilstedeværelse og strukturel form for sæsonbetingede og breddegrader påvirkninger af tilbagefald sandsynlighed og derefter teste effektiviteten af ​​de resulterende modeller mens trigonometriske regression var nødvendig for både at kvantificere disse relationer, justere for vigtige konfoundere, og give et mål for vished om, hvor sandsynlige disse foreninger er.

Teknikken er beskrevet heri er en kraftfuld metode til at isolere rolle eller indflydelse sæsonudsving eller breddegrad på komplekse, multifaktorielle begivenheder som timingen af ​​MS tilbagefald. Som sådan har det fremtidige potentiale for bred anvendelse til at studere andre kliniske eller biologiske fænomener, som er kendt eller mistænkt for at variere systematisk med sæson og / eller breddegrad. Denne teknik ville være særlig relevant for forudsigelse i epidemiologi, både i form af smitsomme og ikke-smitsomme sygdomme, hvor timing af vigtige begivenheder såsom en infektion eller sygdomsprogression er komplekse og ofte drevet af et væld af både miljømæssige faktorer (sæson, temperatur, breddegrad) og patient-niveau karakteristika (alder, co-morbiditet, udsættelse for behandling). Et sådant værktøj kan hjælpe med risiko lagdeling af patienter mere tilbøjelige til at opleve en negativ sundhed hændelse og dermed vejlede tidligere indgreb.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tim Spelman modtaget honorarer for rådgivning og finansiering til rejser fra Biogen Idec Inc; Orla Gray modtog rejse støtte fra Biogen Idec, Merck Serono og Novartis; kompensation for servering på videnskabelige advisory boards fra Biogen Idec, Genzyme, Novartis og Merck Serono; Robyn Lucas afslørede ingen konkurrerende interesser og Helmut Butzkueven modtaget kompensation for servering på videnskabelige advisory boards og som konsulent for Biogen Idec og Novartis; højttaler honorarer fra Biogen Idec Australien, Merck Serono Australien, og Novartis Australien; rejse støtte fra Biogen Idec Australien og Merck Serono Australien; forskningsstøtte fra CASS Foundation (Australien), Merck Serono Australien, Royal Melbourne Hospital Friends of the Neurovidenskaber Foundation og University of Melbourne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stata SE Version 13 StataCorp, College Station, Texas Version 13 Statistical analysis software used for analysis
Microsoft Excel 2010 Microsoft 2010 Spreadsheet program for calendar date look-up

