Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neurones de l&#39;hippocampe

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Fluorescence et bioluminescence imagerie des Subcellular Ca

7.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/53330

⸱

1 décembre 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

Dans cet article

Résumé

Le remodelage intracellulaire en Ca²⁺ au cours du vieillissement peut contribuer à l’excitotoxicité et aux lésions neuronales, processus médiés par la surcharge en Ca²⁺. Notre objectif était d’étudier le remodelage du Ca²⁺ dans le cerveau vieillissant en utilisant l’imagerie par fluorescence et bioluminescence du Ca²⁺ cytosolique et mitochondrial dans des cultures à long terme de neurones de l’hippocampe du rat, un modèle de vieillissement neuronal.

Résumé

La sensibilité à la mort cellulaire neuronale associée à la neurodégénérescence et l'ischémie sont extrêmement augmentée dans le cerveau mais vieilli mécanismes responsables sont mal connus. L'excitotoxicité, un processus censé contribuer à des lésions des neurones induite par les deux injurieux, est médiée par l'activation des récepteurs du glutamate, qui favorise l'influx ^de Ca2 + et ^Ca2 + mitochondrial surcharge. Un changement important dans l'homéostasie intracellulaire ^de Ca2 + ou remodelage de ^Ca2 + intracellulaire homéostasie peut favoriser des dommages neurone dans les vieux neurones. Pour étudier le remodelage ^de Ca2 + dans le vieillissement, nous avons utilisé l'imagerie de cellules vivantes dans les cultures à long terme de neurones hippocampiques de rat qui ressemblent à certains égards neurones in vivo âgés. Pour cette fin, cellules de l'hippocampe sont, en premier lieu, fraîchement dispersé de nouvelles hippocampes né de rat et plaqués sur des lamelles couché, verre poli-D-lysine. Puis les cultures sont conservés dans les médias contrôlés pendant plusieurs jours ou plusieurs wEeks pour enquêter jeunes et vieux neurones, respectivement. Deuxièmement, des neurones en culture sont chargés avec fura2 et soumis à des mesures de la concentration cytosolique ^de Ca2 + en utilisant l'imagerie de fluorescence de rapport numérique. Troisièmement, des neurones en culture sont transfectées avec des plasmides exprimant un tandem de faible affinité équorine et la GFP ciblée vers les mitochondries. Après 24 heures, l'aequorine l'intérieur des cellules est reconstitué avec coelentérazine et les neurones sont soumis à l'imagerie par bioluminescence pour la surveillance de la ^{concentration} en Ca2 + mitochondrial. Cette procédure en trois étapes permet la surveillance des réponses mitochondriaux et cytosoliques ^Ca2 + à des stimuli appropriés comme par exemple l'agoniste des récepteurs du glutamate NMDA et de comparer si ces réponses et d'autres sont influencés par le vieillissement. Cette procédure peut donner de nouvelles indications sur la façon dont le vieillissement influence cytosolique et les réponses Ca ²⁺ mitochondriales à des stimuli sélectionnés ainsi que les essais de médicaments sélectionnés visant à prévenir neuronela mort dans les maladies liées à l'âge.

Introduction

L'excitotoxicité est l'un des mécanismes les plus importants qui contribuent à une lésion neuronale et la mort cellulaire dans injurieux neurologiques tels que l'ischémie, et dans certaines maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer ^1. Ce type de neurotoxicité est principalement médiée par le glutamate agissant sur Ca ²⁺ -permeable, les récepteurs NMDA (NMDAR ionotropique) ^2. L'exposition des neurones cultivés à glutamate peut entraîner des excitotoxicité ^3, ce qui provoque l'apoptose neuronale ^4. Nous et d'autres avons précédemment rapporté que la vulnérabilité ne....