Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53330
Automatic Translation
1, 1, 2
1Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, 2Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

Abstract

Nörodejenerasyon ve iskemi ilişkili nöron hücre ölümüne Duyarlılık fazlasıyla yaşlı beyinde artmış, ancak sorumlu mekanizmalar kötü bilinmektedir. Eksitotoksisite, her iki saldırılar ile uyarılan nöron hasarına katkıda bulunduğuna inanılan bir yöntem, Ca2 + akışını ve mitokondriyal Ca 2 + aşırı teşvik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu aracılık eder. Hücre içi Ca 2 + homeostazı hücre içi Ca 2 + homeostasis veya yeniden yapılanmasında önemli bir değişiklik eski nöronlar nöron hasarı lehine olabilir. Yaşlanma Ca 2 + yeniden modellemenin araştınlması için in vivo nöronlar arası bazı yönleri benzer sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültürlerde canlı hücre görüntüleme kullandık. Bu amaç için, hipokampal hücreleri ilk etapta, taze yeni doğmuş sıçan Hipokampuslardan gelen dağınık ve poli-D-lizin kaplı cam lamelleri kaplama vardır. Sonra kültürler birkaç gün boyunca kontrollü bir ortam içinde muhafaza veya W birçok edilirsırasıyla, genç ve yaşlı nöronların araştırılması için eeks. İkinci olarak, kültürlenmiş nöronlar fura2 ile yüklenir ve dijital fluoresan oranı görüntüleme kullanarak sitosolik Ca2 + konsantrasyonu ölçümlerine tabi tutulur. Üçüncü olarak, kültürlenmiş nöronlar mitokondri hedeflenen düşük meyil aequorin ve GFP bir tandem ifade eden plasmidler ile transfekte edilir. 24 saat sonra, hücre içinde aequorin koelenterazin ile yeniden ve nöronlar mitokondriyal Ca2 + konsantrasyonunun izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme tabi tutulur. Bu üç adım prosedür, örneğin glutamat reseptör agonisti NMDA ve bu ve diğer cevaplar yaşlanma etkilenir olmadığı karşılaştırma gibi ilgili uyaranlara sitosolik ve mitokondriyal Ca 2 + tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu prosedür nasıl etki sitozolik ve mitokondriyal Ca 2+ seçilen uyaranlara yanıtları yanı sıra nöron hücresi önlemeyi amaçlayan seçilen ilaçların test yaşlanma gibi yeni anlayışlar verebiliryaşla ilişkili hastalıklarda ölüme.

Introduction

Eksitotoksisite NOS'nin, iskemi gibi nörolojik akıntılar nöronal hasar ve hücre ölümüne neden olan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ve Alzheimer hastalığı 1 gibi nörodejeneratif hastalıklarda. Nörotoksisite Bu tip ağırlıklı Ca glutamat oyunculuk aracılık 2+ -geçirgen, İyonotropik NMDA reseptörleri (NMDAR) 2. Glutamata kültürlenmiş nöronların nöronal apoptoz 4 neden eksitotoksisite 3, yol açabilir. Biz ve diğerleri daha önce NMDA kaynaklı apoptosise nöronal açığı in vitro gelişimi ve 5-8 yaşlanma değişebilir bildirmişlerdir.

Bu yaygın sitosolik içermeyen Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] cyt) 'de bir artış hücrelerin aktivasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir. Bu artış çok yüksek ve / veya yeterince sürekli olduğu, ancak hücre ölümünü 9 tetikleyebilir. Ayrıca, önerilmiştirbu eksitotoksisite mitokondriyal Ca2 + alımı 10, glutamat ile indüklenen hücre ölümü 11 karşı mitokondriyal uncoupler korunan nöronlarla nöronları tedavi yana gerektirir. Mitokondri Ca 2 + çok fazla alırsan, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılması sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin ve uyaran apoptoz serbest lider oluşabilir. Son zamanlarda bu mitokondriyal Ca 2 + alımı doğrudan doğruya tek bir hipokampal nöronlar 5 NMDA ile indüklenen Ca2 + mitokondriyal alımını bu makalede rapor bir yöntemi ölçülerek, nörotoksitisi yaşa bağlı duyarlılık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle öğrenme, hafıza ve diğer bilişsel süreçler 12 gibi fizyolojik süreçlerde yer hipokampus, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların 13 derece hassastır. Bu, in vitro olarak birkaç hafta sonra, ileri sürülmektedir, kültürlenmişhipokampal nöronlar yaşlı nöronlar 14 tipik özelliklerinden bir sayısını göstermektedir. Buna göre, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlar yaşlanma gelişmiş eksitotoksisitenin Ca 2 + aracılı mekanizmalar araştırmak için kapsamlı bir model sağlayabilir.

Sunulan yöntemin genel amacı, bu nedenle, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlarda NMDA reseptör agonistleri tarafından ortaya çıkarılan diferansiyel Ca 2+ yanıtları da dahil olmak üzere yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2 + homeostazı veya Ca 2+ yeniden önemli değişiklikleri araştırmak amacıyla, bir . Yöntem sırasıyla, sıçan hipokampal nöronların kültürü ayrıntılı bir açıklamasını ve bireysel nöronlar floresan ve biyolüminesans görüntüleme Sitozolik ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonları izleme içerir. Kültürlü nöronlar sitozolik Ca 2 + floresan görüntüleme standart bir prosedürdür. Bununla birlikte, bu yöntem, alt için daha az güvenilirdirHücresel Ca mitokondriyal Ca 2 + 2 + olmak üzere ölçümleri. Bu nedenleri bile mM düzeyinde düşük mcM seviyesinden mitokondri değişebilir Ca 2 + konsantrasyonları için sentetik probların uygun hedefleme ve uygunsuz afinite eksikliği sayılabilir. Örneğin aequorin gibi proteinlere göre Ca 2 + prob kullanımı, hücre içi organellere hedef ve spesifik Ca 2+ bağlama siteleri 15 eksik farklı coelenterazines veya mutasyona uğramış problar kullanılarak farklı türevleri Ca 2 + eğilimleri kullanımına izin verdi. Bu şekilde, mitokondri hedefli Aequorini eksprese eden hücrelerin biyoışıldama görüntüleme bireysel nöronlar mitokondriyal Ca 2 + konsantrasyonlarının izlenmesini izin verebilir. Ancak, bu işlem biyoparlaklık görüntüleme 16-18 için foton sayma kameraları ya da ultrasensitif CCD kamera kullanımını gerektirebilir. Daha fazla establ teyit edilmelidir yeni sonuçlar doğurabilir Bu yöntemÖrneğin olarak ished beyin yaşlanması modelleri, eski hayvanlardan beyin dilimleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Avrupa Sözleşmesi 123 / Avrupa Konseyi ve Direktifi 86/609 / EEC sayılı ile anlaşarak Valladolid Üniversitesi hayvan barınağı tesisi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde ele alınmıştır.

Sıçan Hipokampal Nöronlar 1. Kısa ve Uzun Vadeli Kültürü

  1. Poli-D-lisin hazırlanması, 12 mm cam lamelleri kaplama.
    1. En az 24 saat süre ile etanol içinde 12 mm çapında bir cam lamelleri sterilize edin. Bunları steril koşullar altında kurumaya bırakın.
    2. Petri kabındaki parafilm şeridi lamelleri dağıtın. 1 mg / ml poli-D-lisin 200 ul her bir lamel yüzeyi kapatılır. O / N tedavi izin verin.
    3. Ertesi gün, steril koşullar altında 90 dakika boyunca iki kez damıtılmış, steril su ile her 15 dakikada bir lamelleri yıkayın.
    4. Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ile dört sıra çok kaplı plaka Dolgu ile sabitleştirilir. Neurobasal Kültür Ortamı ile takviye edilmelidir% 10 fetal bovin serumu,% 2 B27, 1 ug / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin.
    5. Çok kaplı plaka lamelleri yerleştirin. Kullanılana kadar nemlendirilmiş 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör koruyun.
  2. Yenidoğan sıçanlarda hipokampal nöronlar izolasyonu.
    1. Steril koşullar altında, bir şişeye (20 ul / ml) içinde 1,8 ml papain çözeltisi (şirketinden satın alınmış) hazırlayın: 20 ul'lik bir son konsantrasyon elde etmek için / 1.8 mi Hank artı% 0.6 BSA içinde 40 ul papain ilave ml (ul hesaplanmalıdır ) satıcılar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Hank% 0.6 BSA% 4 sığır serumu albümini 15 ml HBSS ortamı 85 ml karıştırılması ile hazırlanır (BSA, 100 mi HBSS içinde BSA 4 g çözme hazırlanır). Steril bir kaput içinde hazırlayın.
    2. Kullanımdan önce 37 ° C 'de 30 dakika boyunca Hank artı% 0.6 BSA içinde papain inkübe edin. Kullanım öncesi 0,22 um filtre kullanılarak çözelti filtre.
    3. Dulbecco'nun ekleyerek Ham F-12 ortamı hazırlamakIki kez damıtılmış steril su içinde 900 ml Eagle Ortamı tozu (L başına 13.5 g) modifiye edilmiştir. Sonra 6 gr HEPES ve 336 mg NaHCO 3 ekleyebilir ve NaOH 4 N. 1 L çözelti elde ve 0.20 mikron polietersülfon kullanarak filtrelemek için steril su ekleyin kullanarak 7.42 pH ayarlamak (PES) üst filtreyi şişe. Bir steril bir muhafaza içinde bu işlemi uygulayın. Sonunda Kullanmadan önce steril koşullar altında CO 2 ile çözüm doyurabilecek. Mağaza çözümleri 4 ºC de ve onları soğutulmuş kullanın.
    4. Dekapitasyon yenidoğan (P0) fare yavrular Euthanize ve steril HBS orta kafa yıkayın. Steril makas yardımı ile kafatası açın. Bir spatula ile beyin ekstrakte edin ve Ham F-12 ortamı içinde hızlı bir şekilde yıkayın.
    5. Her yarımkürede (Şekil 1B) bir neşter yardımıyla bir çapraz kesim yapın ve Ham F-12 orta içeren Petri taşımak.
    6. Diseksiyon forseps yardımıyla ve büyüteç altında dikkatlice atın meninksler.
      7. <li> büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampus tanımlayın. Sonra bir sınır dikkatlice çekerek ve göz makas kullanarak konumundan kaldırarak korteksten hipokampus ayırın.
    7. Steril Hank ortamında Ca + 2 ve Mg yoksun 2+ artı% 0.6 BSA ile doldurulmuş bir 4-iyi levhaya hipokampal doku transferi ve hipokampal doku yıkayın. Çıkarmadan medya aynı göz makas kullanarak küçük parçalar halinde doku (2 x 2 civarında mm) kesti.
    8. 1,8 ml önceden süzüldü papain çözeltisi ihtiva eden bir şişeye hipokampal parçaları aktarın. Sonra sıra, hafifçe çalkalanarak 37 ºC'de inkübe. 15 dakika sonra, (nihai 50 ng / ml), DNase I çözeltisinin 90 ul ve 15 dk daha inkübe edilir.
    9. 10 ml'lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın ve taze Neurobasal Kültür Ortamı ile fragmanları yıkayın. 5 ml'lik plastik pip ile doku parçaları geçirerek hücre süspansiyonu eldeette.
    10. 5 dakika boyunca 160 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Bir plastik steril Pasteur pipeti kullanarak Süpernatantı ve Neurobasal Kültür Orta 1 ml pipet otomatik bir 1 ml dikkatlice pelet askıya.
    11. Bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücre yoğunluğu ölçün. Neubauer odasına üzerine cam lamel koyun. Hücre süspansiyonu 10 ul ekle. Hücre süspansiyonu homojen ve hiçbir kabarcıklar yapma odasına girer emin olun. Mikroskop altında hücrelerin sayısını ve 30 x 10 3 hücre içeren 40-80 ul uygun bir damla elde etmek için gelen hesaplamaları gerçekleştirmek. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvanların sayısına bağlı olacaktır.
  3. Kısa ve sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültür.
    1. Her bir ila yaklaşık 50 ul arasında bir damla yaklaşık 30 x 10 3 hücreleri Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ihtiva eden dört oyuklu çok kaplı plaka üzerinde önce hazırlanan ve inkübatör plaka muhafazade bir poli-D-lizin kaplı 12 mm çapında bir cam lamel ihtiva eden çok kaplı plaka.
    2. Kültür değiştirmeden deneylerde önce in vitro 2-5 gün (DIV, kısa vadeli, genç kültürler) ya da> 15 DIV (Uzun vadeli, yaşlı kültürler) için nemlendirilmiş 37 ºC ve% 5 CO2 inkübatör primer hipokampal hücreleri korumak Ortam.

Sitosolik Ca 2. Floresans Görüntüleme 2+ Konsantrasyon

  1. Floresan görüntüleme test çözümleri hazırlanması.
    1. NaCl 145, KCI 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glükoz 10, sodyum HEPES, 10 (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın.
    2. NaCl 146, KCI 5, glükoz CaCl 2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış, Mg2 + içermeyen, HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın.
    3. Bir Fina NMDA Mg2 +, -ücretsiz olarak, HEPES-tamponlu salin (HBA) çözme100 mcM l konsantrasyonu ve 10 mcM glisin ile tamamlar.
    4. (MM olarak) çözerek yerine NaCl KCI ihtiva eden bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCI 145, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42) glikoz.
  2. Floresan kalsiyum prob fura2 / AM ile hipokampal hücre yükleme.
    1. Inkübatör kapalı lamelleri içeren hücre kültürü alın ve 500 HBS ul başına iyi içeren yeni bir dört iyi çok kaplı plaka aktararak RT'de HBS ortamı ile yıkayın.
    2. Fura2 kuluçkaya bırakılır / karanlık bir yerde, oda sıcaklığında (25 ° C) sıcaklıkta 60 dakika boyunca (aynı HBA ortam içinde hazırlandı) AM 4 uM.
    3. 60 dakika sonra, taze HBS orta lamelleri yıkayın.
  3. Sitozolik kaydedilmesi floresan görüntüleri [Ca 2 +] kültürlü hücrelerde.
    1. Lamba, mikroskop, perfüzyon sistemi, floresan kamera ve bilgisayarı açın.
    2. Bir termostatlı bir platformda lamelleriters mikroskop sahnede açık 12 mm cam lamelleri ve 40X objektif (1.3 yağ, NA) kullanarak mikroskobik alanı seçin. Ya da yokluğunda test maddelerinin mevcudiyetinde (37 ° C) önceden ısıtılmış HBS ortamı ile sürekli hücreleri serpmek. / Dakika yaklaşık 5-10 ml bir oranda akış muhafaza edin.
      Not: canlı hücreler için hücre perfüzyon Sistem, açık 12 mm cam lamelleri için termostatlı bir platform içine monte edilir. Bir valf kontrol cihazı ile donatılmış 8 hatları yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon sistemi çözümleri serpmek için kullanılır. Bir vakum pompası herhangi bir aşırı yayıcıyı çıkarmak için sorumludur. Solutions içinde boru ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır.
    3. Deklanşör hem uyarma dalga boylarında kapalı bir arka plan görüntüsü yakalama.
    4. 340 ve 380 nm dönüşümlü hücreler Epi-aydınlatır. Tutanak ışığı 520 nm bir fura-2 dikroik ayna tarafından süzülür bir floresan kamera, her 5-10 sn yayılan.
    5. Kayıt süresi bittiğinde, tam sekans o saklamakf görüntüleri daha fazla analiz için bilgisayara 520 nm'de yayılan.
  4. Kaydedilen floresan görüntü analizi.
    1. Deney dosyasını açın. AQUACOSMOS yazılımı kullanarak, 'Oranı' üzerine tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Oranı görüntü bir dizi elde etmek için elde edilen görüntüler olarak piksel oranı piksel hesaplayın.
    2. 'Arka plan eleme' ayarlayarak arka plan çıkarın. Basın 'başlangıç ​​hesabı'.
    3. Basın 'her zaman dizisi' düğmesi ve ilgi antik bölgeleri silmek (ROI). Tek tek hücrelerin kantitatif analiz için, bireysel nöronlar karşılık gelen faiz veya İB'nin yeni bölgeleri kurmak. Her ROI ve her görüntüye karşılık gelen her bir piksel ortalama tüm oran değerleri, bireysel ROI (hücreler) için bu oran floresan değerleri bir kayıt elde etmek.
    4. Bir grafik progr her ROI karşılık gelen oran floresan değerlerini ihraç bireysel kayıtları grafiğini içinduyuyorum.
    5. Uygun bir veri analizi kullanılarak her bir uyarıya cevap olarak oran floresanın artışların büyüklüğü tahmin edilmesi ve yazılımı grafik için ilgili hesaplamalar sağlayın.

Mitokondriyal Ca 3. Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Konsantrasyon

