Abstract
La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca 2 + afluencia y mitocondrial Ca 2 + sobrecarga. Un cambio sustancial en Ca 2 + homeostasis intracelular o remodelación de Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca 2+ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca 2+ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.
Introduction
La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca 2+ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) 2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad 3, lo que provoca la apoptosis neuronal 4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de 5-8.
Es ampliamente aceptado que un aumento en la concentración de Ca2 + citosólico-libre ([Ca2 +] cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular 9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca 2+ mitocondrial captación 10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular 11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca 2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos 12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos 13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad 14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca 2+ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento.
El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca 2+ intracelular homeostasis o Ca 2+ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca 2+ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca 2+ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca 2+ mediciones incluyendo mitocondrial de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca 2+ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica 15 Ca 2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia 16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.
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Protocol
Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido manejados bajo los protocolos aprobados por la instalación de alojamiento de los animales de la Universidad de Valladolid, de acuerdo con la Convención Europea 123 / Consejo de Europa y la Directiva 86/609 / CEE.
1. Corto y Largo Plazo Cultura de las neuronas del hipocampo de rata
- Preparación de poli-D-lisina recubierto, 12 mm cubreobjetos de vidrio.
- Esterilizar 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro en etanol durante al menos 24 h. Deje que se seque en condiciones estériles.
- Distribuir los cubreobjetos en una tira de Parafilm en una placa de Petri. Cubrir la superficie de cada cubreobjetos con 200 l de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir el tratamiento de O / N.
- El día siguiente lavado los cubreobjetos con agua bidestilada estéril cada 15 min durante 90 min en condiciones estériles.
- Llenar una placa de cuatro pozos multiplaca con 500 l de Neurobasal medio de cultivo por pocillo. Neurobasal medio de cultivo debe ser complementado conSuero bovino fetal al 10%, 2% B27, 1 mg / ml de gentamicina y 2 mM L-glutamina.
- Coloque el cubreobjetos en la placa multiplaca. Mantener en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora hasta su uso.
- Aislamiento de las neuronas del hipocampo de ratas neonatales.
- Preparar 1,8 ml de solución de papaína (directa comprado) en un vial (20 l / ml) en condiciones estériles: para obtener una concentración final de 20 l / ml de añadir alrededor de 40 l papaína en 1,8 ml de Hank, más 0,6% de BSA (l debe calcularse dependiendo de las condiciones de proveedores). De Hank 0,6% de BSA se prepara mezclando 85 ml de medio HBSS con 15 ml de albúmina de suero bovino al 4% (BSA, preparado la solución de 4 g de BSA en 100 ml HBSS). Preparar en una campana estéril.
- Incubar la papaína en Hank de más 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ºC antes de su uso. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras antes de su uso.
- Preparar medio F-12 de Ham añadiendo DulbeccoModificado polvo de Medio de Eagle (13,5 g por L) en 900 ml de agua bidestilada estéril. A continuación, añadir 6 g de HEPES y 336 mg NaHCO3 y ajustar el pH a 7,42 con NaOH 4 N. Añadir agua estéril para obtener una solución de 1 L y filtrarla usando una polietersulfona 0,20 micras (PES) botella de filtro superior. Realizar este proceso en una campana estéril. Finalmente saturar la solución con CO 2 en condiciones estériles antes de su uso. Soluciones Almacenar a 4 ºC y utilizarlos refrigerada.
- La eutanasia a recién nacido (P0) crías de ratas por decapitación y se lava la cabeza en medio HBS estéril. Abra el cráneo con la ayuda de unas tijeras estériles. Extraer el cerebro con una espátula y lavar rápidamente en medio F-12 de Ham.
- Haga un corte diagonal con la ayuda de un bisturí en cada hemisferio (Figura 1B), y llevarla a una placa de Petri que contiene medio F-12 de Ham.
- Meninges Descartar cuidadosamente con la ayuda de unas pinzas de disección y bajo una lupa. <li> Identificar el hipocampo en una zona cóncava característica más de la corteza usando la lupa. Luego, separe el hipocampo de la corteza tirando cuidadosamente de una frontera y de sacarlo de su posición con unas tijeras oculares.
- Transferir el tejido del hipocampo a una placa de 4 bien lleno de medio estéril de Hank carente Ca 2+ y Mg 2+, más 0,6% de BSA y lavar el tejido del hipocampo. Sin retirar los medios de comunicación cortar el tejido en trozos pequeños (alrededor de 2 x 2 mm) utilizando las mismas tijeras oculares.
- Transferencia piezas de hipocampo a un vial que contiene 1,8 ml de solución de papaína pre-filtrada. Entonces incuban a 37 ºC con ocasional, agitación suave. 15 min después, añadir 90 l de solución de DNasa I (50 mg / ml final) y se incuba durante 15 min adicionales.
- Transferir el tejido a un tubo de centrífuga de 10 ml y lavar los fragmentos con frescos Neurobasal medio de cultivo. Obtener suspensión de células haciendo pasar los fragmentos de tejido a través de un pip plástico 5 mlette.
- Suspensión de células Centrifugar a 160 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur de plástico estéril y suspender pellet cuidadosamente con una pipeta de 1 ml automatizados en 1 ml de medio de cultivo Neurobasal.
- Medir la densidad de células usando una cámara de recuento Neubauer. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer. Añadir 10 l de suspensión celular. Asegúrese de que la suspensión celular entra en la cámara de manera uniforme y sin hacer burbujas. Contar el número de células bajo el microscopio y realizar cálculos correspondientes para obtener una gota adecuada de 40 a 80 l que contiene 30 x 10 3 células. El número total de células dependerá del número de animales utilizados.
- Sobre la placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de Neurobasal medio de cultivo preparado antes y se mantienen en la incubadora, la placa alrededor de 30 x 10 3 células en una caída de alrededor de 50 l a cadapocillo de la placa multiplaca que contiene uno poli-D-lisina, 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro.
- Mantener las células del hipocampo primaria en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora durante 2-5 días in vitro (DIV, a corto plazo, las culturas jóvenes) o> 15 DIV (a largo plazo, las culturas de edad) antes de experimentos sin necesidad de cambiar la cultura medios de comunicación.
2. Fluorescencia de Imagen de citosólica de Ca2 + Concentración
- Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de fluorescencia.
- Preparar una solución externa de solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glucosa 10, sodio-HEPES 10 (pH 7,42).
- Preparar una solución exento externa, Mg 2+, solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, glucosa 10 y 10 HEPES (pH 7,42).
- Resuelva salina NMDA en Mg 2 + libre, tamponada con HEPES (HBS) a una final concentración de 100 mM y complementarlo con 10 mM glicina.
- Preparar una solución de HBS que contenía KCl en lugar de NaCl mediante la resolución de (en mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosa 10 y HEPES 10 (pH 7,42).
- La carga de las células del hipocampo con fluorescente sonda de calcio fura2 / AM.
- Tome el cultivo de células que contienen cubreobjetos fuera de la incubadora y lavarlos con medio HBS a RT transfiriéndolos a una nueva placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de HBS por pocillo.
- Se incuban las células con fura2 / AM 4 M (preparado en el mismo medio HBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) en un lugar oscuro.
- Después de 60 minutos, lavar cubreobjetos con medio HBS fresco.
- Grabación de imágenes de fluorescencia de citosólico [Ca 2+] en células cultivadas.
- Encienda la lámpara, microscopio, sistema de perfusión, cámara de fluorescencia y el ordenador.
- Coloque los cubreobjetos en una plataforma para termostatizadoabiertas 12 mm cubreobjetos de cristal en la platina del microscopio invertido y seleccionar un campo microscópico utilizando un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3). Perfundir células continuamente con precalentado (37 ºC) medio HBS en ausencia o presencia de sustancias de ensayo. Mantener el flujo a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml / min.
Nota: sistema de perfusión celular para células vivas está montado en una plataforma para termostatizado abiertas 12 mm cubreobjetos de vidrio. Sistema de perfusión por gravedad 8 líneas equipadas con un controlador de válvula se utiliza para perfundir las soluciones. Una bomba de vacío es responsable de la eliminación de cualquier exceso de medio. Las soluciones se calentaron usando un sistema de calefacción en el tubo. - Capturar una imagen de fondo con el obturador cerrado en ambas longitudes de onda de excitación.
- Epi-iluminar células alternativamente a 340 y 380 nm. Record luz emitida a 520 nm cada 5-10 seg con una cámara de fluorescencia, que se filtra por un espejo dicroico fura-2.
- Cuando finalice el período de registro, guarde la secuencia completa of imágenes emiten en 520 nm en el ordenador para su posterior análisis.
- Análisis de imágenes fluorescentes grabados.
- Abra el archivo de experimento. Usando el software aquacosmos, haga clic en 'Relación' y seleccione el rango de relación deseada. Calcular la relación de pixel por pixel en las imágenes resultantes a fin de obtener una secuencia de imágenes de relación.
- Reste fondo ajustando la 'eliminación de fondo'. Pulse 'cálculo de inicio'.
- Pulse 'todo momento secuencia' botón y borrar las antiguas regiones de interés (ROI). Para el análisis cuantitativo de las células individuales, establecer nuevas regiones de interés o regiones de interés correspondientes a las neuronas individuales. Promedio de todos los valores de la relación en cada píxel correspondientes a cada ROI y cada imagen para obtener una grabación de valores de fluorescencia ratio para ROI individuales (células).
- Para graficar las grabaciones individuales exportar los valores de relación de fluorescencia correspondientes a cada retorno de la inversión a un progr gráficaa.m.
- Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de las subidas de fluorescencias proporción en respuesta a cada estimulación mediante un análisis de datos adecuado y graficando software.
3. La bioluminiscencia de imágenes de Ca2 + mitocondrial Concentración
- La transfección de las neuronas del hipocampo en cultivo con el plásmido mitGAmut.
NOTA: Las células se transfectaron primero con el plásmido que contiene una secuencia mitGAmut mitocondrias-orientada y un aequorina mutado carente de un sitio de unión de Ca2 + fusionado a la proteína fluorescente verde (GFP). Esta construcción detecta grandes aumentos en mitocondrial de Ca 2 + captación y permite la identificación de células transfectadas por la fluorescencia GFP. El plásmido fue desarrollado y proporcionado amablemente por el P. Brulet y compañeros de trabajo 18 (CNRS, París).- Preparar Neurobasal TF, que contiene Neurobasal medio de cultivo, que carece de suero fetal bovino, B27, gentamicy 2 mM L-glutamina.
- Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 2,5 l reactivo de transfección en un vial (Solución A). Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 4 g mitGAmut plásmido en un vial (Solución B). Añadir con cuidado la solución B sobre la solución A. Permitir la mezcla durante 20 minutos, sin agitar.
- Transfiera los cubreobjetos que contienen las neuronas del hipocampo a nuevas placas multiplaca que contienen 200 l de TF Neurobasal fresco.
- Añadir gota a gota 100 l de solución A + B sobre cada cubreobjetos. Incubar durante 30 min. Retire el medio. Lavar una vez las células con TF Neurobasal fresco. Devolver los cubreobjetos a la original Neurobasal medio de cultivo.
- Neuronas de cultivo para un 24 h más a 37 ºC y 5% de CO 2 después de la transfección para permitir la expresión eficiente y la orientación de la sonda.
- Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de bioluminiscencia.
- Preparar soluciones HBS contienen NMDA 100 mM o 145 mM KCl comoanteriormente (Paso 2.1). Prepare la solución HBS conteniendo mM Ca 2 + 10 plus digitonin 100 mM.
- Reconstitución de aequorina mitocondrias-dirigida con coelenterazina n.
- Cubreobjetos de transferencia que contiene las neuronas del hipocampo transfectadas a una placa de cuatro pocillos que contenía 200 l de HBS.
- Añadir 4 l de coelenterazina n (200 M) a 200 l de HBS para una concentración final de 4 mM y mezclar suavemente. Incubar durante 2 horas a RT (25 ºC) y en la oscuridad.
- Grabación de imágenes de bioluminiscencia de mitocondrial [Ca2 +].
- Encienda el microscopio, la lámpara, el sistema de perfusión, cámara de bioluminiscencia y el ordenador.
- Transferir a un cubreobjetos reconstituidas (37 ºC) cámara de perfusión termostatizada y perfundir continuamente con solución pre-calentado HBS a una velocidad de 5-10 ml / min.
- El uso de un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3), seleccione un campo microscópico que contiene células que expresan la unapoaequorins como se muestra por la emisión de fluorescencia asociado con la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando los filtros FITC. Un campo típico puede contener 1-2 células transfectadas. Capturar la imagen de fluorescencia de GFP, usando una cámara CCD.
- Apague la luz del microscopio. Quite la caja que contiene dicroico-ubicado en la vía de la luz. Apague la luz de excitación y cerrar la caja oscura de completa oscuridad.
- Perfundir células a 5-10 ml / min con medio HBS con o sin soluciones de prueba pre-calentado a 37 ºC.
- Captura de imágenes de emisión fotónicos cada 10 seg con una cámara de recuento de fotones manejado con un procesador de imagen.
- Al final de cada experimento, permeabilizar las células con 0,1 mM de digitonina en 10 mM CaCl 2 en HBS con el fin de liberar a todos los restantes emisiones fotónicos.
Nota: Estas emisiones fotónicas deben sumarse para estimar el total de emisiones fotónicas, un valor requerido para la calibración de Ca 2+ concentraciones <./ li> - Imágenes de bioluminiscencia tienda en el ordenador la imagen de fluorescencia de GFP asociado con capturaron antes de la proyección de imagen de recuento de fotones.
- Análisis de imágenes de bioluminiscencia que reflejan mitocondrial [Ca2 +].
- Cuantificar las emisiones fotónicas utilizando software específico. Las emisiones fotónicos pueden ser convertidos a Ca 2+ mitocondrial libre de concentración ([Ca2 +] mit) utilizando el algoritmo descrito por Brini et al. 15.
- Abra la imagen de fluorescencia de GFP experimento y. Seleccionar regiones de interés (ROIs) con la ayuda de software específico por dibujar la forma de las células transfectadas de acuerdo con las imágenes de fluorescencia capturados al comienzo del experimento.
- Pegue las mismas regiones de interés en cada imagen. Total de emisiones fotónicas en cada retorno de la inversión se calculan con un software específico para obtener el valor de emisión de luminiscencia (L) para cada celda en cada punto en el tiempo.
- Suma todo el emiss fotónicoiones en las imágenes de bioluminiscencia, incluidos los obtenidos después de digitonina permeabilización, utilizando el software específico, para obtener una imagen de bioluminiscencia que contiene todas las emisiones fotónicos.
- Los valores de exportación de emisiones fotónicas para todas las regiones de interés para un software específico para los cálculos. Para ello, haga clic en 'Graph' con el fin de calcular los valores de bioluminiscencia para cada ROI en cada momento. Seleccione "valor total" y "utilizar ROI actual para todas las imágenes. Pulse 'calcular'. Guarde el 'txt.file' y exportar datos a una hoja de cálculo. Por cada ROI, [Ca 2 +] mit se calcula utilizando el siguiente algoritmo:
[Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
dónde,
R = [L / (L λ total)] 1 / n
L es la luminiscencia emitida en el momento de la medición en cada región de interés.
L total esla luminiscencia total restante después de la adición de los recuentos presentes en el tejido en ese momento en el momento de la medición para cada región de interés. λ, K TR, K R y n son constantes cuyos valores dependen combinación de aequorina (tipo salvaje o mutado) y coelenterazin utilizado (de tipo salvaje o de tipo n), así como la temperatura 16 de grabación. Para la combinación usada aquí (AEQ y coelenterzine n mutado), a 37 ºC, se utilizaron los siguientes valores: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 y λ = 0,138.
- Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos en la bioluminiscencia en respuesta a cada estímulo mediante un análisis de datos adecuado y graficando software.
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Representative Results
Aquí se describe un método simple para evaluar Ca 2+ remodelación y los efectos del NMDA en citosólica y mitocondrial [Ca2 +] en las neuronas de edad. La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento para el aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratas neonatales. Antes de empezar, tenemos que prepararnos, recubiertos, cubreobjetos de vidrio de poli-D-lisina estériles y colocarlos en una placa de 4 pocillos. A continuación, las ratas neonatales son asesinados y el cerebro removidos. Después de aislar el hipocampo, el tejido se dispersa cuidadosamente usando papaína. Las células aisladas se lavan y se sembraron en cubreobjetos recubiertos. Luego, las células se cultivan durante 2.5 DIV o> 15 DIV para obtener cultivos jóvenes o de edad, respectivamente, y se utiliza para el Ca 2+ experimentos de imagen.
El uso de la estrategia anterior, es posible tener las neuronas jóvenes y mayores de la misma muestra para probar, por ejemplo, si NMDA induce efectos diferenciales en citosólico [Ca 2 +] en joven cultures que en culturas más antiguas. La Figura 2 muestra que NMDA 100 M induce mayores aumentos en citosólico [Ca 2 +] en las culturas más antiguas que en las culturas jóvenes. Del mismo modo, NMDA induce la muerte celular en las neuronas de edad, pero no en las neuronas jóvenes 5. En los casos en Ca 2 + respuestas son muy altos, experimentos similares pueden llevarse a cabo con Ca 2+ sondas con menos afinidad por Ca 2+ para evitar la saturación de colorante como, por ejemplo fura4F 5. De la misma manera, también es posible saber si los niveles de reposo de citosólico [Ca 2 +] son diferentes. Además, la combinación de este protocolo con inmunofluorescencia cuantitativa utilizando anticuerpos específicos para las subunidades NMDAR puede permitir cambios en la capacidad de respuesta correlacionar con diferencias en la expresión de subunidades del receptor de NMDA, siempre que los anticuerpos específicos están disponibles 5. Las mediciones de citosólico [Ca 2 +] se puede utilizar también para evaluar otros parámetros de relevanciars incluyendo Ca 2+ almacenar contenido, descansando permeabilidad al Ca 2+, Ca 2+ tasas de eliminación y sus posibles diferencias entre las neuronas jóvenes y viejas.
De manera similar, también es posible poner a prueba los efectos de tales estímulos en mitocondrial [Ca2 +]. La Figura 3 muestra un ejemplo de imágenes de bioluminiscencia de las neuronas del hipocampo transfectadas con aequorina mitocondrias-dirigida. La liberación de las emisiones fotónicos después de la estimulación es una función de la subida de los mitocondrial [Ca2 +] lograrse. Nótese que los aumentos inducidos por NMDA en mitocondrial [Ca 2 +] son mucho más grandes en las neuronas de edad que en las neuronas del hipocampo jóvenes, donde apenas NMDA aumenta las emisiones fotónicas. Estos resultados pueden contribuir a explicar por qué NMDA induce la apoptosis sólo en las neuronas de edad, pero no en cultivos jóvenes de las células del hipocampo 5. De la misma manera, es posible para probar las diferencias adicionales en mitocondrialCa2 + gastos de envío entre las neuronas jóvenes y viejas utilizando protocolos específicamente diseñados para poner a prueba, por ejemplo, Ca 2+ salida de las mitocondrias, mitocondrial de Ca 2 + captación en las neuronas permeabilizadas y mitocondrial de Ca 2 + captación inducida por Ca 2 + liberación de los almacenes intracelulares. Por otra parte, esta metodología podría ser utilizado para la prueba de fármacos que afectan mitocondrial Ca 2 + sobrecarga que puede ser de interés para la neuroprotección contra la excitotoxicidad.
Figura 1: Procedimiento para el aislamiento de las neuronas del hipocampo de rata primaria (A) poli-D-lisina, 12 mm cubreobjetos de vidrio recubiertos se preparan en una placa de Petri y finalmente se transfirieron a una placa de 4 pocillos.. (B) Vista dorsal de un cerebro de rata. La línea punteada indica el lugar donde se debe hacer el corte. (C) Obtención comoUSPENSIÓN de neuronas del hipocampo primarias células. Después de retirar el hipocampo, se obtiene una suspensión celular. Luego, las células se colocaron en placas en los platos 4 pocillos que contenían los cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina. (D) Imagen de campo brillante que muestra las neuronas del hipocampo de rata primarios en cultivo. Bar representa 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. NMDA aumenta citosólico [Ca 2 +] en las neuronas del hipocampo de corto y neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo fueron cargados con fura2 / AM y sometidos a imágenes de fluorescencia. Las fotos muestran el terreno y pseudocolor imágenes representativas brillantes (Ratio F340 / F380) de corto plazo (A) y largo plazo (B 2 +] (escalas pseudocolor se muestran en la parte inferior). Las huellas muestran representativas, grabaciones de una sola célula de citosólico [Ca 2 +] en respuesta a 100 M de NMDA en el corto plazo (A) y largo plazo (B) las neuronas del hipocampo en cultivo. Tenga en cuenta que citosólico [Ca 2 +] aumentos son mucho más grandes en el largo plazo que en neuronas cultivadas a corto plazo. Bar representa 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. NMDA induce mitocondrial de Ca 2 + sobrecarga en las neuronas del hipocampo neur hipocampo cultivadasons fueron transfectadas con el de baja afinidad, las mitocondrias aequorina dirigida fusionado a GFP, se incubaron con 4 M coelenterazina y se sometió a imágenes de bioluminiscencia de mitocondrial [Ca2 +]. Las imágenes muestran la fluorescencia (GFP) y las emisiones fotónicas acumulados (bioluminiscencia aequorina) Imágenes de corto representante (A) y largo plazo (B) las neuronas del hipocampo en cultivo. Intensidad de luminiscencia se codifica en pseudocolor (1 a 16 emisiones fotónicas por píxel). Grabaciones muestran la liberación de emisiones fotónicas (expresadas como mitocondrial [Ca2 +]) en corto (A) y largo plazo (B) las neuronas del hipocampo en cultivo. NMDA 100 mM aumento mitocondrial [Ca2 +] en las neuronas de edad, pero no en las neuronas del hipocampo cultivadas jóvenes. Bar representa 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ a>
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Discussion
La remodelación de Ca 2 + homeostasis intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca 2+ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata presentan muchas de las características típicas de envejecimiento in vivo incluyendo la acumulación de ROS, la formación de gránulos de lipofuscina, focos de heterocromatina, la activación de pJNK y p53 / vías de p21, la pérdida de colesterol, y cambia la densidad de los canales de Ca 2+ y los receptores de NMDA 14. En consecuencia, Ca 2+ experimentos de imagen en las culturas jóvenes y ancianos de las neuronas del hipocampo de rata pueden proporcionar nuevos conocimientos de Ca 2+ remodelación en el envejecimiento del cerebro. Una condición que es fundamental para hippoca cultivoneuronas Mpal en el largo plazo es doble. En primer lugar, es importante a la placa las células a una densidad muy baja como se ha indicado anteriormente. En segundo lugar, las células se cultivaron en Neurobasal suplementado medio sin cambiar el medio. Este enfoque permite la presencia de células gliales pero evitando su crecimiento excesivamente. El esquema para tal cultivo se muestra en la Figura 1.
Imágenes de fluorescencia con sintéticos Ca2 + sondas permite el seguimiento de citosólico [Ca 2 +] en las neuronas individuales 19. El uso de este enfoque en las neuronas jóvenes y viejas permite la monitorización de los cambios en las respuestas con la edad en cultivo. Por ejemplo la figura 2 muestra típica de campo claro y las imágenes de Ca 2+ de los aumentos en [Ca2 +] cyt inducida por NMDA en las neuronas jóvenes y las neuronas de cultivos envejecidos. Tenga en cuenta que las respuestas de las neuronas de edad son mucho mayores que en las neuronas jóvenes. Sin embargo, este procedimiento no es fiable para la [Ca 2+] Mediciones dentro de orgánulos subcelulares como, por ejemplo, mitocondrias, donde [Ca2 +] puede variar desde por debajo de la M a por encima del nivel mM. En esos casos, a base de proteínas, sondas mitocondrias orientada se han desarrollado como, por ejemplo, aequorina. Esta sonda es particularmente interesante ya que su afinidad por Ca 2+ puede ser finamente sintonizado para vigilar [Ca 2 +] condiciones muy bajas o muy altas como las que llegaron dentro de la mitocondria en reposo y estimuladas, respectivamente. Específicamente, es posible seleccionar ya sea el tipo salvaje o un aequorina aequorina mutado sin Ca 2+ sitios de unión para modificar la afinidad. Se consigue la sintonización fina cuando se utilizan diferentes coelenterazines (tipo salvaje, h, n) en combinación con diferentes aequorins 17. Sin embargo, mientras que el uso de la fluorescencia para la imagen de Ca2 + está muy extendida, el seguimiento bioluminiscencia no es sencilla y puede requerir cámaras de conteo de fotones. Afortunadamente, aequorinasondas, como el usado aquí, se han mejorado para co-expresan GFP 18 haciéndolos más estable, capaz de liberar más emisiones fotónicos y permitiendo la identificación sencilla de las células transfectadas por el GFP asociado fluorescencia. El éxito en imágenes de bioluminiscencia en las neuronas no sólo depende de la eficiencia de la cámara de recuento de fotones utilizado sino también de la eficiencia de la transfección de la sonda mitocondrias-dirigida. En el caso de las neuronas del hipocampo, un simple transfección química puede trabajar siempre que una cámara de recuento de fotones de alta sensibilidad está disponible. La Figura 2 muestra ejemplos de campo claro, fluorescencia de GFP y las imágenes de bioluminiscencia de jóvenes y ancianos en las neuronas del hipocampo de la cultura. También se muestran los aumentos en mitocondrial [Ca2 +] inducida por NMDA en las neuronas del hipocampo grabado transfectadas. Observe que el efecto de NMDA es mucho mayor en las neuronas cultivadas de edad que en las neuronas jóvenes. En otros casos, la eficiencia de la transfección se puede aumentar mediante el uso de vectores derivados de virus 16,18. Alternativamente, el desarrollo de ratones transgénicos que albergan subcelulares, Ca 2+ sondas a base de proteínas es una opción emergente para futuros enfoques, tal vez incluso in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
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