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simpson, S. Jr, Blizzard, L., Otahal, P., Van der Mei, I., Taylor, B. Latitude is significantly associated with the prevalence of multiple sclerosis: a meta-analysis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 82 (10), 1132-1141 (2011).
  2. Risco, J., et al. Latitudinal prevalence gradient of multiple sclerosis in Latin America. Mult Scler. 17 (9), 1055-1059 (2011).
  3. Hollingworth, S., Walker, K., Page, A., Eadie, M. Pharmacoepidemiology and the Australian regional prevalence of multiple sclerosis. Mult Scler. 19 (13), 1712-1716 (2013).
  4. Jin, Y., de Pedro-Cuesta, J., Soderstrom, M., Stawiarz, L., Link, H. Seasonal patterns in optic neuritis and multiple sclerosis: a meta-analysis. J Neurol Sci. 181 (1), 56-64 (2000).
  5. Bamford, C. R., Sibley, W. A., Thies, C. Seasonal variation of multiple sclerosis exacerbations in Arizona. Neurol. 33 (6), 697-701 (1983).
  6. Bisgard, C. Seasonal variation in disseminated sclerosis (Danish). Ugeskrift for Laeger. 152 (16), 1160-1161 (1990).
  7. Callaghan, T. S. Multiple sclerosis and sinusitis. Lancet. 328 (8499), 160-161 (1986).
  8. Gay, D., Dick, G., Upton, G. Multiple sclerosis associated with sinusitis: a case-controlled study in general practice. Lancet. 327 (8485), 815-819 (1986).
  9. Goodkin, D. E., Hertsgaard, D. Seasonal variation of multiple sclerosis exacerbations in North Dakota. Arch Neurol. 46 (9), 1015-1018 (1989).
  10. Hopkins, C. E., Swank, R. L. Multiple sclerosis and the local weather. Arch Neurol. 74 (2), 203-207 (1955).
  11. O'Reilly, M. A. R., O'Reilly, P. M. R. Temporal influences on relapses of multiple sclerosis. Eur Neurol. 31 (6), 391-395 (1991).
  12. Schapira, K. The seasonal incidence of onset and exacerbations in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiat. 22 (4), 285 (1959).
  13. Sibley, W. A., Foley, J. M. Seasonal variation in multiple sclerosis and retrobulbar neuritis in Northeastern Ohio. Trans Am Neurol Assoc. 90, 295-297 (1965).
  14. Sosa, E. M., Betancor, L. P., Rosas, C., Navarro, M. C. Multiple sclerosis in the province of Las Palmas (Spanish). Archivos de Neurobiologia. 46 (3), 161-166 (1982).
  15. Ogawa, G., Mochizuki, H., Kanzaki, M., Kaida, K., Motoyoshi, K., Kamakura, K. Seasonal variation of multiple sclerosis exacerbations in Japan. Neurol Sci. 24 (6), 417-419 (2004).
  16. Abella-Corral, J., Prieto, J. M., Dapena-Bolaño, D., Iglesias-Gòmez, S., Noya-Garcìa, M., Lema, M. Seasonal variations in the outbreaks in patients with multiple sclerosis. Rev Neurol. 40 (7), 394-396 (2004).
  17. Koziol, J. A., Feng, A. C. Sesonal variations in exacerbations and MRI parameters in relapsing-remitting multiple sclerosis. Neuroepidemiology. 23 (5), 217-223 (2004).
  18. Spelman, T., et al. Seasonal variation of relapse rate in multiple sclerosis is latitude dependent. Ann Neurol. 76 (6), 880-890 (2014).
  19. Gallier, J. H. Curves and surfaces in geometric modeling: theory and algorithms. , Morgan Kaufmann. (2000).
  20. Agoston, K. Computer Graphics and Geometric Modelling: Implementation & Algorithms. Springer Science & Business Media. , (2005).
  21. Cox, N. J. Speaking Stata: in praise of trigonometric predictors. Stata Journal. 6 (4), 561-579 (2006).
  22. Bhaskaran, K., Gasparrini, A., Hajat, S., Smeeth, L., Armstrong, B. Time series regression studies in environmental epidemiology. Int J Epidemiol. , (2013).
  23. Bracewell, R. N. The Fourier Transform and Its Applications. , McGraw-Hill. New York. (2000).
  24. Korner, T. W. Fourier Analysis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1998).
  25. Rigdon, S. E., et al. Detection of Outbreak Signals Using R. Online J Public Health Inform. 6 (1), (2014).
  26. Ziemssen, T., Reimann, M., Gasch, J., Rüdiger, H. Trigonometric regressive spectral analysis: an innovative tool for evaluating the autonomic nervous system. J Neural Transm. 120 (1), 27-33 (2013).
  27. Luque-Fernandez, M. A., et al. Absence of circadian rhythms of preterm premature rupture of membranes and preterm placental abruption. Ann Epidemiol. 24 (12), 882-887 (2014).
  28. Luteijn, J. M., et al. Seasonality of congenital anomalies in Europe. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 100 (4), 260-269 (2014).
  29. Giardini, V., Russo, F. M., Ornaghi, S., Todyrenchuk, L., Vergani, P. Seasonal impact in the frequency of isolated spina bifida. Prenat Diagn. 33 (10), 1007-1009 (2013).
  30. Eghtesady, P., Brar, A., Hall, M. Seasonality of hypoplastic left heart syndrome in the United States: A 10-year time-series analysis. J Thorac Cardiovasc Surg. 141 (2), 432-438 (2011).
  31. Abiona, T. O., Adebowale, S. A., Fagbamigbe, A. F. Time Series Analysis of Admission in the Accident and Emergency Unit of University College Hospital, Ibadan, Southwestern Nigeria. Am. J. Comput. Appl. Math. 2 (1), 1-9 (2012).
  32. Cantwell, K., Dietze, P., Morgans, A. E., Smith, K. Ambulance demand: random events or predicable patterns? Emerg Med J. 30 (11), 883-887 (2012).
  33. Butzkueven, H., et al. MSBase: an international, online registry and platform for collaborative outcomes research in multiple sclerosis. Mult Scler. 12 (6), 769-774 (2006).
  34. Poser, C. M., et al. New diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines for research protocols. Ann Neurol. 13 (3), 227-231 (1983).
  35. McDonald, W. I., et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann Neurol. 50 (1), 121-127 (2001).
  36. Kalincik, T., et al. Risk of relapse phenotype recurrence in multiple sclerosis. Mult Scler. , (2014).
  37. Total Ozone Mapping Spectrometer on board the Earth Probe spacecraft. , Available from: http://iridl.ldeo.columbia.edu/SOURCES/.NASA/.GSFC/.TOMS (2013).
  38. D'Agostino, R. B., Belanger, A. J., D'Agostino, R. B. Jr. A suggestion for using powerful and informative tests of normality. Am Stat. 44 (4), 316-321 (1990).
  39. Gould, W. W., Rogers, W. H. Summary of tests for normality. Stata Technical Bulletin. 3, 20-23 (1991).
  40. Stolwijk, A. M., Straatman, H., Zielhuis, G. A. Studying seasonality by using sine and cosine functions in regression analysis. J Epidemiol Community Health. 53 (4), 235-238 (1999).
  41. Brookhart, M. A., Rothman, K. J. Simple estimators of the intensity of seasonal occurrence. BMC Med Res Methodol. 8 (1), 67 (2008).
  42. Fernández-Durán, J. J., Gregorio-Domìnguez, M. M. Testing for seasonality using circular distributions based on non-negative trigonometric sums as alternative hypotheses. Stat Methods Med Res. 23 (3), 279-292 (2011).
  43. Lemire, J. M., Archer, D. C., Beck, L., Spiegelberg, H. L. Immunosuppressive actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3: preferential inhibition of Th1 functions. J Nutr. 125, Suppl 6. 1704S-1708S (1995).
  44. Tsoukas, C. D., et al. Inhibition of interleukin-1 production by 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Clin Endocrinol Metab. 69 (1), 127-133 (1989).
  45. Lemire, J. M. Immunomodulatory actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Steroid Biochem Mol Biol. 53 (1-6), 599-602 (1995).
  46. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  47. Tsoukas, C. D., Provvedini, D. M., Manolagas, S. C. 1,25-dihydroxyvitamin D3: a novel immunoregulatory hormone. Science. 224 (4656), 1438-1440 (1984).
  48. Smolders, J., Menheere, P., Kessels, A., Damoiseaux, J., Hupperts, R. Association of vitamin D metabolite levels with relapse rate and disability in multiple sclerosis. Mult Scler. 14 (9), 1220-1224 (2008).
  49. Provvedini, D. M., Manolagas, S. C. 1 Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 receptor distribution and effects in subpopulations of normal human T lymphocytes. J Clin Endocrinol Metab. 68 (4), 774-779 (1989).
  50. Provvedini, D. M., Tsoukas, C. D., Deftos, L. J., Manolagas, S. C. 1 alpha,25-Dihydroxyvitamin D3-binding macromolecules in human B lymphocytes: effects on immunoglobulin production. J Immunol. 136 (8), 2734-2740 (1986).

Tags

Medicin multipel sklerose tilbagefald resterende parceller trigonometriske regression sinus regression sæsonudsving breddegrad
En metode til Trigonometriske Modellering årstidsvariationernes demonstreret med multipel sklerose Relapse data
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spelman, T., Gray, O., Lucas, R.,… More

Spelman, T., Gray, O., Lucas, R., Butzkueven, H. A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data. J. Vis. Exp. (106), e53169, doi:10.3791/53169 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter