Abstract
Suscetibilidade a morte celular neuronal associada a neurodegeneração e isquemia são extremamente aumentada no cérebro envelhecido mas os mecanismos responsáveis são mal conhecidos. A excitotoxicidade, um processo que se acredita contribuir para a lesão neuronal induzida por ambos os insultos, é mediada pela activação de receptores de glutamato que promove influxo de Ca2 + mitocondrial e sobrecarga de Ca2 +. Uma mudança substancial na homeostase intracelular de Ca2 + ou remodelação de Ca2 + intracelular homeostase pode favorecer danos aos neurônios nos neurônios velhos. Para investigar Ca 2+ remodelação no envelhecimento temos usado imagens de células vivas em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos que se assemelham em alguns aspectos neurônios in vivo com idade. Para este fim, as células do hipocampo são, em primeiro lugar, recém-dispersa de novas hipocampo de ratos recém nascidos e semeadas em lamelas revestido, vidro poli-D-lisina. Em seguida, as culturas são mantidas em meios controlada durante vários dias ou vários weeks para investigar jovens e velhos neurônios, respectivamente. Em segundo lugar, os neurónios em cultura são carregados com fura2 e submetido à medição da concentração citosólica de Ca2 + utilizando imagiologia digital de relação de fluorescência. Em terceiro lugar, neurônios cultivados são transfectadas com plasmídeos que expressam um conjunto de aequorin baixa afinidade e GFP alvejado a mitocôndria. Após 24 horas, aequorin dentro das células é reconstituído com coelenterazina e neurônios são sujeitas a imagem de bioluminescência para monitorização da concentração de Ca2 + mitocondrial. Este processo de três passos permite a monitorização de citosólica e respostas de Ca 2+ mitocondriais a estímulos relevantes como, por exemplo, o agonista do receptor de glutamato NMDA e comparar se estas e outras respostas são influenciadas pelo envelhecimento. Este processo pode produzir novos conhecimentos sobre a forma como o envelhecimento e influência citosólica de Ca2 + mitocondrial respostas a estímulos seleccionados, bem como o teste de fármacos seleccionados que visam prevenir células neuronaismorte em doenças relacionadas à idade.
Introduction
A excitotoxicidade é um dos mecanismos mais importantes que contribuem para o dano neuronal e morte celular em insultos neurológicos tais como a isquémia, e em algumas doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidade é mediada principalmente pela glutamato atuação no Ca 2+ -permeable, receptores NMDA (NMDAR ionotrópica) 2. A exposição de culturas de neurónios ao glutamato pode levar a excitotoxicidade 3, o que provoca a apoptose neuronal 4. Nós e outros autores relataram anteriormente que a vulnerabilidade neuronal para a apoptose induzida por NMDA podem mudar com o desenvolvimento in vitro e envelhecimento 5-8.
É amplamente aceito que um aumento do free-citosólico concentração de Ca2 + ([Ca2 +] cit) leva à ativação de células. No entanto, se este aumento é muito elevada e / ou sustentada suficiente, pode desencadear a morte celular 9. Além disso, foi propostoexcitotoxicity que requer Ca 2+ mitocondrial captação de 10, uma vez que o tratamento de neurônios com um neurônios desacoplador mitocondrial protegidas contra a morte celular induzida pelo glutamato 11. Se mitocôndrias ocupam muito Ca2 +, a abertura do poro de transição da permeabilidade mitocondrial pode ocorrer, conduzindo à libertação de citocromo c e outros factores pró-apoptóticos, e induzindo a apoptose. Mostrámos recentemente que esta absorção de Ca2 + mitocondrial está directamente relacionado com a sensibilidade dependente da idade à excitotoxicidade, medindo directamente induzida por NMDA mitocondrial absorção Ca2 + nos neurónios do hipocampo individuais 5, um método que é relatado neste artigo. O hipocampo, envolvida em processos fisiológicos, tais como aprendizagem, memória e outros processos cognitivos 12, é altamente vulnerável ao envelhecimento e doenças neurodegenerativas 13. Tem sido proposto que, após várias semanas in vitro, em culturaneurônios do hipocampo mostrar uma série de características típicas de neurônios com 14. Assim, a longo prazo neurônios do hipocampo em cultura pode fornecer um modelo abrangente para investigar Ca2 + mecanismos mediados do reforço da excitotoxicidade no envelhecimento.
O objectivo geral do presente método é, por conseguinte, para investigar mudanças substanciais na homeostase intracelular de Ca2 + ou Ca2 + remodelação envelhecimento no cérebro incluindo o diferencial de Ca 2+ induzidos por agonistas de respostas de receptor de NMDA em um longo prazo neurónios do hipocampo em cultura . O método inclui uma descrição detalhada da cultura de neurónios de hipocampo de rato e a monitorização das concentrações citosólicas e mitocondriais Ca 2+ por fluorescência e imagem de bioluminescência em neurónios individuais, respectivamente. Imagiologia de fluorescência de Ca2 + citosólico em culturas de neurónios é um procedimento padrão. No entanto, este método é menos fiável para a subcelular de Ca2 + mitocondrial incluindo medições de Ca 2+. As razões para isso incluem a falta de direcionamento adequado de sondas sintéticas e afinidade inadequado para as concentrações de Ca2 + que podem mudar na mitocôndria do nível mM baixa, mesmo com o nível mM. O uso de sondas de Ca 2+ com base em proteínas como por exemplo a aequorina, tem permitido o direccionamento para organelos subcelulares e a utilização de derivados diferentes afinidades de Ca2 + utilizando diferentes sondas coelenterazines ou mutadas falta Ca 2+ sítios de ligação específica 15. Desta forma, a bioluminescência de imagem de células que expressam aequorin segmentada por mitocôndrias pode permitir o controlo das concentrações de Ca2 + mitocondrial em neurônios individuais. No entanto, este procedimento pode exigir o uso de câmeras de contagem de fótons ou câmeras CCD ultra-sensíveis para a bioluminescência de imagem 16-18. Este método pode produzir novos resultados que devem ser confirmados em mais established modelos de envelhecimento do cérebro como, por exemplo, fatias de cérebro de animais velhos.
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Protocol
Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais tenham sido manipuladas em protocolos aprovados pela instalação de alojamento dos animais Universidade Valladolid de acordo com a Convenção Europeia 123 / Conselho da Europa ea Directiva 86/609 / CEE.
1. Curto e Longo prazo Cultura de Rat neurônios do hipocampo
- Preparação de poli-D-lisina revestido, de 12 mm de lamelas de vidro.
- Esterilizar 12 mm de diâmetro lamelas de vidro em etanol durante pelo menos 24 horas. Deixe secar em condições estéreis.
- Distribuir as lamelas sobre uma tira de parafilm numa placa de Petri. Cobrir a superfície de cada lamela com 200 ul de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir que o tratamento S / N.
- No dia seguinte, lavar as lamelas com água estéril duplamente destilada a cada 15 min durante 90 min sob condições estéreis.
- Encha uma placa de quatro bem multidish com 500 ul de meio de cultura Neurobasal por poço. Neurobasal Meio de Cultura deve ser complementada com10% de soro fetal bovino, 2% B27, 1 ug / ml de gentamicina e 2 mM de L-glutamina.
- Coloque as lamelas na placa multidish. Mantê-los numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 até à sua utilização.
- Isolamento de neurónios do hipocampo de ratos recém-nascidos.
- Prepare a 1,8 ml de solução de papaína (adquiridas directamente) num frasco (20 ul / ml) sob condições estéreis: Para se obter uma concentração final de 20 ul / ml de adicionar cerca de 40 ul de papaína em 1,8 ml de Hank mais 0,6% de BSA (ul deve ser calculada dependendo das condições do fornecedor). 0,6% de BSA de Hank é preparado por mistura de 85 mL de meio HBSS com 15 ml de 4% de albumina de soro bovino (BSA, preparado solução 4 g de BSA em 100 mL de HBSS). Prepare-lo em um capuz estéril.
- Incubar a papaína em Hank mais 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ° C antes da utilização. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um antes da utilização.
- Prepare meio F-12 de Ham, acrescentando DulbeccoPó de Meio de Eagle (13,5 g por L) de modificação em 900 ml de água estéril duplamente destilada. Em seguida, adicionar 6 g de HEPES e 336 mg de NaHCO3 e ajustar o pH a 7,42 com NaOH 4 N. Adicionar água estéril para se obter uma solução de 1 L e filtrá-la usando uma polietersulfona 0.20 uM (PES) Frasco filtro superior. Leve este processo em uma capa estéril. Finalmente saturar a solução com CO2 em condições estéreis antes da utilização. Soluções armazenar a 4 ºC e usá-los refrigerados.
- Euthanize recém-nascido (P0) filhotes de ratos por decapitação e lavar a cabeça em meio HBS estéril. Abra o crânio com a ajuda de uma tesoura esterilizada. Extrair o cérebro com uma espátula e lavá-lo rapidamente em meio F-12 de Ham.
- Fazer um corte diagonal com o auxílio de um bisturi em cada hemisfério (Figura 1B), e transportá-lo para uma placa de Petri contendo meio F-12 de Ham.
- Meninges Descartar cuidadosamente com a ajuda de uma pinça de dissecção e sob uma lupa. <li> Identificar o hipocampo em um local côncava característica sobre o córtex utilizando lupa. Em seguida, separar o hipocampo a partir do córtex puxando cuidadosamente a partir de uma fronteira e removê-lo da sua posição usando uma tesoura olho.
- Transferir o tecido do hipocampo a uma placa de 4 bem cheio com meio estéril de Hank sem Ca 2+ e Mg 2+, mais 0,6% de BSA e lavar o tecido do hipocampo. Sem retirar os meios cortar o tecido em pequenos pedaços (cerca de 2 x 2 mm), utilizando as mesmas tesouras olho.
- Transferir peças do hipocampo para um frasco contendo 1,8 ml de solução de papaína pré-filtrado. Em seguida, incubar-los a 37 ºC com ocasional, agitação suave. 15 min depois, adicionar 90 ul de ADNase I (solução 50 ug / ml final) e incubar durante 15 min adicionais.
- Transferir o tecido para um tubo de centrífuga de 10 ml e lava-se os fragmentos com Neurobasal fresco Meio de Cultura. Obter suspensão celular por passagem do tecido através de fragmentos de 5 ml de semente de plásticoette.
- Centrifuga-se a suspensão de células 160 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico estéril e suspender sedimento cuidadosamente com uma pipeta de 1 mL automatizados em 1 ml de meio de cultura Neurobasal.
- Medir a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Coloque a lamela de vidro através da câmara de Neubauer. Adicionar 10 ul de suspensão de células. Certifique-se a suspensão de células entra de maneira uniforme e sem fazer bolhas na câmara. Contar o número de células ao microscópio e executar cálculos correspondentes para obter uma gota de 40-80 ul adequado contendo 30 x 10 3 células. O número total de células irá depender do número de animais utilizados.
- Sobre a placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de meio de cultura Neurobasal preparado antes e mantido na incubadora, placa de cerca de 30 x 10 3 em células de uma gota de cerca de 50 ul de cadapoço da placa de multidish contendo um poli-D-lisina-revestidas, 12 mm de diâmetro lamela de vidro.
- Manter as células primárias de hipocampo numa atmosfera humidificada com 37 ° C e 5% de CO2 durante 2-5 dias in vitro (DIV, a curto prazo, as culturas jovens) ou> 15 DIV (de longo prazo, as culturas envelhecidas) antes de experiências sem alterar a cultura mídia.
2. imagens de fluorescência de Ca2 + citosólico Concentração
- Preparação de soluções de teste para imagens de fluorescência.
- Prepara-se uma solução salina externa tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 145, KCl 5 mM, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10, HEPES de sódio-10 (pH 7,42).
- Prepara-se uma solução externa -livre, Mg 2+, solução salina tamponada com HEPES (HBS) contendo, em mM: NaCl 146, KCl 5 mM, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42).
- Resolver soro fisiológico NMDA em Mg 2 + livre, HEPES (HBS) a uma final concentração de 100 mM e completá-lo com 10 mM de glicina.
- Prepara-se uma solução de HBS contendo KCl em vez de NaCl através da resolução de (em mM): KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10 e HEPES 10 (pH 7,42).
- Carregando de células do hipocampo com sonda fluorescente cálcio fura2 / AM.
- Pegue a cultura de células contendo lamelas de fora da incubadora e lave-os com meio HBS à RT, transferindo-os para uma nova placa de quatro bem multidish contendo 500 ul de HBS por poço.
- Incubar as células com fura2 / AM 4 uM (preparados no mesmo meio HBS) durante 60 min à temperatura ambiente (25 ° C) em um local escuro.
- Após 60 minutos, lave lamelas com meio HBS fresco.
- Gravação de imagens de fluorescência de cytosolic [Ca 2+] em células cultivadas.
- Acender a luz, microscópio, sistema de perfusão, câmera de fluorescência e computador.
- Coloque as lamelas em uma plataforma com termostato paraabertas 12 mm lamelas de vidro sobre a fase de microscópio invertido e seleccionar um campo microscópico usando uma objectiva de 40x (óleo, NA: 1,3). Perfundir continuamente com células pré-aquecido (37 ° C) forma HBS na ausência ou na presença das substâncias de ensaio. Manter o fluxo a uma velocidade de cerca de 5-10 ml / min.
Nota: sistema de perfusão celular para células vivas é montado em uma plataforma com termostato para abrir 12 mm lamelas de vidro. 8-linhas do sistema de perfusão conduzido por gravidade equipado com um controlador de válvula é utilizado para perfundir as soluções. Uma bomba de vácuo é responsável pela remoção de qualquer excesso de meio. As soluções são aquecidas usando um sistema de aquecimento no tubo. - Capturar uma imagem de fundo com o obturador fechado em ambos os comprimentos de onda de excitação.
- Epi-iluminarem células alternadamente a 340 e 380 nm. Luz da ficha emitida a 520 nm a cada 5-10 segundos com uma câmara de fluorescência, que é filtrado por um espelho dicróico Fura-2.
- Quando o período de gravação terminar, guarde a sequência completa oimagens de f emitida a 520 nm no computador para análise posterior.
- A análise das imagens gravadas fluorescentes.
- Abra o arquivo experimento. Usando o software aquacosmos, clique em 'Razão' e selecione o intervalo proporção desejada. Calcula-se a relação pixel por pixel das imagens resultantes, a fim de se obter uma sequência de imagens de relação.
- Subtrair fundo, ajustando a "eliminação de fundo". Prima 'cálculo start'.
- Prima 'todas as vezes sequência de' botão e apagar as antigas regiões de interesse (ROI). Para a análise quantitativa das células individuais, estabelecer novas regiões de interesse ou ROIs correspondentes aos neurônios individuais. Média de todos os valores de relação em cada pixel correspondente a cada ROI e cada imagem para obter uma gravação dos valores de fluorescência relação para ROIs individuais (células).
- Para representar graficamente as gravações individuais exportar os valores proporção de fluorescência correspondentes a cada ROI a um progr gráficasou.
- Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na razão de fluorescências em resposta a cada estimulação usando uma análise de dados e gráficos de software adequado.
3. Bioluminescência imagem das mitocondrial concentração de Ca2 +
- A transfecção de neurónios do hipocampo em cultura com o plasmídeo mitGAmut.
NOTA: As células são primeiro transfectadas com o plasmídeo contendo uma sequência mitGAmut segmentada por mitocôndrias e aequorina uma mutação sem um local de ligação ao Ca2 + fundida à proteína fluorescente verde (GFP). Esta construção detecta grandes aumentos de Ca2 + mitocondrial na absorção e permite a identificação de células transfectadas pela fluorescência de GFP. O plasmídeo foi desenvolvido e gentilmente fornecida por P. brulet e colegas de trabalho 18 (CNRS, Paris).- Prepare Neurobasal TF, contendo meio de cultura Neurobasal, sem soro fetal de bovino, B27, gentamice 2 mM de L-glutamina.
- Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 2,5 mL de reagente de transfecção num frasco (solução A). Preparar 50 ul de TF Neurobasal mais 4 ^ g de plasmídeo mitGAmut num frasco (Solução B). Adicionar suavemente solução B durante solução A. Permitir a mistura, durante 20 min, sem agitação.
- Transferir as lamelas contendo neurônios do hipocampo para novas placas multidish contendo 200 mL de TF Neurobasal fresco.
- Adicionar gota a gota 100 ml de solução de A + B sobre cada lamela. Incubar durante 30 min. Remover o meio. Lavar uma vez com células TF Neurobasal fresco. Retorne as lamelas ao original Neurobasal Meio de Cultura.
- Neurónios de cultura durante mais 24 horas adicionais a 37 ° C e 5% de CO 2 ap a transfeco para permitir a expressão eficiente e segmentação da sonda.
- Preparação de soluções de teste para imagem de bioluminescência.
- Preparar soluções de HBS contendo 100 | iM de NMDA ou KCl 145 mM comoacima (Passo 2.1). Preparar a solução de HBS contendo 10 mM Ca 2+ mais digitonina 100 uM.
- Reconstituição de aequorin segmentada por mitocôndrias com coelenterazina n.
- Lamelas de transferência contendo neurónios do hipocampo transfectadas para uma placa de quatro poços contendo 200 ul de HBS.
- Adicionar 4 ul de coelenterazina N (200 uM) para 200 ul de HBS para uma concentração final de 4 | iM e misturar suavemente. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente (25 ° C) e no escuro.
- A gravação de imagens bioluminescência de mitocondrial [Ca 2+].
- Ligue o microscópio, a lâmpada, o sistema de perfusão, a bioluminescência e a câmara de computador.
- Transferir para um lamelas reconstituídos (37 ºC) câmara de perfusão termostatado e perfundir continuamente com uma solução pré-aquecida de HBS a uma taxa de 5-10 ml / min.
- Utilizando uma objectiva de 40X (óleo, NA: 1,3), seleccionar um campo do microscópio que contém células que expressam o umpoaequorins como mostrado pela emissão de fluorescência associada com a expressão de proteína fluorescente verde (GFP) usando os filtros FITC. Um campo típico pode conter 1-2 células transfectadas. Capturar a imagem GFP fluorescência, usando uma câmera CCD.
- Desligue a luz do microscópio. Retire a caixa contendo o dicróicas localizado na via de luz. Desligue a luz de excitação e fechar o dark-caixa para completa escuridão.
- Perfundir células a 5-10 ml / min com meio de HBS com ou sem soluções de ensaio pré-aquecido a 37 ° C.
- Capturar imagens de emissão fotônica a cada 10 segundos com uma câmera de fóton-contagem manuseados com um processador de imagem.
- No final de cada experiência, permeabilizar as células com digitonina 0,1 mM em 10 mM de CaCl2 em HBS, a fim de libertar todos os restantes emissões fotónicas.
Nota: Estas emissões fotônicas, devem ser adicionadas a fim de estimar o total de emissões fotônicas, um valor necessário para a calibração em concentrações de Ca2 + <./ li> - Imagens bioluminescência loja no computador a imagem de fluorescência da GFP associado com a imagem capturada antes de contagem de fótons.
- Análise de imagens bioluminescência reflectindo mitocondrial [Ca 2+].
- Quantificar as emissões fotônicas usando software específico. Emissões fotónicas pode ser convertida em Ca 2+ concentração livre mitocondrial ([Ca 2+] MIT) utilizando o algoritmo descrito por Brini et al. 15.
- Abra a imagem fluorescência da GFP e experiência. Seleccionarem regiões de interesse (ROI) com a ajuda de um software específico por o desenho da forma das células transfectadas de acordo com as imagens de fluorescência capturados no início da experiência.
- Cole os mesmos ROIs em cada imagem. As emissões totais de fotônicos em cada ROI são calculadas com software específico para obter o valor de emissão de luminescência (L) para cada célula em cada ponto no tempo.
- Adicione-se toda a Emiss fotônicoiões nas imagens bioluminescência, incluindo os obtidos após permeabilização digitonina, utilizando o software específico, para obter uma imagem de bioluminescência contendo todas as emissões fotónicas.
- Os valores das exportações de emissões fotônicas para todas as regiões de interesse para um software específico para cálculos. Para fazer isso, clique em 'Gráfico', a fim de calcular os valores bioluminescência para cada ROI em cada momento. Selecione "valor total" e "usar ROI atual para todas as imagens. Pressione "calcular". Salve o 'txt.file' e exportar dados para uma planilha. Para cada ROI [Ca 2+] mit é calculado usando o seguinte algoritmo:
[Ca 2+] (m) = [I + (R · K TR) - 1] / [K R - (R K · R)];
Onde,
R = [G / (G λ total)] 1 / n
L é o luminescência emitida no momento da medição em cada região de interesse.
L no total éa luminescência total restante após a adição das contagens presentes no tecido em que o tempo na altura da medição para cada região de interesse. λ, TR K, K R e n são constantes cujos valores dependem da combinação de aequorina (tipo selvagem ou mutado) e coelenterazin utilizado (do tipo selvagem ou de tipo n), bem como a temperatura de 16 gravação. Para a combinação usada aqui (mutado AEQ e coelenterzine n), a 37 ºC, foram utilizados os seguintes valores: R K = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1.204 e λ = 0138.
- Adicione os cálculos correspondentes para estimar o tamanho dos aumentos na bioluminescência em resposta a cada estímulo usando uma análise de dados e gráficos de software adequado.
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Representative Results
Aqui, descrevemos um método simples para avaliar Ca2 + remodelação e os efeitos de NMDA no citosol e mitocondrial [Ca2 +], em neurónios envelhecidos. A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do processo para o isolamento e a cultura de neurónios de hipocampo de ratos recém-nascidos. Antes de começar, precisamos preparar estéreis, revestidos, lamelas de vidro poli-D lisina e localizá-los em um 4-bem prato. Então, ratos recém-nascidos são mortos eo cérebro removido. Após o isolamento do hipocampo, o tecido é cuidadosamente dispersa usando papaína. As células isoladas são lavadas e plaqueadas em lamelas revestidas. Em seguida, as células são cultivadas por 2-5 DIV ou> 15 DIV para obter jovens ou envelhecidas culturas, respectivamente, e usado para Ca 2+ experimentos com imagens.
Usando a estratégia acima, é possível ter jovens e velhos neurónios do mesmo espécime de teste, por exemplo, se o NMDA induz efeitos diferenciais sobre citosólica [Ca 2+] em Young cultures do que em culturas mais velhas. A Figura 2 mostra que NMDA 100 uM induz maiores aumentos na [Ca2 + citosólico] em culturas mais velhas do que em culturas de jovens. Da mesma forma, NMDA induz a morte celular em neurônios velhos, mas não em neurônios jovens 5. Nos casos onde as respostas de Ca 2+ são muito elevados, experiências semelhantes pode ser realizada com sondas de Ca2 + com menos afinidade para o Ca2 +, para evitar a saturação do corante como, por exemplo fura4F 5. Do mesmo modo, também é possível saber se níveis de repouso de citosólica [Ca2 +] são diferentes. Além disso, a combinação deste protocolo com quantitativa imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para as subunidades NMDAR pode permitir alterações na capacidade de resposta correlacionar com diferenças na expressão de subunidades do receptor de NMDA, desde que os anticorpos específicos estão disponíveis 5. Medidas de cytosolic [Ca 2+] pode ser usada também para avaliar outras paramete relevanters incluindo Ca2 + armazenar conteúdo, descansando permeabilidade ao Ca2 +, Ca 2+ taxas de depuração e suas possíveis diferenças entre jovens e idosos neurônios.
De um modo semelhante, também é possível testar os efeitos de tais estímulos mitocondrial em [Ca2 +]. A Figura 3 mostra um exemplo de imagem de bioluminescência de neurónios do hipocampo transfectadas com aequorina-alvo as mitocôndrias. A libertação de emissões fotónicas após a estimulação é uma função do aumento da mitocondrial [Ca 2+] alcançado. Observe que os aumentos induzidos por NMDA em mitocondrial [Ca 2+] são muito maiores nos neurônios do que em jovens com idades compreendidas entre os neurônios do hipocampo, onde NMDA mal aumenta as emissões fotônicos. Estes resultados podem contribuir para explicar por NMDA induz a apoptose apenas em neurónios envelhecidos mas não em culturas de células jovens hipocampo 5. Da mesma forma, é possível testar as diferenças adicionais em mitocondrialCa 2+ manipulação entre jovens e idosos neurônios utilizando protocolos especificamente destinadas a testar, por exemplo, Ca 2+ saída da mitocôndria, mitocondrial de Ca2 + captação nos neurônios permeabilizadas e mitocondrial de Ca2 + captação induzida por Ca 2+ liberação dos estoques intracelulares. Além disso, esta metodologia pode ser usada para testar as drogas que afectam a sobrecarga de Ca2 + mitocondrial que pode ser de interesse para a neuroprotecção contra a excitotoxicidade.
Figura 1: Processo para o isolamento de neurónios do hipocampo de rato primária (A) poli-D-lisina, de 12 mm de vidro revestido lamelas são preparados numa placa de Petri e finalmente transferidos para um prato de 4 poços.. (B) Vista dorsal de um cérebro de rato. A linha pontilhada indica onde o corte deve ser feito. (C) Obtenção comoUSPENSÃO de células neuronais do hipocampo primários. Após a remoção do hipocampo, uma suspensão de células é obtida. Em seguida, as células são plaqueadas em pratos de 4 poços contendo as lamelas revestidas com poli-D-lisina. (D) imagem Campo brilhante mostrando neurônios do hipocampo de ratos primárias em cultura. Bar representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. NMDA aumenta cytosolic [Ca 2+] em neurônios do hipocampo de curto e longo prazo neurônios do hipocampo em cultura foram carregados com fura2 / AM e submetido a imagem de fluorescência. As fotos mostram campo e PseudoColor imagens representativas brilhantes (Rácio F340 / F380) de curto prazo (A) e longo prazo (B 2+] (escalas PseudoColor são mostrados na parte inferior). Vestígios representativos mostram gravações, de célula única de citosólica [Ca2 +], em resposta ao NMDA 100 uM em curto prazo (A) e a longo prazo (B) neurónios do hipocampo em cultura. Note que cytosolic [Ca 2+] aumentos são muito maiores no longo prazo do que em neurônios cultivados de curto prazo. Bar representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. NMDA induz mitocondrial sobrecarga de Ca2 + em neurónios do hipocampo Neur do hipocampo em culturaons foram transfectadas com a baixa afinidade, mitocôndrias aequorina alvo fundido a GFP, incubadas com 4 ^ M de coelenterazina e submetido a imagiologia de bioluminescência mitocondrial [Ca 2+]. As fotos mostram a fluorescência (GFP) e as emissões fotônicas acumulados (aequorin bioluminescência) imagens de curto representante (A) e longo prazo (B) neurônios do hipocampo em cultura. Intensidade luminescente é codificado em pseudo (1 a 16 emissões fotônicas por pixel). Gravações mostram a libertação de emissões fotónicas (expressas como mitocondrial [Ca 2+]), em curto (A) e a longo prazo (B) neurónios do hipocampo em cultura. NMDA 100 um aumento mitocondrial [Ca 2+] nos neurônios envelhecidos mas não em jovens neurônios do hipocampo em cultura. Bar representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ a>
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Discussion
A remodelação de Ca2 + intracelular homeostase no cérebro de envelhecimento tem sido relacionada à perda cognitiva, aumento da susceptibilidade à lesão isquêmica, excitotoxicidade e neurodegeneração. Para investigar esta hipótese in vitro, procedimentos de imagem Ca 2+ estão disponíveis. Infelizmente, culturas viáveis de neurônios do hipocampo antigos não são confiáveis. Recentemente, tem-se observado que as culturas de longo prazo de neurónios de hipocampo de rato apresentam muitas das características típicas de envelhecimento in vivo, incluindo a acumulação de ROS, a formação de grânulos de lipofuscina, focos heterocromática, activação de pJNK e p53 / vias de p21, a perda de colesterol, e altera a densidade de canais de Ca 2+ e 14 dos receptores NMDA. Assim, Ca 2+ experimentos com imagens em culturas jovens e velhos de neurônios do hipocampo de ratos pode fornecer novos insights de Ca 2+ remodelação no cérebro de envelhecimento. Uma condição que é fundamental para a cultura hippocaneurônios Mpal a longo prazo é duas vezes. Em primeiro lugar, é importante para a chapa as células a uma densidade muito baixa, como referido acima. Em segundo lugar, as células são cultivadas em meio Neurobasal suplementado sem alterar a forma. Esta abordagem permite a presença de glia, mas evitando seu crescimento excessivamente. O esquema para esta cultura é mostrado na Figura 1.
Imagens de fluorescência com sintéticos de Ca2 + sondas permite o monitoramento de cytosolic [Ca 2+] em neurônios individuais 19. A utilização desta abordagem em jovens e idosos neurônios permite o monitoramento de mudanças nas respostas com idade na cultura. Por exemplo Figura 2 mostra brilhante campo típica e imagens de Ca2 + dos aumentos de [Ca2 +] cit induzida por NMDA em neurônios jovens e neurônios de culturas envelhecidas. Observe que as respostas nos neurônios envelhecidos são muito maiores do que em jovens neurônios. No entanto, este procedimento não é fiável para [Ca 2+] Medições dentro organelos subcelulares como, por exemplo, mitocôndrias, onde [Ca 2+] pode variar desde abaixo da uM para acima do nível mM. Nestes casos, a base de proteínas, as sondas alvo-mitocôndrias foram desenvolvidos como, por exemplo, a aequorina. Esta sonda é particularmente interessante uma vez que a sua afinidade para o Ca2 + pode ser finamente sintonizado para monitorar [Ca 2+] condições muito baixas ou muito elevadas como as atingidas dentro mitocôndrias em repouso e estimuladas, respectivamente. Especificamente, é possível escolher entre a aequorina tipo selvagem ou um aequorina mutado sem Ca2 + sítios de ligação para modificar a afinidade. O ajuste fino é conseguido quando diferentes coelenterazines (tipo selvagem, H, N) são usados em combinação com diferentes aequorins 17. No entanto, enquanto o uso de fluorescência para Ca 2+ imagem é generalizada, monitoramento bioluminescência não é simples e pode exigir câmeras de contagem de fótons. Felizmente, aequorinsondas, como o usado aqui, foram melhorados para co-expressar GFP 18 tornando-as mais estáveis, capazes de liberar mais emissões fotônicas e permitindo simples identificação de células transfectadas pela GFP associado fluorescência. O sucesso na imagem de bioluminescência em neurónios depende não só sobre a eficiência da câmara de contagem de fotões utilizado, mas também da eficiência da transfecção da sonda segmentadas por mitocôndrias. No caso de neurónios do hipocampo, uma transfecção química simples pode funcionar desde que uma câmara de contagem de fotões de alta sensibilidade é disponível. A Figura 2 mostra exemplos de campo claro, e as imagens de fluorescência da GFP bioluminescência de jovens e idosos em neurónios do hipocampo de cultura. São também mostrados os aumentos na mitocondrial [Ca 2+] induzida por NMDA em neurónios do hipocampo gravado transfectadas. Note-se que o efeito de NMDA é muito maior em neurónios cultivados do que em jovens com idade entre neurónios. Em outros casos, a eficácia da transfecção pode ser aumentada por utilização de vectores derivados de vírus 16,18. Em alternativa, o desenvolvimento de murganhos transgénicos que albergam à base de proteínas, subcelulares Ca2 + sondas é uma opção emergente para futuras abordagens, talvez, mesmo in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
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