Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca²⁺ I Aged hippocampus nervceller

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

Känslighet för neuron celldöd associerad med neurodegeneration och ischemi är ytterst ökat i åldrarna hjärnan men mekanismer som är dåligt kända. Excitotoxicitet, en process tros bidra till euronskada inducerad av båda förolämpningar, medieras genom aktivering av glutamatreceptorer som främjar ^Ca2 + inflöde och mitokondriell ^Ca2 + överbelastning. En väsentlig förändring i intracellulär ^Ca2 + homeostas eller ombyggnad av intracellulär ^Ca2 + homeostas kan gynna euronskada i gamla nervceller. För att undersöka ^Ca2 + ombyggnad i åldrandet har vi använt levande cell imaging i långsiktiga kulturer av rått hippocampusneuroner som liknar i vissa avseenden åldern nervceller in vivo. För detta ändamål, hippocampus celler är i första hand, nyligen sprids från nya född råtta hippocampi och ströks ut på poli-D-lysin belagda glastäck. Då kulturer hålls i kontrollerade medierna under flera dagar eller flera wEeks för att undersöka unga och gamla neuroner, respektive. För det andra, är odlade nervceller laddade med fura2 och utsattes för mätningar av cytosoliskt ^Ca2 + koncentration med digital fluorescensförhållande bildbehandling. För det tredje, är odlade nervceller transfekteras med plasmider som uttrycker en tandem med låg affinitet aequorin och GFP riktade till mitokondrierna. Efter 24 timmar, är aequorin inuti celler spädas med coelenterazin och nervceller utsätts för mareld bildhantering för övervakning av mitokondriell ^Ca2 + koncentration. Denna procedur tre-steg möjliggör övervakning av cytosoliska och mitokondriella ^Ca2 + responser till relevanta stimuli såsom exempelvis glutamatreceptoragonist NMDA och jämför huruvida dessa och andra svar påverkas av åldring. Detta förfarande kan ge nya insikter om hur åldrande inflytande cytosoliskt och mitokondrie ^Ca2 + svar till utvalda stimuli samt testning av utvalda läkemedel syftar till att förebygga neuron celldöd i åldersrelaterade sjukdomar.

Introduction

Excitotoxicitet är en av de viktigaste mekanismerna som bidrar till neuronal skada och celldöd i neurologiska förolämpningar såsom ischemi, och i vissa neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom ^en. Denna typ av neuro huvudsakligen medieras av glutamat agerar på ^Ca2 + -permeable, jonotropa NMDA-receptorer (NMDAR) ^2. Exponering av odlade nervceller till glutamat kan leda till excitotoxicitet ^3, vilket orsakar neuronal apoptos ^4. Vi och andra har tidigare rapporterat att neuronala sårbarhet för NMDA-inducerad apoptos kan förändras med utvecklingen in vitro och åldrande ^5-8.

Det är allmänt accepterat att en ökning i den cytosoliska fria ^Ca2 + koncentration ^([Ca2 +] _cyt) leder till celler aktivering. Men om denna ökning är för hög och / eller ihållande nog, kan det utlösa celldöd ^9. Vidare har det föreslagitsatt excitotoxicitet kräver mitokondriell ^Ca2 + upptag ^10, eftersom behandling av nervceller med en mitokondriell frikopplare skyddade neuroner mot glutamatinducerad celldöd ^11. Om mitokondrier tar upp för mycket ^Ca2 +, kan öppnandet av den mitokondriella permeabilitetstransition porer uppstå, vilket leder till frisättning av cytokrom c och andra pro-apoptotiska faktorer, och inducera apoptos. Vi har nyligen visat att denna mitokondriella ^Ca2 + upptag är direkt relaterad till åldersberoende känslighet för excitotoxicitet, genom att direkt mäta NMDA-inducerad mitokondriell ^Ca2 + upptag i enstaka hippocampusneuroner ^5, en metod som redovisas i den här artikeln. Hippocampus, involverade i fysiologiska processer såsom inlärning, minne och andra kognitiva processer ^12, är mycket känsliga för åldrande och neurodegenerativa sjukdomar ^13. Det har föreslagits att, efter flera veckor in vitro, odladeshippocampus nervceller visar ett antal typiska kännetecknen för åldern nervceller ^14. Följaktligen kan långsiktiga odlade hippocampusneuroner ge en heltäckande modell för att undersöka ^Ca2 + medierad mekanismer för förbättrad excitotoxicity i åldrandet.

Det övergripande målet för den metod som presenteras är därför att undersöka väsentliga förändringar i intracellulär ^Ca2 + homeostas eller ^Ca2 + remodeling i den åldrande hjärnan, inklusive differential ^Ca2 + svar framkallade av NMDA-receptoragonister i ett långsiktigt odlade hippocampusneuroner . Metoden innehåller en detaljerad beskrivning av kultur råtta hippocampus nervceller och övervakning av cytosoliska och mitokondriella ^Ca2 + koncentrationer av fluorescens och mareld avbildning i enskilda neuroner, respektive. Fluorescens avbildning av cytosoliska Ca ^{2 +} i odlade nervceller är ett standardförfarande. Dock är denna metod mindre tillförlitliga för subcellulär Ca ^{2 +} mätningar inklusive mitokondriell ^Ca2 +. Orsaker till detta är bland annat bristande målinriktning av syntetiska prober och olämpligt affinitet för Ca ^{2 +} koncentrationer som kan ändras i mitokondrier från låga iM nivå även till mM nivå. Användningen av ^Ca2 + prober baserade på proteiner som till exempel aequorin, har gjort det möjligt för målsökning till subcellulära organeller och användning av derivat olika ^Ca2 + tillhörighet med olika coelenterazines eller muterade prober som saknar specifik ^Ca2 + bindningsställen ^15. På detta sätt kan mareld avbildning av celler som uttrycker mitokondrier inriktade aequorin möjliggöra övervakning av mitokondriella ^Ca2 + koncentrationer i enskilda nervceller. Ändå kan detta förfarande kräver användning av fotonräknings kameror eller ultra CCD-kameror för mareld avbildning ^16-18. Denna metod kan ge nya resultat som bör bekräftas i mer establdiga hjärnans åldrande modeller som, till exempel, hjärnan skivor från gamla djur.

Protocol

Etik uttalande: Rutiner som involverar djurförsök har skötts i enlighet med protokoll som godkänts av Valladolid University djurstallar anläggning i överenskommelse med Europakonventionen 123 / Europarådet och direktiv 86/609 / EEG. 1. kort och lång sikt kultur råtta hippocampus nervceller Framställning av poly-D-lysin belagda, 12 mm täckglas. Sterilisera 12 mm diameter glastäck i etanol under minst 24 timmar. Låt dem torka under sterila förhållanden. Fördela …

Representative Results

Här beskriver vi en enkel metod för att bedöma Ca2 + ombyggnad och effekterna av NMDA på cytosoliskt och mitokondrie [Ca2 +] i åldern nervceller. Figur 1 visar den schematiska av förfarandet för isolering och odling hippocampusneuroner från neonatala råttor. Innan du börjar, måste vi förbereda sterila, poly-D-lysin belagda, glastäck och lokalisera dem i ett 4-bra maträtt. Därefter neonatala råttor avlivas och hjärnan avlägsnades. Efter isolering av hippocampus, ä…

Discussion

Ombyggnaden av intracellulär ^Ca2 + homeostas i den åldrande hjärnan har satts i samband med kognitiv förlust, ökad mottaglighet för ischemisk skada, excitotoxicity och neurodegeneration. För att undersöka denna hypotes in vitro, ^Ca2 + avbildningsförfaranden är tillgängliga. Tyvärr, livskraftiga odlingar av gamla hippocampus nervceller inte är tillförlitliga. Nyligen har det visat sig att långsiktiga kulturer av rått hippocampusneuroner närvarande många av de typiska känn…

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics