Abstract
Gevoeligheid voor neuron celdood geassocieerd met neurodegeneratie en ischemie zijn zeer toegenomen in de leeftijd van hersenen, maar mechanismen die verantwoordelijk zijn slecht bekend. Excitotoxiciteit een proces zou kunnen bijdragen aan zenuwbeschadiging veroorzaakt door zowel beledigingen wordt gemedieerd door activering van glutamaatreceptoren die Ca2 + influx en mitochondriale Ca2 + overload bevordert. Een belangrijke verandering in de intracellulaire Ca 2+ homeostase of verbouwen van de intracellulaire Ca 2+ homeostase kan neuron schade in het oude neuronen bevorderen. Voor het onderzoeken van Ca 2+ remodeling bij veroudering hebben we gebruik live cell imaging op lange termijn culturen van de rat hippocampus neuronen die lijken op sommige aspecten neuronen in vivo jaar. Voor dit doel, de hippocampus cellen, op de eerste plaats, vers verspreid van nieuwe zeepaardjes geboren rat en uitgeplaat op poli-D-lysine gecoat glas dekglaasjes. Daarna kweken worden in gecontroleerde media gedurende meerdere dagen of meerdere wEeks voor het onderzoeken van jong en oud neuronen, respectievelijk. Ten tweede worden gekweekte neuronen geladen met fura2 en onderworpen aan metingen van cytosolische Ca2 + -concentratie die digitale fluorescentieverhouding imaging. Ten derde worden gekweekte neuronen getransfecteerd met plasmiden die een tandem lage affiniteit aequorine en GFP gericht op mitochondria. Na 24 uur wordt aequorine in de cellen gereconstitueerd met coelenterazine en neuronen worden blootgesteld aan bioluminescentie beeldvorming voor monitoring van mitochondriale Ca2 + -concentratie. Dit drietrapsprocedure maakt het monitoren van cytosolische en mitochondriale Ca2 + responsen op stimuli zoals bijvoorbeeld de glutamaat receptor agonist NMDA wensen of deze en andere reacties worden beïnvloed door veroudering. Deze procedure kan nieuwe inzichten opleveren over hoe veroudering beïnvloeden cytosolische en mitochondriale Ca2 + respons op geselecteerde stimuli en het testen van de geselecteerde geneesmiddelen ter voorkoming neuronenceldood in leeftijd gerelateerde ziekten.
Introduction
Excitotoxiciteit is een van de belangrijkste mechanismen die bijdragen aan neuronale schade en celdood in neurologische beledigingen zoals ischemie, en in sommige neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer 1. Dit type neurotoxiciteit wordt voornamelijk gemedieerd door glutamaat handelen over Ca 2+ -doorlaatbare, ionotrope NMDA-receptoren (NMDAR) 2. Blootstelling van gekweekte neuronen glutamaat excitotoxiciteit kan tot 3, waarbij neuronale apoptose 4 veroorzaakt. Wij en anderen hebben eerder gemeld dat neuronale gevoeligheid voor NMDA-geïnduceerde apoptose kan veranderen in vitro ontwikkeling en veroudering 5-8.
Het is algemeen aanvaard dat een toename van de vrije cytosolische Ca2 + -concentratie ([Ca2 +] cyt) leidt tot activatie cellen. Als dit echter aanleiding te hoog is en / of voldoende duurzame, kan celdood 9 leiden. Bovendien is voorgestelddat excitotoxiciteit vereist mitochondriale Ca2 + opname 10, aangezien het behandelen neuronen met een mitochondriale ontkoppelaar beschermd neuronen tegen door glutamaat geïnduceerde celdood 11. Indien mitochondriën te veel Ca2 +, kan de opening van de mitochondriale permeabiliteittransitieporie plaatsvinden, waardoor los van cytochroom C en andere pro-apoptotische factoren, en het induceren van apoptose. We hebben onlangs aangetoond dat mitochondriële Ca2 + opname direct gerelateerd aan de leeftijd afhankelijke gevoeligheid voor excitotoxiciteit, door direct meten van NMDA-geïnduceerde mitochondriale Ca2 + opname in enkele hippocampale neuronen 5, een werkwijze die is beschreven in dit artikel. De hippocampus, die betrokken zijn bij fysiologische processen zoals leren, geheugen en andere cognitieve processen 12, zeer gevoelig voor veroudering en neurodegeneratieve aandoeningen 13. Voorgesteld is dat, na een aantal weken in vitro gekweekthippocampale neuronen tonen een aantal typische kenmerken van oude neuronen 14. Dienovereenkomstig kan op lange termijn gekweekte hippocampale neuronen een alomvattend model Ca 2+ gemedieerde mechanismen van verbeterde excitotoxiciteit bij veroudering onderzoeken bieden.
Het algemene doel van de gepresenteerde methode is dan ook aanzienlijke veranderingen in intracellulaire Ca2 + homeostase of Ca2 + remodellering in de ouder wordende hersenen onderzoeken waaronder differentiële Ca2 + responsen opgewekt door NMDA receptor agonisten op lange-termijn gekweekte hippocampale neuronen . De werkwijze bevat een gedetailleerde beschrijving van de cultuur van rat hippocampale neuronen en de controle cytosolische en mitochondriale Ca2 + concentraties van fluorescentie en bioluminescentie beeldvorming in individuele neuronen, respectievelijk. Fluorescentiebeelvorming van cytosolisch Ca2 + in gekweekte neuronen is een standaardprocedure. Deze methode is minder betrouwbaar voor subcellulaire Ca2 + metingen zoals mitochondriale Ca2 +. Redenen hiervoor zijn onder andere het ontbreken van een goede afstemming van de synthetische probes en ongepast affiniteit voor Ca 2+ concentraties die kunnen veranderen in de mitochondriën van de lage uM niveau zelfs tot het mM niveau. Het gebruik van Ca2 + probes op basis van eiwitten zoals bijvoorbeeld aequorine, kon de targeting naar subcellulaire organellen en gebruik van derivaten verschillende Ca2 + affiniteiten met verschillende coelenterazines of gemuteerde probes ontbreekt specifieke Ca2 + bindingsplaatsen 15. Op deze wijze kan bioluminescentie beeldvorming van cellen die aequorine-mitochondriën gerichte monitoring van mitochondriale Ca2 + concentraties in individuele neuronen mogelijk te maken. Toch kan deze procedure het gebruik van fotontellende camera's of ultragevoelige CCD camera's voor bioluminescentie 16-18 vereist. Deze werkwijze kan nieuwe resultaten op die in meer establ worden bevestigdished hersenen veroudering modellen als, bijvoorbeeld, de hersenen plakjes van oude dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren zijn behandeld in het kader van protocollen door de Valladolid University stallen faciliteit goedgekeurd in overeenstemming met de Europese Conventie 123 / Raad van Europa en Richtlijn 86/609 / EEG.
1. korte en lange termijn Cultuur van Rat hippocampus Neuronen
- Bereiding van poly-D-lysine beklede, 12 mm dekglaasjes.
- Steriliseren 12 mm diameter glazen dekglaasjes in ethanol gedurende tenminste 24 uur. Laat ze drogen onder steriele omstandigheden.
- Verdeel de dekglaasjes op een strook van parafilm in een petrischaal. Bedek het oppervlak van elk dekglaasje met 200 ui 1 mg / ml poly-D-lysine. Laat behandelen O / N.
- De volgende dag was de dekglaasjes met dubbel gedestilleerd steriel water om de 15 minuten gedurende 90 min onder steriele omstandigheden.
- Vul een vier-goed multidish plaat met 500 ul van Neurobasal Cultuur Medium per putje. Neurobasal Cultuur Medium moet worden aangevuld met10% foetaal runderserum, 2% B27, 1 ug / ml gentamicine en 2 mM L-glutamine.
- Plaats de dekglaasjes in de multidish plaat. Handhaaf ze in een bevochtigde 37 ° C en 5% CO 2-incubator tot gebruik.
- Isolatie van hippocampale neuronen van neonatale ratten.
- Bereid 1,8 ml papaïne oplossing (rechtstreeks aangekocht) in een flesje (20 ul / ml) onder steriele omstandigheden: Aan een uiteindelijke concentratie van 20 ul vinden / ml ongeveer 40 ul papaïne voeg in 1,8 ml Hank's plus 0,6% BSA (pi worden berekend afhankelijk van de leverancier omstandigheden). Hank's 0,6% BSA wordt bereid door 85 ml HBSS medium met 15 ml van 4% runderserumalbumine (BSA, bereid oplossen van 4 g BSA in 100 ml HBSS). Bereid in een steriele kap.
- Incubeer de papaïne in Hank plus 0,6% BSA gedurende 30 minuten bij 37 ° C vóór gebruik. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 urn filter vóór gebruik.
- Bereid Ham's F-12 medium door toevoeging van Dulbecco'sGemodificeerd Eagle's Medium poeder (13,5 g per L) in 900 ml dubbel gedestilleerd steriel water. Voeg dan 6 g HEPES en 336 mg NaHCO3 en de pH op 7,42 met behulp NaOH 4 N. Voeg steriel water om een 1 L oplossing te verkrijgen en filteren met behulp van een 0,20 um polyethersulfon (PES) dop filter. Draag deze werkwijze in een steriele kap. Tenslotte verzadigen van de oplossing met CO 2 onder steriele omstandigheden vóór gebruik. Store-oplossingen bij 4 ºC en gebruik ze gekoeld.
- Euthanaseren pasgeboren (P0) pups rat door onthoofding en was het hoofd in steriele HBS medium. Open de schedel met de hulp van een steriele schaar. Pak de hersenen met een spatel en al snel was het in Ham's F-12 medium.
- Voeg een diagonale snede met behulp van een scalpel in elk halfrond (Figuur 1B), en dragen een petrischaal met Ham's F-12 medium.
- Teruggooi hersenvliezen voorzichtig met de hulp van dissectie pincet en onder een vergrootglas. <li> Identificeer de hippocampus in een karakteristiek concave locatie over de cortex met behulp van vergrootglas. Dan scheiden de hippocampus van de cortex door voorzichtig te trekken van de ene grens en te verwijderen uit zijn positie met het oog schaar.
- Breng de hippocampus weefsel van een 4-wells plaat gevuld met steriele Hank's medium zonder Ca2 + en Mg2 + plus 0,6% BSA en wassen hippocampus weefsel. Zonder het verwijderen van de media snijden het weefsel in kleine stukjes (ongeveer 2 x 2 mm) met dezelfde oog schaar.
- Overdracht hippocampus stukken aan een flesje dat 1,8 ml pre-gefiltreerde papaïne oplossing. Broeden ze dan bij 37 ° C met af en toe, zacht schudden. 15 min later, voeg 90 ul DNase I-oplossing (50 ug / ml eind) en incubeer gedurende 15 extra minuten.
- Breng het weefsel een 10 ml centrifugebuis en was de fragmenten vers Neurobasal kweekmedium. Verkrijgen celsuspensie door het passeren van weefsel fragmenten door een 5 ml plastic pipette.
- Centrifugeer celsuspensie bij 160 xg gedurende 5 min. Verwijder het supernatant met een plastic steriele Pasteur pipet en zorgvuldig schorsen pellet met 1 ml geautomatiseerd pipet in 1 ml Neurobasal kweekmedium.
- Meet celdichtheid met behulp van een Neubauer telkamer. Zet het glas dekglaasje over de Neubauer kamer. Voeg 10 ul celsuspensie. Zorg ervoor dat de cel schorsing komt de kamer gelijkmatig en maken geen bubbels. Tel het aantal cellen onder de microscoop en de bijbehorende berekeningen een geschikte druppel 40-80 gl bevattende 30 x 10 3 cellen te verkrijgen. Het totale aantal cellen zal afhangen van het aantal gebruikte dieren.
- In de vier-well multidish plaat met 500 pl kweekmedium Neurobasal toegericht en in de incubator, plaat bleef ongeveer 30 x 10 3 cellen in een daling van ongeveer 50 pi aan elkputje van de multidish plaat met een poly-D-lysine-gecoate, 12 mm diameter glazen dekglaasje.
- Handhaaf primaire hippocampale cellen in een bevochtigde 37 ° C en 5% CO2 incubator gedurende 2-5 dagen in vitro (DIV korte termijn, jonge culturen) of> 15 DIV (lange termijn, leeftijd kweken) voor experimenten zonder de kweek media.
2. Fluorescentie Imaging van cytosolische Ca 2+ Concentratie
- Bereiding van de testoplossingen voor fluorescentiebeeldvorming.
- Bereid een externe HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) oplossing die in mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 glucose, natrium-HEPES 10 (pH 7,42).
- Bereid een externe, Mg2 + -vrij, HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) oplossing die in mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, glucose 10 en 10 HEPES (pH 7,42).
- Los NMDA in Mg 2+ -vrij, HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) bij een final concentratie van 100 uM en aan te vullen met 10 uM glycine.
- Bereid een HBS oplossing van KCl in plaats van NaCl door het oplossen (in mM) KCl 145, MgCl2 1, CaCl2 1, glucose 10 en 10 HEPES (pH 7,42).
- Laden van hippocampus cellen met fluorescerende calcium probe fura2 / AM.
- Neem de celkweek met dekglaasjes van de incubator en was ze met HBS medium bij RT door ze naar een nieuwe vier-en multidish plaat met 500 ul HBS per putje.
- Incubeer de cellen met fura2 / AM 4 uM (bereid op dezelfde HBS medium) gedurende 60 min bij kamertemperatuur (25 ° C) op een donkere plaats.
- Na 60 min, wassen dekglaasjes met verse HBS medium.
- Het opnemen van fluorescentie beelden van cytosolisch [Ca 2+] in gekweekte cellen.
- Zet de lamp, microscoop, perfusie-systeem, fluorescentie camera en computer.
- Plaats de dekglaasjes in een thermostaat platform vooropenen 12 mm dekglaasjes op het stadium van het omgekeerde microscoop en selecteer een microscopisch veld met een 40x objectief (olie, NA: 1,3). Perfuseren cellen continu met voorverwarmde (37 ºC) HBS medium in afwezigheid of aanwezigheid van teststoffen. Handhaaf de stroom bij een snelheid van ongeveer 5-10 ml / min.
Opmerking: Cel perfusie systeem voor levende cellen wordt in een thermostaat platform voor de open 12 mm dekglaasjes gemonteerd. 8-lijnen zwaartekracht aangedreven perfusie systeem uitgerust met een klep controller wordt gebruikt om de oplossingen te perfuseren. Een vacuümpomp is verantwoordelijk voor het verwijderen van overtollige medium. Oplossingen worden verwarmd met behulp van een in-buis verwarmingssysteem. - Leg een achtergrondafbeelding met de sluiter gesloten beide golflengten.
- Epi-verlichten cellen afwisselend bij 340 en 380 nm. Neem uitgestraalde licht bij 520 nm elke 5-10 seconden met een fluorescentie camera, welke werd gefiltreerd door een Fura-2 dichroïsche spiegel.
- Wanneer de opname periode is voltooid, slaan de volledige sequentie of images geëmitteerd bij 520 nm in de computer voor verdere analyse.
- Analyse van de geregistreerde fluorescente afbeeldingen.
- Open het experiment bestand. Met behulp van de aquacosmos software, klik op 'Ratio' en kies de gewenste verhouding bereik. Bereken de pixel voor pixel verhouding in de beelden teneinde een reeks van afbeeldingen verhouding te verkrijgen.
- Aftrekken achtergrond door het aanpassen van de 'achtergrond eliminatie'. Druk op 'start berekening'.
- Druk op 'allen tijde volgorde' knop en wissen van de oude regio's van belang (ROI). Voor de kwantitatieve analyse van individuele cellen, vestigen nieuwe gebieden van belang of ROI overeenkomt met individuele neuronen. Gemiddelde verhouding alle waarden in elke pixel overeenkomt met elke ROI en elk beeld een registratie van verhouding fluorescentiewaarden individuele ROI (cellen) te verkrijgen.
- Aan de individuele opnames grafiek de verhouding fluorescentie waarden overeenkomen met elke ROI te exporteren naar een grafische progreen M.
- Maak de overeenkomstige berekening voor het schatten van de omvang van de stijging van de verhouding fluorescenties voor iedere stimulatie met een geschikte data-analyse en grafische software.
3. Bioluminescentie beeldvorming van mitochondriaal Ca 2+ Concentratie
- Transfectie van gekweekte hippocampale neuronen bij de mitGAmut plasmide.
Opmerking: De cellen worden eerst getransfecteerd met het plasmide dat een mitGAmut-mitochondriën gerichte gemuteerde sequentie en een aequorine ontbreekt een Ca2 + bindingsplaats gefuseerd met het green fluorescent protein (GFP). Deze constructie detecteert grote stijging van mitochondriale Ca2 + opname en maakt de identificatie van getransfecteerde cellen door de GFP fluorescentie. Het plasmide werd ontwikkeld en vriendelijk verschaft door P. Brulet en medewerkers 18 (CNRS, Parijs).- Bereid Neurobasal TF, met Neurobasal Cultuur Medium, ontbreekt foetaal runderserum, B27, gentamicin en 2 mM L-glutamine.
- Bereid 50 pi Neurobasal TF plus 2,5 ul transfectie reagens in een flesje (oplossing A). Bereid 50 pi Neurobasal TF plus 4 ug plasmide mitGAmut in een flesje (oplossing B). Voeg voorzichtig oplossing B over oplossing A. Laat het mengen gedurende 20 min, zonder schudden.
- Breng de dekglaasjes met hippocampale neuronen nieuwe multidish platen die 200 pl vers Neurobasal TF.
- Druppel voor druppel toe te voegen 100 ul oplossing A + B over elke dekglaasje. Incubeer gedurende 30 min. Verwijder het medium. Eenmaal cellen met verse Neurobasal TF wassen. Zet de dekglaasjes naar de oorspronkelijke Neurobasaal kweekmedium.
- Culture neuronen nog eens 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 na transfectie efficiënte expressie en richten van de probe mogelijk maken.
- Bereiding van testoplossingen voor bioluminescentie beeldvorming.
- Bereid HBS oplossingen bevattende 100 pM NMDA of 145 mM KCl alshierboven (stap 2,1). Bereid HBS oplossing die 10 mM Ca2 + plus 100 pM digitonine.
- Reconstructie van mitochondriën gerichte aequorine met coelenterazine n.
- Overdracht dekglaasjes die getransfecteerde hippocampale neuronen vier-wells plaat met 200 ul HBS.
- Voeg 4 pi coelenterazine n (200 uM) aan 200 gl HBS voor een eindconcentratie van 4 uM en meng voorzichtig. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (25 ° C) en in het donker.
- Het opnemen van bioluminescentie beelden van mitochondriaal [Ca 2+].
- Schakel de microscoop, de lamp, het perfusie systeem, bioluminescentie camera en computer.
- Transfer opgelost dekglaasjes een thermostaat is (37 ºC) perfusie kamer en perfuseren continu met voorverwarmd HBS oplossing met een snelheid van 5-10 ml / min.
- Met behulp van een 40X objectief (olie, NA: 1,3), selecteer een microscopisch veld bevat cellen die het eenpoaequorins zoals blijkt uit fluorescentie-emissie geassocieerd met expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) met de FITC filters. Een typisch veld kan 1-2 getransfecteerde cellen bevatten. Leg beeld GFP fluorescentie, met behulp van een CCD-camera.
- Schakel de microscoop licht. Verwijder de-dichroïsch met doos in het licht pad. Schakel het excitatielicht en sluit het donker-doos voor volledige duisternis.
- Perfuseren cellen bij 5-10 ml / min met HBS medium met of zonder testoplossingen voorverwarmd op 37 ° C.
- Leg fotonische emissie beelden elke 10 seconden met een foton-tellende camera behandeld met een beeldprocessor.
- Aan het einde van elk experiment permeabilize cellen met 0,1 mM digitonine in 10 mM CaCl 2 in HBS om alle resterende fotonische stoffen afgeven.
Opmerking: Deze fotonische emissies worden opgeteld om de totale fotonische emissies, een waarde die voor kalibratie in Ca2 + concentraties schatten <./ li> - Store bioluminescentie beelden in de computer met een afbeelding van de GFP bijbehorende fluorescentie voordat het foton tellen beeldvorming gevangen.
- Analyse van bioluminescentie beelden reflecteren mitochondriaal [Ca 2+].
- Kwantificeren fotonische uitstoot met behulp van specifieke software. Fotonische emissies kunnen worden omgezet mitochondriale vrije Ca2 + -concentratie ([Ca2 +] mit) met de werkwijze beschreven door Brini et al. 15 algoritme.
- Open het beeld dat de GFP-fluorescentie experiment. Select gebieden van belang (ROI) met behulp van specifieke software door het tekenen van de vorm van de getransfecteerde cellen volgens de fluorescentiebeelden vastgelegd aan het begin van het experiment.
- Plak dezelfde ROI op elk beeld. Totaal fotonische emissies per ROI wordt berekend met specifieke software voor de luminescentie emissiewaarde (L) voor elke cel op elk punt in de tijd.
- Tel alle fotonische Emissionen in de bioluminescentie beelden, met inbegrip van die verkregen na permeabilisatie digitonine, met de specifieke software voor bioluminescentie beeld met alle fotonische-emissies.
- Export waarden van fotonische emissie voor elke regio van belang zijn voor een specifieke software voor de berekeningen. Om dit te doen, klikt u op 'Grafiek' om de bioluminescentie waarden te berekenen voor elke ROI op elk tijdstip. Selecteer 'totale waarde' en 'gebruik van de huidige ROI om alle beelden. Druk op 'berekenen'. Sla de 'txt.file' en exporteren naar een werkblad. Voor elke ROI, [Ca 2+] mit wordt berekend met het volgende algoritme:
[Ca 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
waar,
R = [L / (L totaal λ)] 1 / n
L is de geëmitteerde luminescentie ten tijde van de meting in elk gebied van belang.
L totaal isde totale resterende na toevoeging van de in het weefsel op dat moment op het tijdstip van de meting voor elk gebied van belang tellingen luminescentie. λ, TR K, K R en n constanten zijn waarvan de waarden afhankelijk combinatie van aequorine (wildtype of gemuteerd) en coelenterazin gebruikt (wild type of n-type) en de opname 16 temperatuur. Voor de combinatie gebruikt hier (gemuteerd AEQ en coelenterzine n), bij 37 ºC, gebruikten we de volgende waarden: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 en λ = 0138.
- Maak de overeenkomstige berekening voor het schatten van de omvang van de stijging van bioluminescentie voor iedere stimulus met een geschikte data-analyse en grafische software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we een eenvoudige methode om Ca2 + remodeling en de effecten van NMDA op cytosolische en mitochondriale evalueren [Ca 2,] in oude neuronen. Figuur 1 toont het schema van de werkwijze voor het isoleren en kweken van hippocampale neuronen van neonatale ratten. Voordat u begint, moeten we steriele, poly-D-lysine gecoat glas dekglaasjes bereiden en vinden ze in een 4-goed gerecht. Vervolgens worden neonatale ratten gedood en de hersenen verwijderd. Na het isoleren van de hippocampus, wordt het weefsel zorgvuldig verspreid met behulp van papaïne. Geïsoleerde cellen gewassen en uitgeplaat op gecoate dekglaasjes. Dan cellen worden gekweekt voor 2-5 DIV of> 15 DIV aan jonge of oude culturen, respectievelijk te krijgen, en gebruikt voor Ca 2+ imaging experimenten.
Met behulp van deze strategie is het mogelijk om jong en oud neuronen uit hetzelfde monster om te testen, bijvoorbeeld of NMDA differentiële effecten induceert op cytosolische [Ca 2,] in jonge cultures dan bij oudere kweken. Figuur 2 toont dat 100 uM NMDA induceert grotere verhogingen in cytosolisch [Ca 2,] in oudere cultures dan bij jonge culturen. Evenzo NMDA induceert celdood in oude neuronen, maar niet bij jonge neuronen 5. Wanneer Ca2 + responsen zijn zeer hoog, soortgelijke experimenten worden uitgevoerd met Ca2 + sondes uitgevoerd met minder affiniteit voor Ca2 + kleurstof verzadiging te voorkomen zoals bijvoorbeeld fura4F 5. Op dezelfde wijze is het ook mogelijk om te weten of rustende niveaus cytosolisch [Ca 2+] verschillend. Bovendien kan de combinatie van dit protocol kwantitatieve immunofluorescentie met behulp van antilichamen specifiek voor NMDAR subeenheden correlaat veranderingen in respons verschillen in expressie van NMDA receptor subunits voorwaarde toestaan dat specifieke antilichamen beschikbaar 5. Metingen van cytosolische [Ca 2+] kan ook worden gebruikt voor het beoordelen van andere relevante parameters waaronder Ca 2+ winkel inhoud, rustend doorlaatbaarheid voor Ca 2+, Ca 2+ klaring en de eventuele verschillen tussen jonge en oude neuronen.
Op soortgelijke wijze is het ook mogelijk om de effecten van dergelijke stimuli testen mitochondriaal [Ca 2,]. Figuur 3 toont een voorbeeld van bioluminescentie van hippocampale neuronen getransfecteerd met mitochondriën gerichte aequorine. Afgifte van fotonische emissie na stimulatie is een functie van de stijging van mitochondriaal [Ca 2+] bereikt. Merk op dat NMDA-geïnduceerde stijgingen van mitochondriaal [Ca 2,] in oude neuronen veel groter dan bij jonge hippocampale neuronen, waarbij NMDA verhoogt nauwelijks fotonische emissies. Deze resultaten kunnen bijdragen verklaren waarom NMDA apoptose alleen in oude neuronen, maar niet bij jonge kweken van hippocampale cellen 5. Op dezelfde wijze is het mogelijk om te testen op bijkomende verschillen in mitochondrialeCa2 + hanteren tussen jonge en oude neuronen via protocollen die specifiek ontworpen om te testen, bijvoorbeeld Ca2 + uitgang van mitochondria, mitochondrial Ca2 + opname in permeabel neuronen en mitochondriale Ca2 + opname geïnduceerd door Ca2 + afgifte uit intracellulaire opslagplaatsen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om te testen op drugs die mitochondriale Ca2 + overload die van belang zijn voor neuroprotectie tegen excitotoxiciteit kan zijn.
Figuur 1: Procedure voor isolatie van primaire rat hippocampale neuronen (A) poly-D-lysine, 12 mm glazen dekglaasjes bedekt worden bereid in een petrischaal en uiteindelijk overgebracht naar een 4-putjes.. (B) Dorsal weergave van een rattenhersenen. De stippellijn geeft aan waar de snede moet worden gemaakt. (C) Het verkrijgen alsuspension van primaire hippocampus neuron cellen. Na verwijdering van de hippocampus, wordt een celsuspensie verkregen. Daarna cellen worden uitgeplaat in 4 putjes bevattende poly-D-lysine beklede dekglaasjes. (D) het Heldere veld toont primaire rat hippocampale neuronen in cultuur. Balk geeft 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. NMDA verhoogt cytosolische [Ca 2,] in hippocampale neuronen korte en lange termijn gekweekte hippocampale neuronen werden geladen met fura2 / uur en onderworpen aan fluorescentiebeeldvorming. Foto's tonen representatieve helder veld en pseudocolor beelden (Ratio F340 / F380) van de korte termijn (A) en lange termijn (B 2+] (pseudocolor schalen worden getoond aan de onderkant). Sporen tonen representatieve, single-cell opnames van cytosolisch [Ca 2+] in reactie op de 100 uM NMDA in kortlopende (A) en lange termijn (B) gekweekte hippocampale neuronen. Merk op dat cytosolische [Ca 2+] stijgingen zijn in de lange termijn veel groter dan in de korte-termijn gekweekte neuronen. Balk geeft 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. NMDA induceert mitochondriale Ca 2+ overbelasting in de hippocampus neuronen Cultured hippocampus neurons werden met de lage affiniteit, mitochondria gerichte aequorine gefuseerd met GFP, geïncubeerd met 4 uM coelenterazine en onderworpen aan bioluminescentie beeldvorming van mitochondriaal [Ca 2+]. Foto's tonen de fluorescentie (GFP) en geaccumuleerde fotonische emissies (aequorin bioluminescentie) beelden van representatieve korte (A) en lange termijn (B) gekweekte hippocampale neuronen. Luminescentie-intensiteit wordt gecodeerd pseudocolor (1-16 fotonische emissies per pixel). Opnamen tonen de afgifte van fotonische emissie (uitgedrukt mitochondriaal [Ca 2+]) in korte (A) en lange termijn (B) gekweekte hippocampale neuronen. 100 pM NMDA verhoogde mitochondrial [Ca 2,] in oude neuronen, maar niet bij jonge gekweekte hippocampale neuronen. Balk geeft 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. </ a>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De herinrichting van intracellulaire Ca2 + homeostase in het ouder wordende hersenen is gerelateerd aan cognitieve verliezen, verhoogde gevoeligheid voor ischemische schade, excitotoxiciteit en neurodegeneratie. Om deze hypothese in vitro onderzoeken, Ca 2+ beeldvormende procedures beschikbaar. Helaas, levensvatbare kweken van hippocampale neuronen oude niet betrouwbaar. Recentelijk is waargenomen dat langdurige culturen van de rat hippocampale neuronen onderhavige veel van de typische kenmerken van veroudering in vivo zoals ROS accumulatie vorming van lipofuscine granules, heterochromatic foci, activering van pJNK en p53 / p21 pathways, cholesterol verlies, en verandert de dichtheid van Ca2 + kanalen en NMDA receptoren 14. Dienovereenkomstig kan Ca 2+ imaging experimenten bij jonge en oude culturen van de rat hippocampale neuronen nieuwe inzichten van Ca 2+ remodeling in de ouder wordende hersenen bieden. Een aandoening die is van cruciaal belang voor het kweken HippocaMpal neuronen op lange termijn is tweeledig. Ten eerste is het belangrijk om de cellen plaat bij een zeer lage dichtheid zoals hierboven vermeld. Ten tweede worden de cellen gekweekt in aangevuld Neurobasal Medium zonder dat het medium. Deze aanpak maakt het mogelijk de aanwezigheid van glia maar het vermijden van hun overdreven groei. Het schema voor deze kweek wordt getoond in figuur 1.
Fluorescentie beeldvorming met synthetische Ca 2+ sondes kan de monitoring van de cytosolische [Ca 2+] in individuele neuronen 19. Het gebruik van deze benadering bij jonge en oude neuronen maakt het monitoren van veranderingen in de reacties met de leeftijd in kweek. Bijvoorbeeld Figuur 2 toont typische helderveld en Ca2 + beelden van de stijgingen van [Ca 2+] cyt geïnduceerd door NMDA bij jonge neuronen en van neuronen verouderde kweken. Merk op dat reacties in oude neuronen veel groter dan bij jonge neuronen. Echter, deze procedure niet betrouwbaar voor [Ca 2+] Metingen binnen subcellulaire organellen zoals bijvoorbeeld mitochondria, waarbij [Ca 2+] kan variëren van onder de uM tot boven het niveau mM. In die gevallen proteïne gebaseerde, op mitochondriën gerichte sondes zijn ontwikkeld als bijvoorbeeld aequorine. Deze sonde is bijzonder interessant omdat zijn affiniteit voor Ca 2+ fijn kan worden afgestemd om te controleren zeer lage of zeer hoge [Ca 2+] zoals die bereikt binnen mitochondria in rust en gestimuleerd voorwaarden, respectievelijk. Specifiek is het mogelijk om ofwel de wildtype of gemuteerde aequorine aequorine zonder Ca2 + bindingsplaatsen om de affiniteit te wijzigen selecteren. Fijnafstemming wordt verkregen wanneer verschillende coelenterazines (wildtype, h, n) worden gebruikt in combinatie met verschillende aequorins 17. Echter, terwijl het gebruik van fluorescentie voor Ca 2+ imaging is wijdverbreid, monitoring bioluminescentie is niet eenvoudig en kunnen fotontellende camera's nodig. Gelukkig aequorineprobes, zoals hier gebruikt, zijn verbeterd co-express GFP 18 waardoor ze stabieler, kunnen meer fotonische uitstoten en waardoor eenvoudige identificatie van getransfecteerde cellen door de GFP-geassocieerde fluorescentie. Succes in bioluminescentie in neuronen hangt niet alleen af van de efficiëntie van het foton tellende camera gebruikt, maar ook op de efficiëntie van de transfectie van de mitochondriën gerichte probe. Bij hippocampale neuronen, kan een eenvoudige chemische transfectie werken mits een zeer gevoelige fotontellende camera beschikbaar is. Figuur 2 toont voorbeelden van helderveld, GFP fluorescentie en bioluminescentie beelden van jonge en oude cultuur hippocampale neuronen. Ook getoond zijn de stijgingen van mitochondriaal [Ca2 +] opgewekt door NMDA opgenomen in getransfecteerde hippocampale neuronen. Merk op dat het effect van NMDA in gekweekte neuronen leeftijd veel groter dan bij jonge neuronen. In andere gevallen de efficiency van het transfectie kan worden verhoogd door gebruik virus afgeleide vectoren 16,18. Als alternatief, de ontwikkeling van transgene muizen die op proteïne gebaseerde, subcellulaire Ca 2+ probes is een nieuwe optie voor toekomstige pogingen, misschien zelfs in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
