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Neuroscience

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53330
Automatic Translation
1, 1, 2
1Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, 2Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

Abstract

La sensibilité à la mort cellulaire neuronale associée à la neurodégénérescence et l'ischémie sont extrêmement augmentée dans le cerveau mais vieilli mécanismes responsables sont mal connus. L'excitotoxicité, un processus censé contribuer à des lésions des neurones induite par les deux injurieux, est médiée par l'activation des récepteurs du glutamate, qui favorise l'influx de Ca2 + et Ca2 + mitochondrial surcharge. Un changement important dans l'homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou remodelage de Ca2 + intracellulaire homéostasie peut favoriser des dommages neurone dans les vieux neurones. Pour étudier le remodelage de Ca2 + dans le vieillissement, nous avons utilisé l'imagerie de cellules vivantes dans les cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat qui ressemblent à certains égards neurones in vivo âgés. Pour cette fin, cellules de l'hippocampe sont, en premier lieu, fraîchement dispersé de nouvelles hippocampes né de rat et plaqués sur des lamelles couché, verre poli-D-lysine. Puis les cultures sont conservés dans les médias contrôlés pendant plusieurs jours ou plusieurs wEeks pour enquêter jeunes et vieux neurones, respectivement. Deuxièmement, des neurones en culture sont chargés avec fura2 et soumis à des mesures de la concentration cytosolique de Ca2 + en utilisant l'imagerie de fluorescence de rapport numérique. Troisièmement, des neurones en culture sont transfectées avec des plasmides exprimant un tandem de faible affinité équorine et la GFP ciblée vers les mitochondries. Après 24 heures, l'aequorine l'intérieur des cellules est reconstitué avec coelentérazine et les neurones sont soumis à l'imagerie par bioluminescence pour la surveillance de la concentration en Ca2 + mitochondrial. Cette procédure en trois étapes permet la surveillance des réponses mitochondriaux et cytosoliques Ca2 + à des stimuli appropriés comme par exemple l'agoniste des récepteurs du glutamate NMDA et de comparer si ces réponses et d'autres sont influencés par le vieillissement. Cette procédure peut donner de nouvelles indications sur la façon dont le vieillissement influence cytosolique et les réponses Ca 2+ mitochondriales à des stimuli sélectionnés ainsi que les essais de médicaments sélectionnés visant à prévenir neuronela mort dans les maladies liées à l'âge.

Introduction

L'excitotoxicité est l'un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l'ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer 1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur ​​Ca 2+ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) 2. L'exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité 3, ce qui provoque l'apoptose neuronale 4. Nous et d'autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité neuronale à l'apoptose induite par le NMDA peut changer avec le développement in vitro et le vieillissement de 5-8.

Il est largement admis que l'augmentation de la libre cytosolique-concentration de Ca 2+ ([Ca 2+] CYT) conduit à l'activation des cellules. Toutefois, si cette hausse est trop élevée et / ou assez soutenue, il peut déclencher la mort cellulaire 9. En outre, il a été proposéque excitotoxicité nécessite Ca 2+ mitochondrial absorption 10, puisque le traitement des neurones avec un neurones découplant mitochondrial protégées contre induite par le glutamate mort cellulaire 11. Si mitochondries prennent trop de Ca 2+, de l'ouverture du pore de transition mitochondrial perméabilité peut se produire, conduisant à la libération de cytochrome c et d'autres facteurs pro-apoptotiques, et induisant l'apoptose. Nous avons récemment montré que cette mitochondrial Ca2 + absorption est directement liée à la sensibilité dépendant de l'âge à l'excitotoxicité, en mesurant directement NMDA induite par Ca2 + mitochondrial absorption dans les neurones hippocampiques individuelles 5, un procédé qui est indiqué dans cet article. L'hippocampe, impliquée dans les processus physiologiques tels que l'apprentissage, la mémoire et d'autres processus cognitifs 12, est très vulnérable au vieillissement et les troubles neurodégénératifs 13. Il a été proposé que, après plusieurs semaines in vitro, en cultureneurones de l'hippocampe montrent un certain nombre de caractéristiques typiques des neurones âgées de 14. En conséquence, les neurones d'hippocampe en culture à long terme peuvent fournir un modèle global pour enquêter Ca 2+ mécanismes médiées de excitotoxicité accrue dans le vieillissement.

L'objectif global de la méthode présentée est, par conséquent, pour enquêter sur des changements substantiels dans l'homéostasie intracellulaire de Ca2 + ou Ca 2+ remodelage dans le vieillissement du cerveau, y compris les réponses de l'écart Ca induites par des agonistes des récepteurs NMDA dans un long-terme neurones d'hippocampe en culture . Le procédé comprend une description détaillée de la culture des neurones d'hippocampe de rat et de la surveillance des concentrations de Ca2 + cytosolique et mitochondriale par fluorescence et l'imagerie par bioluminescence dans les neurones individuels, respectivement. Imagerie de fluorescence de Ca2 + cytosolique dans des neurones en culture est une procédure standard. Cependant, cette méthode est moins fiable pour souscellulaire, y compris les mesures de Ca2 + mitochondrial Ca 2+. Les raisons en sont le manque de ciblage des sondes synthétiques et d'affinité inapproprié pour concentrations de Ca2 + qui peuvent changer dans les mitochondries du niveau de iM faible, même au niveau mM. L'utilisation de Ca 2+ sondes à base de protéines comme par exemple l'aequorine, a permis de cibler les organelles subcellulaires et à l'utilisation de dérivés différentes affinités Ca2 + en utilisant différentes sondes ou cœlentérazines mutées dépourvues de Ca 2+ spécifique 15 sites de liaison. De cette manière, l'imagerie par bioluminescence de cellules exprimant l'aequorine mitochondriale ciblée peut permettre le contrôle des concentrations de Ca2 + mitochondrial dans des neurones individuels. Pourtant, cette procédure peut nécessiter l'utilisation de caméras de comptage de photons ou des caméras CCD ultrasensibles pour la bioluminescence imagerie 16-18. Cette méthode peut donner de nouveaux résultats qui devraient être confirmée dans plus establMINE modèles de vieillissement du cerveau que, par exemple, des tranches de cerveau de vieux animaux.

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Protocol

Déclaration éthique: procédures impliquant des sujets animaux ont été manipulés dans des protocoles approuvés par le centre de logement des animaux de l'Université de Valladolid, en accord avec la Convention européenne 123 / Conseil de l'Europe et de la directive 86/609 / CEE.

1. Culture à court et à long terme des neurones de l'hippocampe de rat

  1. Préparation de la poly-D-lysine recouvert de 12 mm des lamelles de verre.
    1. Stériliser 12 mm lamelles de verre de diamètre dans l'éthanol pendant au moins 24 heures. Laissez-les sécher dans des conditions stériles.
    2. Répartir les lamelles sur une bande de parafilm dans une boîte de Petri. Recouvrir la surface de chaque lamelle avec 200 ul de 1 mg / ml de poly-D-lysine. Autoriser le traitement O / N.
    3. Le lendemain, laver les lamelles avec de l'eau stérile distillée deux fois toutes les 15 min pendant 90 min dans des conditions stériles.
    4. Remplir une plaque de quatre puits multiple à avec 500 pi de Neurobasal milieu de culture par puits. Neurobasal milieu de culture doit être complétée par10% de sérum de veau fœtal, 2% de B27, 1 ug / ml de gentamicine et 2 mM de L-glutamine.
    5. Placez les lamelles dans la plaque multiple à. Les maintenir dans une humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur jusqu'à utilisation.
  2. Isolement des neurones de l'hippocampe de rats nouveau-nés.
    1. Préparer 1,8 ml de solution de papaïne (directement acheté) dans un flacon (20 ul / ml) dans des conditions stériles: Pour obtenir une concentration finale de 20 ul / ml, ajouter environ 40 ul de la papaïne dans 1,8 ml de Hank plus 0,6% de BSA (pi doivent être calculés selon les conditions des fabricants). 0,6% de BSA de Hank est préparée en mélangeant 85 ml de milieu HBSS avec 15 ml d'albumine de sérum bovin à 4% (BSA, préparé résolution de 4 g de BSA dans 100 ml de HBSS). Préparer dans une hotte stérile.
    2. Incuber la papaïne dans Hank plus 0,6% de BSA pendant 30 minutes à 37 ° C avant utilisation. Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,22 um avant utilisation.
    3. Préparer le milieu F-12 de Ham en ajoutant DulbeccoModifié Moyen poudre de Eagle (13,5 g par litre) dans 900 ml d'eau stérile doublement distillée. Ensuite, ajoutez 6 g HEPES et 336 mg de NaHCO 3 et ajuster le pH à 7,42 en utilisant NaOH 4 N. Ajouter de l'eau stérile afin d'obtenir une solution à 1 L et filtrer à l'aide d'une polyéthersulfone 0,20 um (PSE) Bottle Top filtre. Effectuer ce processus dans une hotte stérile. Enfin saturer la solution avec CO 2 dans des conditions stériles avant utilisation. Solutions de conserver à 4 ° C et les utiliser réfrigérés.
    4. Euthanasier nouveau-né (P0) ratons par décapitation et laver la tête en milieu HBS stérile. Ouvrez le crâne à l'aide de ciseaux stériles. Extraire le cerveau avec une spatule et laver rapidement en F-12 du milieu de Ham.
    5. Faire une coupe en diagonale à l'aide d'un scalpel dans chaque hémisphère (figure 1B), et de la porter à une boîte de Pétri contenant F-12 du milieu de Ham.
    6. Méninges Jeter soigneusement avec l'aide de pinces à dissection et sous une loupe.
      7. <li> Identifier l'hippocampe dans un emplacement concave caractéristique sur le cortex utilisant loupe. Ensuite, séparer l'hippocampe du cortex en tirant délicatement d'une frontière et de la retirer de sa position à l'aide des ciseaux pour les yeux.
    7. Transférer le tissu hippocampique à une plaque 4-bien rempli avec le milieu dépourvu de Ca 2+ et Mg 2+ stérile de Hank plus 0,6% de BSA et laver tissu hippocampique. Sans enlever les médias couper le tissu en petits morceaux (environ 2 x 2 mm) en utilisant les mêmes ciseaux oculaires.
    8. Transférer des morceaux de l'hippocampe dans un flacon contenant 1,8 ml de solution de papaïne pré-filtrée. Puis les incuber à 37 ºC avec occasionnelle, agitant doucement. 15 min plus tard, ajouter 90 ul de solution de DNase I (50 ug / ml final) et incuber pendant 15 min supplémentaires.
    9. Transférer le tissu à un tube de centrifugeuse de 10 ml et laver les fragments avec des produits frais Neurobasal milieu de culture. Obtenir suspension cellulaire en passant des fragments de tissu à travers un 5 ml en plastique pipette.
    10. Centrifugeuse suspension de cellules à 160 g pendant 5 min. Retirer le surnageant avec une pipette Pasteur stérile en plastique et suspendre pastille soigneusement avec une pipette automatique de 1 ml dans 1 ml de milieu de culture Neurobasal.
    11. Mesurer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage Neubauer. Mettez la lamelle de verre au-dessus de la chambre de Neubauer. Ajouter 10 ul de suspension cellulaire. Assurez-vous que la suspension de cellules pénètre dans la chambre de manière uniforme et sans faire de bulles. Comptez le nombre de cellules sous le microscope et effectuer des calculs correspondants pour obtenir une baisse appropriée de 40-80 ul contenant 30 x 10 3 cellules. Le nombre total de cellules dépendra du nombre d'animaux utilisés.
  3. À court terme et à long terme de la culture des neurones d'hippocampe de rat.
    1. Sur la plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de Neurobasal milieu de culture préparé avant et conservés dans l'incubateur, la plaque d'environ 30 x 10 3 cellules dans une chute d'environ 50 pi à chaquepuits de la plaque contenant une boîte multiple poly-D-lysine-enduit, 12 mm lamelle de verre de diamètre.
    2. Maintenir cellules de l'hippocampe primaires dans un humidifié 37 ° C et 5% de CO 2 incubateur pendant 2-5 jours in vitro (DIV, à court terme, les cultures jeunes) ou> 15 DIV (à long terme, les cultures âgées) avant les expériences sans changer la culture médias.

2. Fluorescence Imaging de cytosolique de Ca 2+ Concentration

  1. Préparation des solutions d'essai pour l'imagerie de fluorescence.
    1. Préparer une solution saline externe tamponnée HEPES (HBS) contenant, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 glucose, le sodium-10 HEPES (pH 7,42).
    2. Préparer un exempt externe, Mg 2+, une solution saline tamponnée HEPES (HBS) solution contenant, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, le glucose 10 et 10 HEPES (pH 7,42).
    3. Résolvez saline NMDA dans Mg 2+ exempt, tamponné HEPES (HBS) à une final concentration de 100 uM et de compléter avec 10 uM glycine.
    4. Préparer une solution HBS contenant KCl au lieu de NaCl en résolvant (en mM): 145 KCl, MgCl2 1, CaCl2 1, le glucose et 10 HEPES 10 (pH 7,42).
  2. Chargement des cellules de l'hippocampe avec sonde fluorescente de calcium fura2 / AM.
    1. Prenez la culture cellulaire contenant des lamelles de l'incubateur et les laver avec un milieu à température ambiante HBS en les transférant à une nouvelle plaque de quatre puits contenant multiple à 500 pi de HBS par puits.
    2. Incuber les cellules avec fura2 / AM 4 pm (préparés dans le même milieu HBS) pendant 60 min à température ambiante (25 ° C) dans un endroit sombre.
    3. Après 60 min, laver lamelles avec un milieu HBS frais.
  3. Enregistrement des images de fluorescence cytosolique [Ca2 +] dans des cellules en culture.
    1. Allumez la lampe, microscope, système de perfusion, un appareil photo de fluorescence et l'ordinateur.
    2. Placez les lamelles dans une plate-forme pour thermostatéouverts 12 mm lamelles de verre sur la scène du microscope inversé et sélectionnez un champ microscopique en utilisant un objectif 40X (huile, NA: 1,3). Perfuser cellules en continu avec préchauffé (37 ºC) moyen HBS en l'absence ou la présence de substances d'essai. Maintenir le débit à une vitesse d'environ 5-10 ml / min.
      Remarque: Cellule système de perfusion de cellules vivantes est montée dans une plate-forme ouverte pour thermostaté 12 mm lamelles de verre. 8 lignes du système de perfusion par gravité équipé d'un dispositif de commande de soupape est utilisé pour perfuser les solutions. Une pompe à vide est responsable de l'enlèvement tout support excès. Les solutions sont chauffées au moyen d'un système de chauffage en tube.
    3. Capturer une image de fond avec l'obturateur fermé à deux longueurs d'onde d'excitation.
    4. Epi-éclairer cellules alternativement à 340 et 380 nm. La lumière d'enregistrement émise à 520 nm toutes les 5 à 10 secondes avec un appareil photo de fluorescence, qui est filtré par un miroir dichroïque fura-2.
    5. Lorsque la période d'enregistrement est terminé, mémoriser la séquence complète oimages f émis à 520 nm dans l'ordinateur pour une analyse ultérieure.
  4. L'analyse des images fluorescentes enregistrées.
    1. Ouvrez le fichier de l'expérience. Utilisation du logiciel de aquacosmos, cliquez sur "Ratio" et sélectionnez la plage de rapport désiré. Calculer le pixel par rapport à des pixels les images résultantes pour obtenir une séquence d'images de rapport.
    2. Soustraire fond en ajustant le 'élimination de fond ». De calcul de démarrage 'Press.
    3. Appuyer sur le bouton et d'effacer les anciennes régions d'intérêt séquence tous les temps »(Rois). Pour l'analyse quantitative des cellules individuelles, établir de nouvelles régions d'intérêt ou ROI correspondant aux neurones individuels. Moyenne de toutes les valeurs de rapport à chaque pixel correspondant à chaque ROI et chaque image afin d'obtenir un enregistrement de valeurs de fluorescence de rapport pour chaque ROI (cellules).
    4. Pour représenter graphiquement les enregistrements individuels exporter les valeurs rapport de fluorescence correspondant à chaque ROI à un progr graphiqueun m.
    5. Faites les calculs correspondants pour estimer la taille de la hausse du ratio fluorescences en réponse à chaque stimulation à l'aide d'une analyse de données approprié et graphiquement logiciel.

3. La bioluminescence imagerie de mitochondrial Ca 2+ Concentration

  1. La transfection de neurones hippocampiques en culture avec le plasmide mitGAmut.
    REMARQUE: Les cellules sont transfectées avec le premier plasmide contenant une séquence mitGAmut de mitochondries ciblée et une aequorine mutée manque un site de liaison de Ca2 + fusionné à la protéine fluorescente verte (GFP). Cette construction détecte fortes augmentations en Ca2 + mitochondrial absorption et permet d'identifier les cellules transfectées par la fluorescence de la GFP. Le plasmide a été développé et a aimablement fourni par P. Brûlet et ses collègues 18 (CNRS, Paris).
    1. Préparer Neurobasal TF, contenant Neurobasal milieu de culture, sans sérum de veau foetal, B27, gentamicet 2 mM de L-glutamine.
    2. Préparer 50 ul de Neurobasal TF ainsi 2,5 ul réactif de transfection dans un flacon (solution A). Préparer 50 ul de Neurobasal TF plus 4 ug mitGAmut plasmide dans un flacon (solution B). Ajouter délicatement la solution B en solution A. Laisser le mélange pendant 20 min, sans agitation.
    3. Transférer les lamelles contenant les neurones hippocampiques à de nouvelles plaques Multidish contenant 200 pi de Neurobasal TF frais.
    4. Ajouter goutte à goutte 100 pi de solution A + B sur chaque lamelle. Incuber pendant 30 min. Retirer le moyen. Laver une fois les cellules avec Neurobasal TF frais. Retourner les lamelles à l'original Neurobasal milieu de culture.
    5. Les neurones de culture pour une 24 heure supplémentaire à 37 ° C et 5% de CO 2 après la transfection pour permettre l'expression efficace et le ciblage de la sonde.
  2. Préparation de solutions de test pour l'imagerie par bioluminescence.
    1. Préparer des solutions HBS contenant NMDA 100 um ou 145 mM de KCl queci-dessus (étape 2.1). Préparer une solution contenant HBS mM Ca 2+, plus 10 digitonine 100 um.
  3. Reconstitution de aequorine mitochondries ciblée avec coelentérazine n.
    1. Lamelles de transfert contenant les neurones hippocampiques transfectées à une plaque de quatre puits contenant 200 pi de HBS.
    2. Ajouter 4 ul de coelentérazine n (200 uM) à 200 ul de HBS pour une concentration finale de 4 uM et mélanger doucement. Incuber pendant 2 heures à température ambiante (25 ° C) et dans l'obscurité.
  4. Enregistrement d'images de bioluminescence de mitochondrial [Ca2 +].
    1. Allumer le microscope, la lampe, le système de perfusion, de bioluminescence caméra et l'ordinateur.
    2. Transfert lamelles reconstituées à un (37 ºC) chambre de perfusion thermostaté et perfuser constamment avec une solution HBS préchauffé à un taux de 5-10 ml / min.
    3. L'utilisation d'un objectif 40X (huile, NA: 1,3), sélectionner un champ microscopique contenant des cellules exprimant l'unpoaequorins comme indiqué par émission de fluorescence associée à l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) en utilisant les filtres FITC. Un champ typique peut contenir 1-2 cellules transfectées. Capturer l'image de fluorescence de la GFP, en utilisant une caméra CCD.
    4. Éteignez la lumière du microscope. Retirer la boîte contenant dichroïque situé dans la voie de la lumière. Éteignez la lumière d'excitation et fermer la boîte noire pour l'obscurité complète.
    5. Perfuser les cellules à 5-10 ml / min avec un milieu HBS avec ou sans solutions de test pré-chauffé à 37 ° C.
    6. Capturer des images d'émissions photoniques toutes les 10 s avec un appareil de comptage de photons manipulés avec un processeur d'image.
    7. À la fin de chaque expérience, perméabiliser les cellules avec 0,1 mM digitonine dans 10 mM de CaCl2 dans HBS afin de libérer toutes les émissions photoniques restants.
      Remarque: Ces émissions photoniques doivent être additionnés afin d'estimer les émissions totales photoniques, une valeur requise pour l'étalonnage de concentrations de Ca2 + <./ li>
    8. Images de bioluminescence de magasin dans l'ordinateur avec l'image de fluorescence de la GFP associé capturés avant l'imagerie à comptage de photons.
  5. L'analyse d'images de bioluminescence reflétant mitochondrial [Ca2 +].
    1. Quantifier les émissions photoniques utilisant un logiciel spécifique. Émissions photoniques peuvent être convertis en Ca 2+ libre mitochondrial concentration ([Ca2 +] mit) en utilisant l'algorithme décrit par Brini et al. 15.
    2. Ouvrir l'expérience et l'image de fluorescence de la GFP. Sélectionnez régions d'intérêt (ROI) avec l'aide d'un logiciel spécifique en dessinant la forme des cellules transfectées selon les images de fluorescence capturés au début de l'expérience.
    3. Collez les mêmes ROI sur chaque image. Le total des émissions photoniques dans chaque ROI sont calculées avec le logiciel spécifique pour obtenir la valeur d'émission de luminescence (L) pour chaque cellule à chaque point dans le temps.
    4. Ajouter tout le SIGE photoniquedes ions dans les images de bioluminescence, y compris ceux obtenus après perméabilisation digitonine, en utilisant le logiciel spécifique, pour obtenir une image de bioluminescence contenant toutes les émissions photoniques.
    5. La valeur des exportations des émissions photoniques pour chaque région d'intérêt à un logiciel spécifique pour les calculs. Pour ce faire, cliquez sur "Graph" afin de calculer les valeurs de bioluminescence pour chaque ROI à chaque fois. Sélectionnez «valeur totale» et «utiliser ROI actuelle à toutes les images. Appuyez sur 'Calculer'. Enregistrez le 'txt.file' et exporter des données vers une feuille de calcul. Pour chaque ROI, [Ca 2+] mit est calculé en utilisant l'algorithme suivant:

      [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];

      où,
      R = [L / (L totale λ)] 1 / n
      L est la luminescence émise au moment de la mesure dans chaque région d'intérêt.
      L total estla luminescence totale restant après l'addition des chiffres présents dans le tissu à ce moment au moment de la mesure pour chaque région d'intérêt. λ, TR K, K R et n sont des constantes dont les valeurs dépendent combinaison de aequorine (type sauvage ou muté) et coelenterazin utilisé (type sauvage ou de type n) ainsi que la température 16 enregistrement. Pour la combinaison utilisée ici (muté AEQ et coelenterzine n), à 37 ºC, nous avons utilisé les valeurs suivantes: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 et λ = 0,138.
  6. Faites les calculs correspondants pour estimer la taille des hausses de bioluminescence en réponse à chaque stimulus utilisant une analyse de données approprié et graphiquement logiciel.

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Representative Results

Nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer le remodelage de Ca2 + et les effets de NMDA sur cytosolique et mitochondriale [Ca2 +] dans les neurones ans. La figure 1 montre le schéma de la procédure d'isolement et de culture de neurones de l'hippocampe des rats nouveau-nés. Avant de commencer, nous devons nous préparer, enduits, lamelles stériles poly-D-lysine verre et de les localiser dans un plat 4 puits. Ensuite, les rats nouveau-nés sont tués et enlevés le cerveau. Après avoir isolé l'hippocampe, le tissu est soigneusement dispersé en utilisant la papaïne. Les cellules isolées sont lavées et étalées sur des lamelles revêtues. Puis les cellules sont cultivées pendant 2-5 DIV ou> 15 DIV pour obtenir jeunes ou âgés de cultures, respectivement, et utilisé pour Ca 2+ des expériences d'imagerie.

Utilisation de la stratégie ci-dessus, il est possible d'avoir, jeunes et vieux neurones à partir du même échantillon à tester, par exemple, si NMDA induit des effets différentiels sur cytosolique [Ca2 +] chez les jeunes cultures que dans les cultures anciennes. figure 2 montre que 100 pM de NMDA induit des augmentations plus importantes cytosolique [Ca2 +] dans les cultures âgées que chez les jeunes cultures. De même, NMDA induit la mort cellulaire dans les neurones anciennes, mais non dans les neurones 5 jeunes. Dans les cas où les réponses de Ca sont très élevés, des expériences similaires peuvent être réalisées avec des sondes de Ca2 + avec moins d'affinité pour le Ca2 + pour éviter la saturation de colorant comme, par exemple fura4F 5. De la même manière, il est également possible de savoir si les niveaux de repos de cytosolique [Ca2 +] sont différents. En outre, la combinaison de ce protocole avec immunofluorescence quantitative utilisant des anticorps spécifiques pour les sous-unités de NMDAR peut permettre des changements corrélat réactivité avec des différences dans l'expression des récepteurs NMDA sous-unités, à condition que des anticorps spécifiques sont disponibles 5. Mesures de cytosolique [Ca2 +] peuvent également être utilisées pour évaluer d'autres paramete pertinentesrs y compris le contenu de la mémoire de Ca, reposant perméabilité au Ca 2+, Ca 2+ taux de dédouanement et de leurs éventuelles différences entre jeunes et âgés de neurones.

D'une manière similaire, il est également possible de tester les effets de ces stimuli mitochondriale sur [Ca2 +]. La figure 3 montre un exemple de l'imagerie par bioluminescence des neurones de l'hippocampe transfectées avec l'aequorine mitochondriale ciblée. Sortie des émissions photoniques après stimulation est une fonction de la montée en mitochondrial [Ca2 +] obtenu. Notez que la hausse induite par NMDA dans mitochondriale [Ca2 +] sont beaucoup plus grandes dans les neurones âgés que chez les jeunes neurones de l'hippocampe, où NMDA augmente peine émissions de photoniques. Ces résultats peuvent contribuer à expliquer pourquoi NMDA induit l'apoptose seulement dans les neurones âgés, mais pas dans les jeunes cultures de cellules de l'hippocampe 5. De la même manière, il est possible de tester les différences supplémentaires dans mitochondrialeCa 2+ manipulation entre les jeunes et âgés de neurones en utilisant des protocoles spécifiquement conçus pour tester, par exemple, Ca 2+ sortie de mitochondries, mitochondrial Ca 2+ absorption dans les neurones perméabilisées et mitochondrial Ca 2+ absorption induites par Ca2 + libération des réserves intracellulaires. En outre, cette méthode pourrait être utilisée pour tester les médicaments affectant mitochondrial Ca 2+ surcharge qui peut être d'intérêt pour la neuroprotection contre l'excitotoxicité.

Figure 1
Figure 1: Procédure d'isolement de neurones hippocampiques primaires de rat (A) Poly-D-lysine, verre revêtu de lamelles couvre-objet de 12 mm sont préparés dans une boîte de Pétri et finalement transférés dans une boîte de 4 puits.. (B) Vue dorsale d'un cerveau de rat. La ligne pointillée indique où la coupe doit être faite. (C) obtenir queUSPENSION des cellules neuronales hippocampiques primaires. Après élimination de l'hippocampe, une suspension cellulaire est obtenue. Ensuite, les cellules sont étalées dans des boîtes 4 puits contenant des lamelles couvre-objet enduites de poly les-D-lysine. Image lumineuse de terrain montrant neurones d'hippocampe de rat primaires en culture (D). Bar représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. NMDA augmente cytosolique [Ca2 +] dans les neurones hippocampiques court et les neurones hippocampiques en culture à long terme ont été chargées avec fura2 / h et soumis à une imagerie par fluorescence. Photos montrent des images représentatives vives sur le terrain et pseudocolor (Ratio F340 / F380) de court terme (A) et à long terme (B [Ca2 +] (échelles de pseudocolor sont indiqués au bas). Traces montrent, enregistrements mono-cellulaires représentatives de cytosolique [Ca2 +] en réponse à 100 um NMDA dans à court terme (A) et à long terme (B) des neurones de l'hippocampe en culture. Notez que cytosolique [Ca2 +] augmentations sont beaucoup plus grande dans le long terme que dans des neurones en culture à court terme. Bar représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. NMDA induit mitochondrial Ca 2+ surcharge dans les neurones hippocampiques hippocampe en culture neurons ont été transfectées avec la faible affinité, les mitochondries aequorine cible fusionnée à la GFP, incubées avec 4 uM de coelentérazine et soumis à une imagerie par bioluminescence mitochondrial de [Ca2 +]. Photos montrent la fluorescence (GFP) et les émissions accumulées photoniques (aequorine de bioluminescence) des images de court représentant (A) et à long terme (B) des neurones de l'hippocampe en culture. Intensité de la luminescence est codé en pseudo-(de 1 à 16 émissions photoniques par pixel). Enregistrements montrent la libération des émissions photoniques (exprimés en mitochondrial [Ca2 +]) en court (A) et à long terme (B) des neurones de l'hippocampe en culture. 100 uM de NMDA mitochondriale accrue [Ca2 +] dans les neurones âgés mais pas chez les jeunes neurones de l'hippocampe en culture. Bar représente 10 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ a>

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Discussion

Le remodelage de Ca 2+ intracellulaire homéostasie dans le cerveau de vieillissement a été liée à la perte cognitive, une susceptibilité accrue aux lésions ischémiques, excitotoxicité et la neurodégénérescence. Pour vérifier cette hypothèse in vitro, les procédures d'imagerie de CA sont disponibles. Malheureusement, cultures viables de vieux neurones de l'hippocampe ne sont pas fiables. Récemment, il a été observé que les cultures à long terme de neurones d'hippocampe de rat de nombreuses présente des caractéristiques typiques de vieillissement in vivo, y compris l'accumulation des ROS, la formation de granules de lipofuscine, foyers hétérochromatique, l'activation de pJNK et p53 / voies de p21, la perte de cholestérol, et modifie la densité des canaux de Ca et 14 récepteurs NMDA. En conséquence, les expériences d'imagerie Ca chez les jeunes et les vieilles cultures de neurones d'hippocampe de rat peuvent fournir de nouvelles perspectives de Ca 2+ remodelage dans le vieillissement du cerveau. Une condition qui est essentiel pour la culture hippocaMPAL neurones dans le long terme est double. Tout d'abord, il est important de plaquer les cellules à une densité très faible comme indiqué ci-dessus. Deuxièmement, les cellules sont cultivées dans Neurobasal additionné moyen sans changer le milieu. Cette approche permet la présence de cellules gliales mais en évitant leur trop croissance. Le schéma d'une telle culture est représenté sur la Figure 1.

Imagerie de fluorescence avec des sondes synthétiques de Ca2 + permet la surveillance de cytosolique [Ca2 +] dans 19 neurones individuels. L'utilisation de cette approche chez les jeunes et âgés de neurones permet le suivi des changements dans les réponses avec l'âge dans la culture. Par exemple la figure 2 montre champ clair typique et les images de Ca des augmentations de [Ca 2+] cyt induite par NMDA chez les jeunes neurones et les neurones à partir de cultures âgées. Notez que les réponses dans les neurones âgés sont beaucoup plus grandes que chez les jeunes neurones. Toutefois, cette procédure ne sont pas fiables pour [Ca 2+] Organelles sous-cellulaires à moins de mesures comme, par exemple, des mitochondries, où [Ca2 +] ci-dessous peuvent varier à partir de la uM de dessus du niveau mM. Dans ces cas, à base de protéines, des sondes de mitochondries ciblées ont été développés comme, par exemple, l'aequorine. Cette sonde est particulièrement intéressant car son affinité pour le Ca 2+ peut être finement réglé pour surveiller [Ca2 +] des conditions très basses ou très élevées comme celles atteintes à l'intérieur des mitochondries dans repos et stimulés, respectivement. Plus précisément, il est possible de sélectionner le type aequorine sauvage ou un aequorine muté sans Ca 2+ sites de liaison de modifier l'affinité. Le réglage fin est atteint lorsque différents cœlentérazines (type sauvage, H, N) sont utilisés en combinaison avec différents aequorins 17. Cependant, alors que l'utilisation de la fluorescence pour Ca de l'imagerie est très répandu, suivi bioluminescence est pas simple et peut exiger le comptage de photons caméras. Heureusement, aequorinesondes, comme celui utilisé ici, ont été améliorés pour co-expriment la GFP 18 les rendant plus stable, capable de produire des émissions plus photoniques et permettant une identification simple de cellules transfectées par le GFP associé fluorescence. Le succès de l'imagerie par bioluminescence dans les neurones dépend non seulement de l'efficacité de l'appareil de comptage de photons utilisé mais également sur l'efficacité de la transfection de la sonde de mitochondries ciblée. Dans le cas des neurones de l'hippocampe, une transfection chimique simple peut travailler à condition qu'un sensibles caméra haute de comptage de photons est disponible. La figure 2 montre des exemples de fond clair, fluorescence de la GFP et des images de bioluminescence des jeunes et des personnes âgées dans les neurones de la culture de l'hippocampe. Il montre également l'augmentation des mitochondrial [Ca2 +] induite par NMDA enregistrée dans les neurones hippocampiques transfectées. Notez que l'effet de NMDA est beaucoup plus grande dans des neurones en culture âgés que chez les jeunes neurones. Dans d'autres cas, l'efficacité de la transfection peut être augmentée en utilisant des vecteurs dérivés de virus 16,18. En variante, le développement de souris transgéniques abritant, des sondes à base de protéines intracellulaires de Ca 2+ est une option pour les approches futures émergente, peut-être même in vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Culture Medium Gibco 21103-049
HBSS medium Gibco 14170-088
Ham's F-12 medium Gibco 31330-038
DNase I (from bovine pancreas) Sigma D5025-15KU
Fetal Bobine Serum Lonza DE14-801E
B27 Gibco 17504-044
Gentamicin Gibco 15750
L-glutamine Gibco 25030-032
12 mm glass coverslips Labolan 0111520/20012
Papain Worthington LS003127
4-well multidish plaques Nunc 176740
Petry dishes JD Catalan s.l. 2120044T
Sterile pipettes Fisher Scientific 431030
Fura2-AM Life Technologies F1201
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-027
Coelenterazine n Biotium BT-10115-2250 uG
Digitonin Sigma D5628
NMDA Sigma  M3262
Glycine Sigma 50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system EXFO
ORCA ER fluorescence camera Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera Hamamatsu
VC-8 valve controller Warner Instruments
SH-27B heating system  Warner Instruments
Aquacosmos Software Hamamatsu Photonics

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References

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Neuroscience Excitotoxicité NMDAR calcium cytosolique calcium mitochondrial neurones de l'hippocampe
Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe
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Calvo-Rodríguez, M.,… More

Calvo-Rodríguez, M., Villalobos, C., Nuñez, L. Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (106), e53330, doi:10.3791/53330 (2015).

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