  1. MitGAmut plazmid ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar transfeksiyonu.
    NOT: Hücreler ilk olarak mitokondri hedefli sekans ve yeşil flüoresan proteini (GFP) kaynaşmış bir Ca2 + bağlama sahası eksik mutasyona uğramış Aequorini içeren mitGAmut plazmid ile transfekte edilir. Bu yapı, mitokondriyal Ca 2 + alımı büyük artışlar algılar ve GFP floresan ile transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Plazmid geliştirilmiş ve nazik P. brulet ve birlikte çalışanlar 18 (CNRS, Paris, Fransa) tarafından temin edildi.
    1. Cenin sığır serumu eksik Neurobasal kültür vasatı içeren, Neurobasal TF Hazırlama, B27, gentamicve 2 mM L-glutamin.
    2. Neurobasal TF 50 ul artı bir viyal (Çözelti A) 2.5 ul transfeksiyon reaktifi hazırlayın. 50 Neurobasal TF ul artı 4 ug bir şişe içinde mitGAmut plazmid (Çözelti B) hazırlayın. Sallayarak olmadan 20 dakika boyunca karıştırma izin çözüm A. üzerinde hafifçe çözüm B ekleyin.
    3. Taze Neurobasal TF 200 ul içeren yeni çok kaplı plakalara hipokampal nöron içeren lamelleri aktarın.
    4. Her lamel üzerinde damla çözüm A + B 100 ul damla ekleyin. 30 dakika boyunca çalkalayarak kuluçkalayın. Orta çıkarın. Taze Neurobasal TF hücrelerin bir kez yıkayın. Orijinal Neurobasal Kültür Orta lamelleri dönün.
    5. 37 ° C ve% 5 transfeksiyonundan sonra CO2 seviyesinde ilave bir 24 saat boyunca kültür nöronları etkin ekspresyonu ve probun hedef izin vermek.
  2. Biyoparlaklık görüntüleme için deney çözeltilerinin hazırlanması.
    1. Olarak NMDA 100 uM ya da 145 mM KCI içeren HBS çözümler hazırlayınYukarıda (2.1 Adım). 10 mM Ca içeren 2+ artı 100 mcM digitonin HBS çözeltisi hazırlayın.
  3. Coelenterazine n mitokondri hedefli aequorin Sulandırma.
    1. HBS 200 ul ihtiva eden bir dört plaka transfekte hipokampal nöronlar içeren transfer lamelleri.
    2. 4 uM'lik bir son konsantrasyon elde boyunca HBS'de 200 ul coelenterazine n (200 uM) 4 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. RT (25 ° C), 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edin.
  4. Mitokondriyal kaydedilmesi biyolüminesans görüntüleri [Ca 2 +].
    1. Mikroskop, lamba, perfüzyon sistemi, biyolüminesans kamera ve bilgisayarı açın.
    2. Termostatlı bir (37 ° C) perfüzyon odasına yeniden lamelleri aktarın ve 5-10 ml / dk'lık bir oranda önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak serpmek.
    3. 40X objektif (yağ, NA: 1.3) kullanılarak, a ifade hücreleri içeren mikroskobik alan seçinFITC filtreleri kullanarak yeşil flüoresan proteini (GFP) ekspresyonu ile bağlantılı bir floresan emisyonu ile gösterildiği gibi poaequorins. Tipik bir alanı 1-2 transfekte edilmiş hücreleri içerebilir. Bir CCD kamera kullanarak, GFP floresan görüntü yakalamak.
    4. Mikroskop ışığı kapatın. Işık yolunda bulunan dichroic içeren kutu çıkarın. Uyarma ışık kapatın ve tam karanlık koyu-kutusunu kapatın.
    5. Ya da test solüsyonları 37 ° C'de önceden ısıtılmış olmayan HBS ortamı ile 5-10 ml / dakika hücreleri serpmek.
    6. Fotonik emisyon görüntüleri bir görüntü işlemcisi ile ele bir foton sayma makinesi ile her 10 saniyede yakalayın.
    7. Her bir deneyin sonunda, kalan tüm foton emisyon serbest bırakmak için HBS'de 10 mM digitonin 0.1 mM CaCl2 ile hücreleri geçirgenliği.
      Not: Bu fotonik emisyonlar toplam fotonik emisyonları, Ca 2 + konsantrasyonlarda kalibrasyon için gerekli bir değerini tahmin etmek için yukarı eklenmelidir <./ li>
    8. GFP ilişkili floresan görüntü ile bilgisayarda saklayın biyolüminesans görüntüleri foton sayma görüntüleme önce ele geçirdi.
  5. Mitokondriyal [Ca2 +] yansıtan biyoışıldama görüntülerin analizi.
    1. Özel bir yazılım kullanılarak fotonik emisyonları ölçmek. Fotonik emisyon mitokondriyal serbest Ca dönüştürülebilir 2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] mit) Brini ve ark., 15 tarafından tarif edilen algoritmasını kullanarak yapar.
    2. Deney ve GFP floresan görüntüyü açın. Deneyin başında çekilen floresan görüntülerine göre transfekte hücrelerin şekli çizerek özel yazılım yardımı ile ilgi (ROI) Seç bölgeleri.
    3. Her görüntü aynı ROI yapıştırın. Her ROI toplam fotonik emisyonları zaman içinde her noktada her hücre için parlaklık emisyon değeri (L) elde etmek için özel bir yazılım ile hesaplanır.
    4. Tüm fotonik emiss ekleyinTüm fotonik emisyonları içeren bir biyoışıldama görüntü elde etmek, özel bir yazılım kullanarak, permeabilization digitonin sonra elde edilenler dahil biyoışıldama görüntüleri, iyonlar.
    5. Hesaplamalar için belirli bir yazılıma ilgi her bölge için fotonik emisyonların ihracat değerleri. Bunu yapmak için, her zaman her ROI için biyoparlaklık değerlerini hesaplamak için 'Grafik' üzerine tıklayın. 'Toplam değeri' seçin ve 'tüm görüntüleri mevcut yatırım getirisini kullanın. Basın 'hesapla'. Bir çalışma sayfasına 'txt.file' ve ihracat verileri kaydetmek. Her ROI için, [Ca 2 +] mit aşağıdaki algoritmayı kullanılarak hesaplanır:

      [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];

      burada,
      R = [L / (L toplam λ)] 1 / n
      L ilgi her bölgede ölçüm zamanında yayılan lüminesan olup.
      L toplamıdırÇevrede her bir bölgesi için ölçüm zamanında o anda dokusunda mevcut sayım eklenmesinden sonra kalan toplam lüminesans. λ, K TR K R ve n, değerleri aequorin kombinasyonuna bağlıdır (doğal tipte veya mutasyona uğramış) ile coelenterazin kullanılan (vahşi tip veya n tipi) sabitler yanı sıra kayıt sıcaklığı 16 bulunmaktadır. Burada kullanılan kombinasyon için 37 ºC'de, (AEQ ve coelenterzine n mutasyona uğramış), aşağıdaki değerleri kullanılır: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n 1204 ve λ = 0.138 =.
  6. Uygun bir veri analizi kullanılarak her uyarıcıya yanıt olarak biyolüminesans artışların boyutunu tahmin ve yazılım grafik için ilgili hesaplamalar yapmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada Ca 2 + biçimlenme ve sitozolik ve mitokondriyal üzerindeki NMDA etkilerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif [Ca 2 +] yaşlı nöronlarda. Şekil 1 izole ve neonatal sıçanların hipokampal nöronlar kültürü için prosedürün şemasını göstermektedir. Başlamadan önce, steril, poli-D-lizin kaplı cam lamelleri hazırlamak ve 4-iyi bir çanak onları bulmak gerekir. Ardından, yenidoğan sıçanlar öldürüldü ve beyin kaldırılır. Hipokampus izole sonra, doku dikkatle papain ile disperse edilir. İzole hücreler yıkanmış ve kaplanmış lamelleri kaplanmıştır. Ardından hücreler 2-5 DIV veya sırasıyla genç ya da yaşlı kültürleri, almak için> 15 DIV kültürlü ve Ca 2 + görüntüleme deneyleri için kullanılmaktadır.

Yukarıdaki strateji kullanarak, test etmek için aynı örnekten genç ve yaşlı nöronlar olması mümkündür, örneğin, NMDA [Ca2 +], genç kültürlerdeki sitosolik üzerinde farklı etkileri teşvik edip etmediğininbaşka kültürlerde daha Res. 2, NMDA 100 uM sitosolik daha yüksek artışlar uyardığını göstermektedir [Ca2 +], genç kültürlerde daha yaşlı kültürler. Benzer şekilde, NMDA eski nöronlarda değil, genç nöronlar 5 hücre ölümüne neden olur. Ca 2 + tepkileri çok yüksek olduğu durumlarda, benzer deneyler fura4F 5 mesela gibi boya doymasını önlemek için Ca + 2 için daha az afinitesi olan Ca + 2 probları ile gerçekleştirilebilir. Aynı şekilde, bu sitozolik dinlenme düzeyleri [Ca 2 +] farklı olmadığını öğrenmek için de mümkündür. Ayrıca, NMDAR alt ünitelerine özgü antikorlar kullanılarak niceliksel immünoflüoresans olan bu protokol kombinasyonu spesifik antikorlar 5 mevcut olması koşuluyla NMDA reseptör alt birimlerinin tanımlamasındaki farklılıklara sahip duyarlılığında bağıntılı değişiklikleri sağlayabilir. Sitosolik ölçümleri [Ca2 +] ilgili diğer Paramete değerlendirmek için de kullanılabilirCa 2+ mağaza içerik dahil rs, Ca 2+ için geçirgenliği dinlenme, Ca 2 + temizlenme oranları ve genç ve yaşlı nöronlar arasında olası farklılıkları.

Benzer bir şekilde, bu mitokondriyal tür uyaranların etkisini test etmek de mümkündür: [Ca2 +]. Şekil 3, mitokondri hedefli aequorin ile transfekte hipokampal nöronlar biyoışıldama görüntülemenin bir örneğini göstermektedir. Uyarıldıktan sonra foton emisyon Yayın mitokondriyal artışın bir fonksiyonudur [Ca2 +] elde etti. Mitokondriyal o NMDA kaynaklı artışlar dikkat [Ca 2 +] NMDA zorlukla fotonik emisyonlarını artırır genç hipokampal nöronlar, daha yaşlı nöronlarda çok daha büyük. Bu sonuçlar, sadece NMDA yaş nöronlarda fakat hipokampal hücreleri 5 genç kültürlerinde apoptoza neden açıklamak katkıda bulunabilir. Aynı şekilde, bu mitokondriyal ek farklılıklar için test edilebilirCa 2 + Örneğin özel test etmek için tasarlanmış protokoller kullanılarak genç ve yaşlı nöronlar arasındaki taşıma, Ca mitokondriden 2+ çıkış, hücre içi depolardan Ca2 + salınımı tarafından uyarılan geçirgen nöronlar ve mitokondriyal Ca 2 + alımında mitokondriyal Ca 2 + alımı. Üstelik bu metodoloji eksitotoksisiteye karşı nöro ilgi olabilir mitokondrial Ca 2 + aşırı etkileyen ilaçların test etmek için kullanılan olabilir.

figür 1
Şekil 1: primer sıçan hipokampal nöronlar izolasyonu için Prosedür (A) Poli-D-lisin, 12 mm cam ile kaplanmış kapak sliplerine bir Petri kabındaki ve son olarak, bir 4-çukurlu tabağa aktarılır.. Bir sıçan beyin (B) Dorsal görünümü. Kesme yapılmalıdır nereye noktalı çizgi gösterir. (C) olarak elde edilmesiprimer hipokampal nöron hücrelerinin Askı. Hipokampus çıkardıktan sonra, bir hücre süspansiyonu elde edildi. Daha sonra hücreler, poli-D-lizin kaplı lamelleri içeren 4 oyuklu tabaklarda plakalanır. (D) kültür birincil sıçan hipokampal nöronları gösteren Aydınlık alan görüntü. Bar 10 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2:. NMDA sitosolik arttırır [Ca2 +] hipokampal nöronlar Kısa ve uzun süreli kültürlenmiş nöronlar hipokampus fura2 / AM ile yüklendi ve fluoresans görüntüsü tabi tutuldu. Resimler kısa vadeli (A) ve uzun vadeli temsilcisi parlak bir alan ve Pseudocolor görüntüleri (Oran F340 / F380) (B göstermek [Ca 2 +] (Pseudocolor ölçekleri alt kısmında gösterilir) yansıtır. İzler sitozolik temsilcisi, tek hücreli kayıtları göstermektedir [Ca 2 +] kısa vadeli (A) ve uzun vadeli (B) kültürlü hipokampal nöronlar 100 mcM NMDA cevaben. Bu Sitozolik Not [Ca 2 +] artışlar kısa vadeli kültürlü nöronlar daha uzun vadede çok daha büyük. Bar 10 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. NMDA hipokampal nöronlarda mitokondriyal Ca 2 + aşırı uyaran Kültür hipokampal neurons mitokondri hedeflenen aequorin, GFP kaynaşmış 4 uM koelenterazin ile inkübe edildi ve [Ca2 +] mitokondriyel biyolüminesans görüntülemeye tâbi, düşük afinite ile transfekte edilmiştir. Resimler floresan (GFP) ve birikmiş fotonik emisyonları (aequorin biyolüminesans) temsilcisi kısadan (A) ve uzun vadeli (B) kültürlü hipokampal nöronların görüntüleri gösterir. Lüminesans yoğunluğu (piksel başına 1 ila 16 fotonik emisyonlar) Pseudocolor kodlanmıştır. Kayıtlar kısa (A) ve uzun vadeli (B) kültürlü hipokampal nöronlar (mitokondriyal [Ca 2 +] olarak ifade edilmiştir) fotonik emisyon salınımını göstermektedir. NMDA 100 uM artmıştır mitokondriyal [Ca2 +] yaş nöronlarda değil, genç kültürlenmiş hippokampal nöronlardaki. Bar 10 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ a>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2+ yeniden şekillenmesi homeostasis bilişsel kaybı ile ilgili olmuştur, iskemik hasar, eksitotoksisite ve nörodejenerasyon yatkınlık artmıştır. In vitro bu hipotezi araştırmak için Ca 2+ görüntüleme prosedürleri mevcuttur. Ne yazık ki, eski hipokampal nöronlar uygulanabilir kültürleri güvenilir değildir. Son zamanlarda, bu gözlenmiştir olduğu sıçan hipokampal nöronlarının ROS birikimi lipofusin granüller, heterokromatik odaklar oluşumu, aktivasyon pJNK ve p53 / p21 yollan, kolesterol de dahil olmak üzere, in vivo olarak kaybı yaşlanma tipik özelliklerinden bulunan birçok ve uzun süreli kültürleri Ca + 2 kanal yoğunluğu değiştirir ve NMDA reseptörleri 14. Buna göre, sıçan hipokampal nöronların genç ve yaşlı kültürlerde Ca 2+ görüntüleme deneyleri yaşlanan beyinde Ca 2 + biçimlenme yeni anlayışlar sağlayabilir. Kültür hippoca için kritik bir durumuzun vadede MPAL nöronlar iki yönlüdür. İlk olarak, yukarıda belirtildiği gibi, çok düşük yoğunlukta hücreler plaka önemlidir. İkinci olarak, hücreler ortam değiştirilmeden desteklenmiş Neurobasal ortamda kültürlenir. Bu yaklaşım glia ama onların aşırı büyümesini engelleyen varlığını tanır. Bu kültür için şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

Sentetik Ca 2 + prob ile Floresan görüntüleme sitozolik izlenmesine olanak sağlar [Ca 2 +] bireysel nöronlar 19. Genç ve yaşlı nöronlarda bu yaklaşımın kullanımı kültüründe yaş ile yanıtların değişikliklerin izlenmesini sağlar. Örneğin Şekil 2 tipik parlak alan ve [Ca 2 +] cyt yaşlı kültürlerden gelen genç nöronlar ve nöronlar NMDA tarafından uyarılan artışların Ca 2+ görüntüleri gösterir. Yaşlı nöronlarda yanıtlar genç nöronların çok daha büyük olduğuna dikkat edin. Ancak, bu işlem [Ca güvenilir değil 2+] [Ca2 +] mM seviyesinden uM aşağıdaki değişebilir, örneğin, mitokondriya, gibi sub-hücresel organellerde içinde ölçümleri. Bu gibi durumlarda, protein bazlı, mitokondriya hedefli problar, örneğin, olduğu Aequorini geliştirilmiştir. Ca 2+ için afinite ince sırasıyla, çok düşük ya da çok yüksek [Ca 2 +] olanlar istirahat mitokondri içine uzandı ve uyarılmış gibi koşullarını izlemek için ayarlanmış olabilir çünkü bu prob özellikle ilginçtir. Daha özel olarak, yabani tip Aequorini veya Ca olmayan bir mutasyona uğramış Aequorini 2+ afinitesini değiştirme bağlanma yerleri birini seçmek mümkündür. Farklı coelenterazines (vahşi tip, h, n) nin farklı aequorins 17 ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman İnce ayar elde edilir. Ca 2+ görüntüleme için floresan kullanılması yaygın ise ancak, biyolüminesans izleme basit değildir ve foton sayma kameraları gerektirebilir. Neyse ki, aequorinsondalar, burada kullanılan gibi, ortak express için geliştirilmiştir GFP 18 daha fotonik emisyonlara mümkün, onları daha kararlı hale ve GFP ilişkili floresan transfekte hücrelerin basit kimlik sağlıyor. Nöronlarda biyolüminesans görüntüleme başarı kullanılan Foton sayma kameranın verimliliği değil, aynı zamanda mitokondri hedefli prob transfeksiyon verimliliği de bağlıdır. Hipokampal nöronlar durumda, basit bir kimyasal transfeksiyon yüksek hassasiyette Foton sayma kamerası mevcut olması şartıyla çalışabilir. Kültür hipokampal nöronlar parlak saha, GFP flöresanı, genç, yaşlı biyoışıldama görüntü Şekil 2 örnek Şekil. Ayrıca mitokondriyal artışlar da gösterilmiştir [Ca2 +] transfekte hipokampal nöronlar kaydedilen NMDA ile indüklenen. NMDA etkisi genç nöronlarda daha yaşlı kültürlü nöronlar çok daha büyük olduğuna dikkat edin. Diğer durumlarda, transfeksiyonunun verimition virüs türevli vektörler 16,18 kullanılarak arttırılabilir. Seçenek olarak ise, protein-bazlı, hücre içi Ca2 + probları barındıran transgenik farelerin gelişimi hatta in vivo, gelecekteki uygulamalar için gelişmekte olan bir seçenektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Culture Medium Gibco 21103-049
HBSS medium Gibco 14170-088
Ham's F-12 medium Gibco 31330-038
DNase I (from bovine pancreas) Sigma D5025-15KU
Fetal Bobine Serum Lonza DE14-801E
B27 Gibco 17504-044
Gentamicin Gibco 15750
L-glutamine Gibco 25030-032
12 mm glass coverslips Labolan 0111520/20012
Papain Worthington LS003127
4-well multidish plaques Nunc 176740
Petry dishes JD Catalan s.l. 2120044T
Sterile pipettes Fisher Scientific 431030
Fura2-AM Life Technologies F1201
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-027
Coelenterazine n Biotium BT-10115-2250 uG
Digitonin Sigma D5628
NMDA Sigma  M3262
Glycine Sigma 50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system EXFO
ORCA ER fluorescence camera Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera Hamamatsu
VC-8 valve controller Warner Instruments
SH-27B heating system  Warner Instruments
Aquacosmos Software Hamamatsu Photonics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
  2. MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
  3. Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
  4. Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
  5. Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
  6. Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
  7. Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
  8. Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
  9. Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
  10. Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
  11. Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
  12. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
  13. Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
  14. Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
  15. Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
  16. Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
  17. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
  18. Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
  19. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).

Tags

Nörobilim Sayı 106 Eksitotoksisite NMDAR sitozolik kalsiyum mitokondriyal kalsiyum hipokampal nöronlar
Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calvo-Rodríguez, M.,… More

Calvo-Rodríguez, M., Villalobos, C., Nuñez, L. Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (106), e53330, doi:10.3791/53330 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter