הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular

7.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53330

⸱

1 בדצמבר 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

במאמר זה

סיכום

עיצוב מחדש של Ca²⁺ תוך תאי בהזדקנות עשוי לתרום לאקסיטוטוקסיות ולנזק לנוירונים, תהליכים המתווכים על ידי עומס יתר של Ca²⁺. מטרתנו הייתה לחקור שיפוץ Ca²⁺ במוח המזדקן באמצעות הדמיה פלואורסצנטית וביו-לומינסנציה של Ca²⁺ ציטוזולי ומיטוכונדריאלי בתרביות ארוכות טווח של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות, מודל של הזדקנות עצבית.

תקציר

רגישות למוות של תאי עצב הקשורים לניוון של מערכת עצבים ואיסכמיה גדלה מאוד במוח בגיל אבל מנגנונים אחראים ידועים קשה. הפעלת יתר רעילה, תהליך האמין לתרום לניזק הנגרם על ידי תא עצב שני העלבונות, מתווכת על ידי הפעלה של קולטני גלוטמט שמקדם Ca ^{2 +} זרם ועומס Ca ^{2 +} המיטוכונדריה. שינוי מהותי בCa ^{2 +} הומאוסטזיס או שיפוץ תאיים של הומאוסטזיס Ca ^{2 +} תאיים עשוי להעדיף נזק נוירון בנוירונים ישנים. לחקירת שיפוץ Ca ^{2 +} בהזדקנות השתמשנו הדמיה תא חי בתרבויות ארוכת טווח של תאי עצב בהיפוקמפוס העכברוש שדומות בכמה היבטים בגילי נוירונים in vivo. לשם כך, תאים בהיפוקמפוס הם, במקום הראשון, התפזרו טרי מhippocampi החולדה נולדה חדשה ומצופה על coverslips מצופה, זכוכית Poli-D ליזין. אז תרבויות נשמרות בתקשורת מבוקרת במשך כמה ימים או כמה weeks לחקירת נוירונים צעירים וזקנים, בהתאמה. שנית, נוירונים בתרבית נטענים עם fura2 ונתונים למדידות של ריכוז Ca ^{2 +} cytosolic באמצעות הדמיה יחס הקרינה דיגיטלית. שלישית, נוירונים בתרבית הם transfected עם פלסמידים להביע טנדם של aequorin נמוכה הזיקה וGFP הממוקד למיטוכונדריה. לאחר 24 שעות, aequorin בתוך תאים מחדש עם coelenterazine ונוירונים חשופים להדמית פליטת אור לניטור של ריכוז Ca ^{2 +} המיטוכונדריה. הליך בן שלושת שלבים זה מאפשר הניטור של cytosolic ותגובות Ca ^{2 +} המיטוכונדריה לגירויים רלוונטיים כמו למשל אגוניסט קולטן גלוטמט NMDA ולהשוות בין תגובות אלה ואחרים מושפעות הזדקנות. הליך זה עשוי להניב תובנות חדשות באשר לאופן הזדקנות cytosolic השפעה ותגובות המיטוכונדריה Ca ^{2 +} לגירויים שנבחרו, כמו גם הבדיקות של תרופות שנבחרו נועדו למנוע תא עצבמוות במחלות הקשורות לגיל.

מבוא

הפעלת יתר רעילה היא אחד המנגנונים החשובים ביותר שתרמו לנזק עצבי ומוות של תאים בעלבונות נוירולוגיות כגון איסכמיה, ובחלק ממחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר ^1. סוג זה של רעילויות בעיקר בתיווכו של משחק גלוטמט על Ca ^{2 +,} קולטני -permeable ionotropic NMDA (NMDAR) ^2. חשיפה של נוירונים בתרבית לגלוטמט יכולה להוביל להפעלת יתר רעילה ^3, מה שגורם לאפופטוזיס העצבי ^4. אנו ואחרים דיווחו בעבר כי פגיעות עצביות לאפופטוזיס מושרה NMDA יכולות להשתנות עם התפתחות במבחנה והזדקנות ^5-8.

זה מקובל שעלייה בריכוז Ca ....