Abstract
신경 변성과 허혈에 관련된 신경 세포 사멸에 대한 감수성이 대단히 세 뇌에서 증가하지만 책임 메커니즘이 심하게 알려져있다. 흥분 독성 (excitotoxicity), 두 모욕에 의해 유도 된 신경 세포 손상에 기여하는 것으로 과정은 칼슘 유입 및 미토콘드리아의 칼슘 과부하를 촉진 글루타메이트 수용체의 활성화에 의해 매개된다. 세포 내 칼슘 항상성의 세포 내 칼슘 항상성 또는 리모델링에 상당한 변화가 된 신경 세포에서 신경 세포의 손상을 선호 할 수 있습니다. 노화에 칼슘 리모델링을 조사를 위해 우리는 생체 내에서 뉴런 세 일부 측면에서 유사한 쥐의 해마 신경 세포의 장기 문화에서 라이브 세포 이미징을 사용했다. 이를 위해, 해마 세포는 처음에 갓 새로 태어난 쥐의 해마에서 분산 POLI-D 라이신 코팅, 커버 글라스에 도금입니다. 그런 문화는 며칠 동안 제어 매체에 보관 또는 W 몇 가지있다각각, 젊은이와 노인 신경 세포를 조사하기위한 eeks. 둘째, 배양 된 신경 fura2 로케이션 디지털 형광 비 이미징을 사용하여 세포질 칼슘 농도의 측정을 실시한다. 셋째, 배양 된 신경 세포는 미토콘드리아를 대상으로 낮은 선호도 쿼린 및 GFP의 탠덤을 표현하는 플라스미드로 형질된다. 24 시간 후, 균체 내에 쿼린은 코 엘렌 테라으로 재구성되고 뉴런은 미토콘드리아의 칼슘 이온 농도를 모니터링 생물 발광 촬상을 실시한다. 이 세 단계의 절차는 예를 들어, 글루타메이트 수용체 효능 NMDA 및 이들과 다른 응답이 노화에 의해 영향을 받고 있는지 여부를 비교 관련성 자극 세포질과 미토콘드리아 칼슘 응답의 모니터링을 허용한다. 이 절차는 어떻게 영향 세포질과 미토콘드리아 칼슘 선택 자극에 대한 반응뿐만 아니라, 신경 세포를 방지하기위한 선택 약물의 테스트를 노화에 관한 새로운 통찰력을 얻을 수있다노화 관련 질환 사망.
Introduction
흥분 독성은 허혈과 같은 신경 욕설에서 신경 손상과 세포 사멸에 관여하는 가장 중요한 메커니즘 중 하나이며, 알츠하이머 병 (1)과 같은 몇 가지 신경 퇴행성 질환이다. 신경 독성의이 유형은 주로 칼슘 글루타메이트 작용에 의해 매개된다 2+ -permeable, 이온 성 NMDA 수용체 (NMDAR) 2. 글루타메이트에 배양 된 신경 세포의 노출은 신경 세포 사멸 4가 발생 흥분 독성 (excitotoxicity) 3로 이어질 수 있습니다. 우리와 다른 사람은 이전에 NMDA에 의한 세포 사멸에 신경 취약점이 체외에서 개발 및 5-8 노화로 변경 될 수 있다고보고있다.
널리 세포질 무 칼슘 농도 ([칼슘] CYT)의 증가는 세포의 활성화에 이르게하는 것이 허용된다. 이 너무 높게 상승 및 / 또는 충분히 지속 된 경우에는, 그 세포 사멸을 유발할 수 9. 또한,이 제안되어있다그 흥분 독성 (excitotoxicity)는 미토콘드리아의 칼슘 흡수 (10), 글루타메이트에 의한 세포 사멸 (11)에 대한 미토콘드리아 uncoupler 보호 뉴런과 뉴런을 치료부터해야합니다. 미토콘드리아는 칼슘을 너무 많이 차지하면 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개통은 시토크롬 C 및 기타 프로 세포 사멸 인자와 유도 세포 사멸의 해제로 이어지는 발생할 수 있습니다. 우리는 최근에이 미토콘드리아의 칼슘 흡수가 직접 직접 하나의 해마 신경 세포 5 NMDA에 의한 미토콘드리아의 칼슘 흡수,이 문서에보고하는 방법을 측정하여, 흥분 독성에 나이 의존 감수성과 관련이 있음을 보여 주었다. 이러한 학습, 기억과 다른인지 과정 (12)과 같은 생리적 과정에 관여하는 해마는 노화 및 퇴행성 신경 질환 (13)에 매우 취약합니다. 이 시험관 내에서 몇 주 후에, 제안 된 배양해마 신경 세포는 14 세 뉴런의 전형적인 특성들을 나타낸다. 따라서, 장기 배양 해마 신경 세포가 노화 강화 흥분 독성 (excitotoxicity)의 칼슘 - 매개 메커니즘을 조사하기 위해 포괄적 인 모델을 제공 할 수있다.
제시된 방법의 전체 목표에 따라서, 장기 배양 된 해마 뉴런에서 NMDA 수용체 작용제에 의해 유발되는 차동 칼슘 응답을 포함한 노화 뇌 세포 내 칼슘 항상성 또는 칼슘 리모델링에 실질적인 변화를 조사한다 . 방법은 각각 래트 해마의 신경 세포 배양의 상세한 설명 및 개별 뉴런의 형광 및 생물 발광 이미징에 의해 미토콘드리아 세포질 칼슘 농도의 모니터링을 포함한다. 배양 된 신경 세포의 세포질 칼슘의 형광 이미징은 표준 절차입니다. 그러나이 방법은 서브 덜 신뢰할 수있다세포의 칼슘 미토콘드리아의 칼슘을 포함하여 2 + 측정. 이것에 대한 이유도 mM의 수준으로 낮은 μm의 수준에서 미토콘드리아에서 변경 될 수 있습니다 칼슘 농도에 대한 합성 프로브의 적절한 타겟팅 및 부적절한 친 화성의 부족을들 수있다. 인스턴스 쿼린 등의 단백질에 대한 기초 칼슘 프로브의 사용은, 세포 내 소기관으로 타겟팅 특정 칼슘 결합 부위 (15)가 부족한 다른 coelenterazines 또는 돌연변이 된 프로브를 사용하여 다른 칼슘 친화 유도체의 사용을 허용하고있다. 이러한 방식으로, 미토콘드리아 타겟팅 쿼린을 발현하는 세포의 생물 발광 촬상 개별 뉴런 미토콘드리아 칼슘 농도의 모니터링을 허용 할 수있다. 그러나,이 절차는 생물 발광 촬상 16-18 대 광자 카운팅 고감도 카메라 또는 CCD 카메라의 사용을 요구할 수있다. 더 establ입니다에서 확인해야 새로운 결과를 얻을 수 있습니다이 방법예를 들어 같은되고 이로 뇌 노화 모델, 오래된 동물의 뇌 조각.
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Protocol
윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 유럽 협약 (123) / 유럽 의회 및 지침 6백9분의 86 / EEC와 일치 발라 돌 리드 대학 동물 주택 시설에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 처리되고있다.
쥐 해마 신경 세포의 1. 단기 및 장기 문화
- 폴리 D 라이신의 제조, 12mm 커버 글라스 코팅.
- 최소 24 시간 동안 에탄올에 12mm 직경 커버 글라스를 소독. 그들이 멸균 조건에서 건조하도록 허용합니다.
- 페트리 접시에 파라 필름의 스트립에 커버 슬립을 배포합니다. 1 ㎎ / ㎖ 폴리 D 라이신 200㎕의 각 커버 슬립의 표면을 커버. O / N 치료를 허용합니다.
- 다음 날은 멸균 조건에서 90 분 동안 두 번 증류수 멸균 수로 매 15 분을 커버 슬립을 씻는다.
- 로 Neurobasal 문화 매체의 500 μL와 네 잘 multidish 판을 채우기 당 잘. 로 Neurobasal 문화 매체는 보충해야한다10 % 소 태아 혈청, 2 % B27, 1 μg의 / ㎖ 젠타 마이신 및 2 mM L- 글루타민.
- multidish 판에 커버 슬립을 놓습니다. 사용할 때까지 가습 37 ºC 5 % CO 2 배양기에서 그들을 유지합니다.
- 신생아 쥐에서 해마 신경 세포의 분리.
- 멸균 조건 하에서 바이알 (20 μL / ml)에 1.8 ml의 파파인 용액을 (직접 구입) 제조 : 20 μL의 최종 농도를 얻기 위해 / 1.8 ml의 행크의 플러스 0.6 %의 BSA로 40 μL 파파인 추가 ㎖ (μL 계산되어야 ) 공급 업체의 조건에 따라. 행크의 0.6 %의 BSA가 4 % 소 혈청 알부민의 15 ㎖의 HBSS 배지 85 ml를 혼합하여 제조된다 (BSA, 100 ㎖의 HBSS에 BSA 4g을 해결 제조). 멸균 후드를 준비합니다.
- 사용하기 전에 37 ºC에서 30 분 동안 행크의 플러스 0.6 % BSA의 파파인을 품어. 사용 전에 0.22 μm의 필터를 사용하여 용액을 필터.
- 둘 베코의 추가하여 햄의 F-12 매체를 준비두 번 증류 멸균 물 900 ㎖에 이글의 중간 분말 (L 당 13.5 g)을 수정. 이어서 6g의 HEPES 및 336 밀리그램의 NaHCO3를 추가하고 NaOH로 4 N.은 1 L의 용액을 얻었다와 0.20 μm의 폴리 에테르를 사용하여 필터링하기 위해 멸균 물을 첨가하여 7.42으로하여 pH를 조정 (PES)은 상부 필터 병. 멸균 후드에이 과정을 수행. 마지막으로 사용하기 전에 멸균 조건에서 이산화탄소와 솔루션을 포화. 쇼핑몰 솔루션 4 ºC에서 그들을 냉장 사용합니다.
- 잘린 신생아 (P0) 쥐의 새끼를 안락사 및 멸균 HBS 매체에 머리를 씻는다. 멸균 가위의 도움으로 두개골을 엽니 다. 주걱으로 뇌를 추출하고 햄의 F-12 매체에 신속하게 씻는다.
- 각 반구 (도 1b)의 메스의 도움으로 대각선 절단을하고, 햄 F-12 배지를 함유하는 페트리 접시로 나른다.
- 해부 포셉의 도움과 돋보기 아래 신중하게 폐기 수막. <리> 돋보기를 사용하여 피질을 통해 특성 오목 위치에 해마를 확인합니다. 그런 다음, 하나의 국경에서 조심스럽게 잡아 당겨 눈 가위를 사용하여 위치에서 제거하여 피질에서 해마를 분리합니다.
- 멸균 행크의 매체 칼슘이 부족 2+ 및 마그네슘 2 + 플러스 0.6 % BSA로 가득 4 웰 플레이트에 해마 조직을 전송하고 해마 조직을 씻는다. 제거하지 않고 미디어는 같은 눈 가위를 사용하여 작은 조각의 조직 (2 × 2 약 mm)를 절단.
- 1.8 ml의에게 사전 필터링 파파인 솔루션을 포함하는 유리 병에 해마 조각을 전송합니다. 그리고 가끔, 부드러운 흔들림 37 ºC에서 그들을 품어. 15 분 후 (최종 50 μg의 / ㎖)의 DNase I 솔루션의 90 μl를 추가하고 15 추가 분 동안 품어.
- 10 ML의 원심 분리기 튜브에 조직을 전송하고 신선한로 Neurobasal 문화 매체와 조각을 씻는다. 5 ml의 플라스틱 핍을 통해 조직의 조각을 전달하여 세포 현탁액을 얻기두기가.
- 5 분 160 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 플라스틱 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고로 Neurobasal 문화 매체의 1 ml의 피펫을 자동화 1 ㎖로 조심스럽게 펠렛을 일시 중지합니다.
- 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포 밀도를 측정한다. 노이 바 우어 챔버 위에 유리 커버 슬립을 넣습니다. 세포 현탁액의 10 μl를 추가합니다. 세포 현탁액이 균일하고 기포을하지 챔버를 입력해야합니다. 현미경 하에서 세포의 개수를 계산하고 30 × 103 세포를 함유하는 40-80 μL의 적합한 방울을 구하는 대응 계산을 수행한다. 세포의 총 수는 사용 된 동물의 수에 의존 할 것이다.
- 각각 약 50 μL의 드롭 약 30 × 10 3 세포로 Neurobasal 문화 매체의 500 μl를 포함하는 네 잘 multidish 접시 위에 전에 준비 인큐베이터, 판에 보관물론 하나의 폴리 D 라이신 코팅 된 12mm 직경의 유리 커버 슬립 함유 multidish 플레이트.
- 문화를 변경하지 않고 실험 전에 체외에서 2-5일 (DIV, 단기, 젊은 문화) 또는> 15 DIV (장기, 노인 문화)에 대한 가습 37 ºC 5 % CO 2 배양기에서 차 해마 세포를 유지 메디아.
세포질 칼슘 2. 형광 이미징 2+ 농도
- 형광 이미징을위한 테스트 솔루션의 준비.
- 염화나트륨 (145), KCl을 5의 MgCl 2 1, 염화칼슘 (2) (1), 포도당 (10), 나트륨 HEPES 10 (PH 7.42) : MM에 포함하는 외부 HEPES 완충 식염수 (HBS) 솔루션을 준비합니다.
- 염화나트륨 (146), KCl을 5, 포도당 CaCl2를 1, 10, HEPES 10 (PH 7.42) : MM에 포함하는 외부의 Mg 2+ - 무료, HEPES 완충 식염수 (HBS) 솔루션을 준비합니다.
- FINA에서 NMDA의 Mg 2+ - 무료에, HEPES 완충 식염수 (HBS)를 해결100 μM의 L 농도가 10 μM 글리신과 함께 보충.
- (단위 : mm)에 의해 해결 NaCl 대신 KCl을 함유 HBS 용액을 제조 하였다 : 145의 KCl, 1의 MgCl 2, CaCl2를 1, 10, 10 HEPES (PH 7.42)를 글루코스.
- 형광 칼슘 프로브 fura2 / AM와 해마 세포의로드.
- 인큐베이터 해제 된 커버를 포함하는 세포 배양을 가지고 500 HBS의 μL 당 우물을 포함하는 새로운 4 웰 multidish 플레이트로 전송하여 실온에서 HBS 매체를 씻는다.
- fura2와 세포를 품어 / 어두운 곳에서 실온 (25 ° C)에서 60 분 동안 (같은 HBS 매체에서 제조) 오전 4 μm의.
- 60 분 후, 신선한 HBS 매체와 커버 슬립을 씻는다.
- 세포질의 기록 형광 이미지 [칼슘] 배양 세포에서.
- 램프, 현미경, 관류 시스템, 형광 카메라와 컴퓨터를 켭니다.
- 을위한 항온 플랫폼 된 커버를 배치거꾸로 현미경의 무대에서 열린 12mm 커버 글라스와 40X 목표 (1.3 오일, NA)를 사용하여 미세한 필드를 선택합니다. 부재 또는 시험 물질의 존재 (37 ° C) 예열 HBS 매체 지속적으로 세포를 관류. / 분으로 약 5-10 ㎖가 흐름 속도를 유지한다.
참고 : 살아있는 세포에 대한 세포 관류 시스템이 오픈 12mm 커버 글라스를위한 항온 플랫폼에 장착된다. 밸브 제어부를 구비 8 라인 중력 중심 관류 시스템 솔루션을 관류하는 데 사용된다. 진공 펌프는 과도한 매질을 제거 할 책임이있다. 솔루션에서 튜브 가열 시스템을 이용하여 가열된다. - 셔터가 모두 여기 파장에서 닫힌 배경 이미지를 캡처.
- 340 및 380 nm에서 번갈아 세포 에피는-조명. 기록 등이 520 나노 미터의 Fura-2 다이크로 익 미러에 의해 필터링되는 형광 카메라,과마다 5 ~ 10 초에서 방출.
- 기록 기간이 종료되면, 완전한 시퀀스 O 저장할F 이미지는 추가 분석을 위해 컴퓨터에 520 nm에서 방출.
- 기록 된 형광 이미지 분석.
- 실험 파일을 엽니 다. aquacosmos 소프트웨어를 사용하여, '비율'을 클릭하고 원하는 비율의 범위를 선택합니다. 비 이미지의 시퀀스를 얻기 위해 생성 된 이미지에서 화소의 비율에 의해 픽셀을 계산한다.
- '배경 제거'를 조정하여 배경을 뺍니다. 를 눌러 '시작 계산'.
- 를 눌러 '항상 순서'버튼과 관심의 고대 영역을 삭제 (로아). 개별 셀의 정량 분석을 위해, 개별 뉴런에 해당하는이자 또는 로아의 새로운 영역을 설정합니다. 각 ROI 각 화상에 대응하는 각 화소의 평균 비율 모든 값은 개개의 ROI (셀)에 대한 비 형광 값의 기록을 얻었다.
- 그래프 progr에 각각의 투자 수익 (ROI)에 해당하는 비율의 형광 값을 내보내 개인 기록을 그래프로오전.
- 적절한 데이터 분석을 이용하여 각각의 자극에 응답하여 비 fluorescences의 상승의 크기를 추정하는 소프트웨어를 그래프에 해당하는 계산을 할.
미토콘드리아 칼슘 3. 생물 발광 영상 2+ 농도
- mitGAmut 플라스미드 배양 해마 신경 세포의 형질.
주 : 세포를 제 미토콘드리아 타겟팅 서열 및 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합 칼슘 결합 부위 부족한 돌연변이 쿼린 함유 mitGAmut 플라스미드로 형질 감염된다. 이 구성은 미토콘드리아 칼슘 흡수에 큰 상승을 검출하고, GFP 형광에 의해 형질 감염된 세포의 확인을 허용한다. 플라스미드를 개발하고 친절 P. Brûlet 및 동료 (18) (CNRS, 파리)에 의해 제공되었다.- 소 태아 혈청을 결여로 Neurobasal 배양액을 함유로 Neurobasal TF 준비, B27, gentamic및 2 mM의 L- 글루타민.
- 로 Neurobasal TF의 50 μL 플러스 유리 병 (솔루션) 2.5 μL 형질 전환 시약을 준비합니다. (50)로 Neurobasal의 TF의 μL 플러스 4 μg의 유리 병에 mitGAmut 플라스미드 (솔루션 B)를 준비합니다. 흔들림없이, 20 분 동안 혼합 허용 솔루션 A. 위에 부드럽게 용액 B를 추가합니다.
- 신선한로 Neurobasal의 TF 200 μl를 포함하는 새로운 multidish 판에 해마 신경 세포가 포함 된 커버를 전송합니다.
- 모든 커버 슬립을 통해 드롭에 의해 용액 A + B의 100 μl를 드롭을 추가합니다. 30 분 동안 품어. 매체를 제거합니다. 신선한로 Neurobasal의 TF와 세포 번 씻으십시오. 원래로 Neurobasal 문화 매체로 된 커버를 돌려줍니다.
- 37 ºC 5 % 형질 전환 후 CO 2에서 추가 24 시간 동안 배양 신경 세포 효율적인 표현과 프로브의 목표를 허용합니다.
- 생물 발광 이미징을위한 테스트 솔루션의 준비.
- 100 μM NMDA로 또는 145 mM의 KCl을 함유 HBS 용액을 제조상기 (단계 2.1). 10 mM의 칼슘을 포함하는 2 + 플러스 100 μM을 디기 토닌 HBS 솔루션을 준비합니다.
- 코 엘렌 테라가 n 인 미토콘드리아 - 타겟 쿼린의 재구성.
- HBS 200 ㎕를 함유하는 네 개의 웰 플레이트에 형질 해마 신경 세포를 포함하는 전송 된 커버.
- 4 μM의 최종 농도에 대한 HBS 200 μL에 코 엘렌 테라의 N (200 μM)의 4 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. RT (25 ° C)에서 2 시간 동안 어둠에 품어.
- 미토콘드리아의 기록 생물 발광 이미지 [칼슘 2 +].
- 현미경, 램프, 관류 시스템, 생물 발광 카메라와 컴퓨터를 켭니다.
- 온도 조절 (37 ºC) 관류 챔버에 재구성 된 커버 옮기고 50-10 ml / 분의 속도로 미리 예열 HBS 용액으로 연속적으로 관류.
- 40X 대물 렌즈 (오일, NA : 1.3)를 이용하면, 발현 세포를 포함하는 미세 필드를 선택FITC 필터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현과 관련된 형광 방출에 의해 도시 된 바와 같이 poaequorins. 일반적인 필드는 1-2 형질 감염된 세포를 포함 할 수있다. CCD 카메라를 사용하여, GFP 형광 이미지를 캡처.
- 현미경의 빛을 끕니다. 빛 경로에있는 이색 함유 상자를 제거합니다. 여기 광을 끄고 완전한 어둠에 대한 어두운 상자를 닫습니다.
- 또는 시험 용액 37 ºC에서 미리 예열없이 HBS 매체 5-10 ㎖ / 분에서 세포를 관류.
- 광자 방출 이미지를 이미지 프로세서로 처리 광자 계수 카메라로 매 10 초를 캡처합니다.
- 각 실험의 끝에서 나머지 광을 방출하기 위해 HBS 10mm의 디기 토닌에 0.1 mM의 CaCl2를 가진 세포를 Permeabilize 하시려면.
참고 :이 광 배출이 전체 광자 방출, 칼슘 농도 교정에 필요한 값을 추정하기 위해에 추가해야합니다 <./ 리> - GFP 관련 형광 이미지로 컴퓨터에 보관 생물 발광 이미지는 광자 계수 이미징 전에 캡처.
- 미토콘드리아 [칼슘 2 +]를 반영하는 생물 발광 이미지 분석.
- 특정 소프트웨어를 사용하여 광 배출량을 정량화. 광 배출은 미토콘드리아 자유 칼슘으로 전환시킬 수있다 2 + 농도 ([칼슘] MIT) Brini 외. (15)에 의해 설명 된 알고리즘을 사용.
- 실험 및 GFP의 형광 이미지를 엽니 다. 실험의 시작 부분에서 촬영 된 형광 화상에 의한 형질 전환 세포의 형상을 그려서 특정 소프트웨어의 도움으로 관심 (로아)의 선택 영역.
- 모든 이미지에 동일한 ROI를 붙여 넣습니다. 각 ROI의 총 광 배출은 각 시점에서 각 셀에 대한 발광 방출 값 (L)을 얻기위한 특정 소프트웨어로 계산된다.
- 모든 광자 emiss을 추가모든 광 방출을 함유 생물 발광 이미지를 얻기 위해, 특정 소프트웨어를 이용하여 투과성으로 만들어를 디기 토닌 후의 것들을 포함 생물 발광 이미지 내의 이온.
- 계산을위한 특정 소프트웨어에 대한 관심의 모든 지역에 대한 광자 방출의 수출 값. 이렇게하려면, 각 시간에 모든 투자 수익 (ROI)에 대한 생물 발광 값을 계산하기 위해 '그래프'를 클릭하십시오. '총액'을 선택하고 '모든 이미지에 현재의 투자 수익 (ROI)을 사용합니다. 를 눌러 '계산'. 워크 시트에 'txt.file'수출 데이터를 저장합니다. 모든 투자 수익 (ROI)를 들어, [칼슘 2 +] MIT는 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 계산된다 :
[칼슘 2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]
어디에,
R = [L / (L 총의 λ)] 1 / N
L은 관심있는 각각의 영역에서 측정시 방출 발광이다.
L 총입니다관심있는 각각의 영역에 대해 측정시, 그 때의 조직에 존재하는 개수의 첨가 후 남아 총 발광. λ, K (TR), K, R n은 그 값의 애큐 오린의 조합에 따라 (야생형 또는 돌연변이)과 coelenterazin 사용 (야생 형 또는 n 형) 상수뿐만 아니라 기록 온도 (16)이다. 여기에 사용되는 조합은 37 ºC에서, (AEQ 및 coelenterzine 없음을 돌연변이), 우리는 다음과 같은 값 사용 : K R = 8.47 × 10 (7), K (TR) = 165.6 × 10 (3), N 1204 및 λ = 0138 =.
- 적절한 데이터 분석을 이용하여 각각의 자극에 응답하여 생물 발광의 상승의 크기를 추정하는 소프트웨어를 그래프에 해당하는 계산을 할.
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Representative Results
여기에 우리가 칼슘 리모델링 및 세포질과 미토콘드리아에 NMDA의 효과를 평가하기 위해 간단한 방법을 설명 [칼슘 2 +] 세 뉴런. 그림 1은 분리 및 신생아 쥐에서 해마 신경 세포를 배양하기위한 절차의 회로도를 보여줍니다. 시작하기 전에, 우리는 살균, 폴리 D 라이신 코팅, 커버 글라스를 준비하고 4 잘 접시에 그들을 찾을 필요가있다. 그런 다음, 신생아 쥐 사망하고 뇌가 제거됩니다. 해마를 분리 한 후, 조직을 조심스럽게 파파인을 이용한 분산된다. 분리 된 세포 세척 및 코팅 된 커버에 도금되어있다. 그런 다음 세포는 2-5 DIV 또는 각각 젊은이나 노인 문화를 얻을 수> 15 DIV 배양 및 칼슘 이미징 실험에 사용됩니다.
상기 전략을 사용하여, 테스트 할 같은 시료에서 노소 뉴런을 가질 수있다, 예를 들면, NMDA는 [칼슘] 젊은 cultu의 세포질에 차등 효과를 유도하는지 여부오래된 문화에 비해 입술. 2 NMDA 100 μM이 세포질에서 큰 증가를 유도 것을 보여줍니다 [칼슘 2 +] 젊은 문화보다 오래된 문화. 마찬가지로, NMDA 이전 뉴런하지만 어린 신경 5에서 세포 사멸을 유도한다. 칼슘 응답이 매우 높은 경우, 유사한 실험 fura4F 5 예를 들어, 염료 등의 포화를 방지하기위한 적은 칼슘 친화 칼슘 프로브를 행할 수있다. 동일한 방식으로, 그것의 세포 내 수준이 쉬고 [Ca를 2+] 다른지 알아하는 것도 가능하다. 또한, NMDAR 소단위에 대해 특이적인 항체를 이용하여 정량적 인 면역 형광이 프로토콜의 조합이 특정 항체 5 가능한지 제공 NMDA 수용체 서브 유닛의 발현의 차이와 상관 관계에 응답 변화를 허용 할 수있다. 세포질의 측정 [CA는 2+] 다른 관련 paramete을 평가하기 위해 또한 사용될 수있다칼슘 저장 내용을 포함 RS, 칼슘에 투과성을 쉬고, 칼슘 통관 속도와 젊은 세 뉴런 사이에 자신의 수의 차이.
유사한 방식으로,이 미토콘드리아에 이러한 자극의 효과를 테스트하는 것이 가능하다 [CA는 2+].도 3은 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 형질 해마 뉴런의 생물 발광 영상의 예를 나타낸다. 자극 후 광자 방출의 릴리스는 미토콘드리아의 증가의 함수이다 [칼슘 2 +] 달성했다. 미토콘드리아에서 그 NMDA에 의한 상승에 주목 [칼슘 2 +] NMDA 거의 광자 방출을 증가 젊은 해마 신경 세포에서보다 세 뉴런 훨씬 크다. 이러한 결과는 NMDA는 세 뉴런에 있지만 해마 세포 5의 젊은 문화에서 세포 사멸을 유도하는 이유를 설명하는 데 기여할 수있다. 동일한 방식으로, 이는 미토콘드리아의 추가적인 차이를 테스트 할 수있다칼슘 예를 들어 구체적으로 테스트 할 수 있도록 설계 프로토콜을 사용하여 젊은 나이 뉴런 사이에 처리, 칼슘 미토콘드리아에서 2+ 종료, 세포 내 상점에서 칼슘 방출에 의한 투과성이 신경 세포와 미토콘드리아의 칼슘 흡수에 미토콘드리아의 칼슘 흡수. 또한,이 방법은 신경 흥분 독성에 대하여 대한 관심이 될 수있는 칼슘 과부하 미토콘드리아에 영향을 미치는 약물을 시험하는 데 사용될 수있다.
도 1 : 일차 래트 해마의 신경 세포의 분리를위한 절차 (A) 폴리 -D- 라이신, 12mm 유리 코팅 된 커버 슬립은 페트리 접시에서 제조하고 마지막 4 웰 접시에 전송된다.. 쥐 뇌의 (B) 느 러 미보기. 절단이 수행해야하는 위치를 점선를 나타냅니다. (C)로서 취득차 해마 신경 세포 uspension. 해마를 제거한 후, 세포 현탁액이 얻어진다. 이어서 세포를 폴리 -D- 리신 코팅 된 커버 슬립을 함유하는 4 웰 접시에 도금된다. (D) 문화에 기본 쥐의 해마 신경 세포를 보여주는 밝은 필드 이미지. 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. NMDA는 세포질을 증가 [칼슘] 해마 신경 세포의 단기 및 장기 배양 해마 신경 세포는 fura2 / AM로드 및 형광 이미징을 실시 하였다. 사진은 단기 (A) 및 장기의 대표 시야와 사색 이미지 (비율 F340 / F380) (B 표시 2 +] (사색 규모가 하단에 표시됩니다) 반영합니다. 흔적은 세포질의 대표, 단일 셀 녹음을 보여 [칼슘] 단기 (A) 및 장기 (B) 배양 된 해마 신경 세포에서 100 μm의 NMDA에 응답. 그 세포질 참고 [칼슘 2 +] 증가는 단기 배양 신경 세포에 비해 장기적으로 훨씬 더 크다. 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. NMDA는 해마 신경 세포에서 미토콘드리아의 칼슘 과부하를 유도 배양 된 해마 neur기능은 미토콘드리아 대상 쿼린는 GFP 융합 4 μM의 코 엘렌 테라와 함께 배양하고 [칼슘 2 +] 미토콘드리아의 생물 발광 영상을 실시, 낮은 친화력으로 형질 감염시켰다. 사진은 형광 (GFP) 및 축적 된 광자 방출 (쿼린의 생물 발광) 대표 단기 (A) 및 장기 (B) 배양 된 해마 신경 세포의 이미지를 보여줍니다. 발광 강도는 (픽셀 당 1 내지 16 광자 방출) 의사 색조로 부호화된다. 녹음은 단기 (A) 및 장기 (B) 배양 된 해마 신경 세포 (미토콘드리아 [칼슘 2 +]로 표시) 광자 방출의 방출을 보여줍니다. NMDA 100 μm의 증가 미토콘드리아 [칼슘 2 +] 세 뉴런에하지만 젊은 배양 해마 신경 세포에서. 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </>
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Discussion
노화 뇌 세포 내 칼슘의 리모델링 2 + 항상성이인지 적 손실과 관련되어, 허혈성 손상, 흥분 독성 및 신경 퇴행에 대한 감수성을 증가했다. 체외에서이 가설을 조사하기 위해, 칼슘 이미징 절차를 사용할 수 있습니다. 불행하게도, 이전 해마 신경 세포의 생존 문화는 신뢰할 수 없습니다. 최근에는 관찰되었음을 래트 해마 뉴런 ROS의 축적, 리포 푸신 과립, 염색질 초점의 형성, 활성화 pJNK 및 p53과 / P21 경로, 콜레스테롤 감소를 포함한, 생체 내에서 노화의 전형적인 특징의 본 많은, 그리고 장기 배양 칼슘 채널의 밀도를 변화시키고 14 NMDA 수용체. 따라서, 쥐의 해마 신경 세포의 젊은이와 노인 문화 칼슘 이미징 실험은 노화 뇌의 칼슘 리모델링의 새로운 통찰력을 제공 할 수있다. 배양 hippoca위한 중요 조건장기적 mpal 뉴런 두 배이다. 먼저, 상기 한 바와 같이 매우 낮은 밀도로 세포를 플레이트에 중요하다. 둘째, 세포 배지를 변경하지 않고 첨가로 Neurobasal 배지에서 배양된다. 이 접근법은 신경교하지만 그들의 지나치게 성장을 회피의 존재를 허용한다. 이러한 문화에 대한 회로도는 그림 1에 표시됩니다.
합성 칼슘 프로브와 형광 영상이 세포질의 모니터링을 할 수 있습니다 [칼슘] 개별 뉴런 19. 젊은 나이 뉴런이 방법의 사용은 문화의 시대와 응답의 변화를 모니터링 할 수 있습니다. 예를 들어 그림 2는 전형적인 밝은 필드와 [칼슘 2 +] CYT 세 문화에서 젊은 뉴런과 뉴런에서 NMDA에 의해 유도의 증가 칼슘 이미지를 보여줍니다. 세 뉴런의 반응은 젊은 신경 세포보다 훨씬 큰 것을 알 수 있습니다. 그러나,이 절차는 [CA의 신뢰할 수 없습니다 2+] [칼슘 2 +] mM의 레벨 이상으로 μm의 아래에서 다를 수 있습니다 예, 미토콘드리아, 용 등의 세포 내 소기관 내에서 측정. 이러한 경우에, 단백질 계, 미토콘드리아 타겟팅 프로브는, 예를 들면, 쿼린로서 개발되어왔다. 칼슘에 대한 친화도가 미세하게 각각 매우 낮거나 매우 높은 [칼슘] 사람이 휴식에 미토콘드리아 내부에 도달하고 자극과 같은 조건을 모니터링하기 위해 조정 할 수 있기 때문에이 프로브는 특히 흥미 롭다. 구체적으로는 야생형 쿼린 또는 CA없이 돌연변이 쿼린 2+ 친화력을 수정 결합 부위를 선택하는 것이 가능하다. 다른 coelenterazines (야생형, H, N)이 서로 다른 aequorins (17)와 조합하여 사용하면 미세 조정이 달성된다. 칼슘 이미징 형광의 사용이 널리 퍼져있는 반면 그러나, 생물 발광을 모니터링하는 것은 간단하지 않습니다 및 광자 계수 카메라가 필요할 수 있습니다. 다행히, 쿼린프로브는, 여기에 사용 된 것과 같이, 공동으로 표현하기 위해 개선 된 GFP 18 개의 광을 방출 할 수 그들을 더 안정 만들고 GFP 관련 형광에 의해 형질 전환 된 세포의 간단한 식별을 허용. 뉴런 생물 발광 이미징에 성공 사용 광자 카운팅 카메라의 효율뿐만 아니라 미토콘드리아 타겟팅 프로브의 형질의 효율뿐만 아니라 좌우된다. 해마의 신경 세포의 경우, 단순한 화학적 형질 고감도 광자 카운팅 카메라를 사용할 수 있음을 제공하는 작동 할 수있다. 배양 된 해마 뉴런의 시야, GFP 형광 청소년 및 노인의 생물 발광 이미지 2는 예를도. 또한 미토콘드리아의 증가가있는 표시 [칼슘 2 +] 형질 전환 된 해마 신경 세포에 기록 된 NMDA에 의해 유도. NMDA의 효과는 젊은 신경 세포에 비해 세 배양 신경 세포에 훨씬 큰 것을 알 수 있습니다. 다른 경우에, 효율의 transfec기 바이러스 유래의 벡터 (16, 18)를 사용하여 증가 될 수있다. 또한, 단백질 기반의 세포 내 칼슘 이온 프로브를 숨겨 형질 전환 마우스의 개발은 심지어 생체 내에서, 미래의 접근 방식에 대한 새로운 옵션입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
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