Abstract
רגישות למוות של תאי עצב הקשורים לניוון של מערכת עצבים ואיסכמיה גדלה מאוד במוח בגיל אבל מנגנונים אחראים ידועים קשה. הפעלת יתר רעילה, תהליך האמין לתרום לניזק הנגרם על ידי תא עצב שני העלבונות, מתווכת על ידי הפעלה של קולטני גלוטמט שמקדם Ca 2 + זרם ועומס Ca 2 + המיטוכונדריה. שינוי מהותי בCa 2 + הומאוסטזיס או שיפוץ תאיים של הומאוסטזיס Ca 2 + תאיים עשוי להעדיף נזק נוירון בנוירונים ישנים. לחקירת שיפוץ Ca 2 + בהזדקנות השתמשנו הדמיה תא חי בתרבויות ארוכת טווח של תאי עצב בהיפוקמפוס העכברוש שדומות בכמה היבטים בגילי נוירונים in vivo. לשם כך, תאים בהיפוקמפוס הם, במקום הראשון, התפזרו טרי מhippocampi החולדה נולדה חדשה ומצופה על coverslips מצופה, זכוכית Poli-D ליזין. אז תרבויות נשמרות בתקשורת מבוקרת במשך כמה ימים או כמה weeks לחקירת נוירונים צעירים וזקנים, בהתאמה. שנית, נוירונים בתרבית נטענים עם fura2 ונתונים למדידות של ריכוז Ca 2 + cytosolic באמצעות הדמיה יחס הקרינה דיגיטלית. שלישית, נוירונים בתרבית הם transfected עם פלסמידים להביע טנדם של aequorin נמוכה הזיקה וGFP הממוקד למיטוכונדריה. לאחר 24 שעות, aequorin בתוך תאים מחדש עם coelenterazine ונוירונים חשופים להדמית פליטת אור לניטור של ריכוז Ca 2 + המיטוכונדריה. הליך בן שלושת שלבים זה מאפשר הניטור של cytosolic ותגובות Ca 2 + המיטוכונדריה לגירויים רלוונטיים כמו למשל אגוניסט קולטן גלוטמט NMDA ולהשוות בין תגובות אלה ואחרים מושפעות הזדקנות. הליך זה עשוי להניב תובנות חדשות באשר לאופן הזדקנות cytosolic השפעה ותגובות המיטוכונדריה Ca 2 + לגירויים שנבחרו, כמו גם הבדיקות של תרופות שנבחרו נועדו למנוע תא עצבמוות במחלות הקשורות לגיל.
Introduction
הפעלת יתר רעילה היא אחד המנגנונים החשובים ביותר שתרמו לנזק עצבי ומוות של תאים בעלבונות נוירולוגיות כגון איסכמיה, ובחלק ממחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר 1. סוג זה של רעילויות בעיקר בתיווכו של משחק גלוטמט על Ca 2 +, קולטני -permeable ionotropic NMDA (NMDAR) 2. חשיפה של נוירונים בתרבית לגלוטמט יכולה להוביל להפעלת יתר רעילה 3, מה שגורם לאפופטוזיס העצבי 4. אנו ואחרים דיווחו בעבר כי פגיעות עצביות לאפופטוזיס מושרה NMDA יכולות להשתנות עם התפתחות במבחנה והזדקנות 5-8.
זה מקובל שעלייה בריכוז Ca ללא cytosolic 2 + (CYT [Ca 2 +]) מובילה להפעלת תאים. עם זאת, אם עלייה זו היא גבוהה מדי ו / או ספג מספיק, זה יכול לגרום לתא מוות 9. יתר על כן, זה כבר הציעהפעלת יתר רעילה שדורשת Ca 2 + 10 המיטוכונדריה ספיגה, מאז טיפול נוירונים עם נוירונים uncoupler המיטוכונדריה מוגנים מפני מוות של תאים הנגרם גלוטמט 11. אם מיטוכונדריה תופסת הרבה יותר מדי Ca 2 +, הפתיחה הנקבובית מעבר חדירות המיטוכונדריה עלולה להתרחש, שהובילה לשחרורו של ציטוכרום C וגורמים פרו-אפופטוטיים אחרים, ואפופטוזיס התרמה. לאחרונה הראה כי ספיגת Ca 2 + המיטוכונדריה זה קשור באופן ישיר לרגישות תלוית גיל להפעלת יתר רעיל, על ידי מדידה ישירה Ca 2 + ספיגה מושרה NMDA המיטוכונדריה בתאי עצב בהיפוקמפוס יחיד 5, שיטה שבה מדווחת במאמר זה. ההיפוקמפוס, מעורב בתהליכים פיסיולוגיים כגון למידה, זיכרון ותהליכים קוגניטיביים אחרים 12, הוא פגיע מאוד להזדקנות והפרעות ניווניות 13. זה כבר הציע, לאחר מספר שבועות במבחנה, בתרביתנוירונים בהיפוקמפוס להראות מספר המאפיינים הטיפוסיים של נוירונים בגיל 14. בהתאם לכך, תאי עצב בהיפוקמפוס תרבותיים ארוך טווח עשוי לספק מודל מקיף כדי לחקור Ca 2 + מנגנוני תיווך של הפעלת יתר רעילה משופר בהזדקנות.
המטרה הכוללת של השיטה שהוצגה היא, אפוא, לחקור שינויים מהותיים בCa 2 + הומאוסטזיס תאיים או שיפוץ Ca 2 + במוח המזדקן כולל תגובות ההפרש Ca 2 + שהושרו על ידי אגוניסטים הקולטן NMDA בנוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים לטווח ארוך . השיטה כוללת תיאור מפורט של התרבות של תאי עצב בהיפוקמפוס חולדה והניטור של 2 + ריכוזי Ca cytosolic והמיטוכונדריה על ידי הקרינה והדמיה פליטת אור בנוירונים בודדים, בהתאמה. הדמיה הקרינה של 2 + Ca cytosolic בנוירונים בתרבית היא הליך סטנדרטי. עם זאת, שיטה זו היא פחות אמינה למשנההסלולרי Ca 2 + מדידות כוללים Ca 2 + המיטוכונדריה. סיבות לכך כוללות חוסר המיקוד הנכון של בדיקות סינתטיות וזיקה הולמת לCa 2 + ריכוזים שעשויות לשנות במיטוכונדריה מרמת מיקרומטר הנמוכה אפילו לרמת מ"מ. השימוש בבדיקות 2 + Ca מבוססים על חלבונים כלaequorin למשל, אפשרו מיקוד לאברונים subcellular ושימוש בנגזרים שונים Ca 2 + זיקות באמצעות coelenterazines שונה או בדיקות שעברו מוטציה חסרת Ca 2 + אתרי קישור ספציפי 15. בדרך זו, הדמיה פליטת אור של תאים לבטא aequorin-ממוקד מיטוכונדריה עשויה לאפשר הניטור של Ca 2 + ריכוזים של המיטוכונדריה בתאי עצב בודד. עם זאת, הליך זה עשוי לדרוש שימוש במצלמות ספירת פוטון או מצלמות CCD רגישות להדמיה פליטת אור 16-18. שיטה זו עשויה להניב תוצאות רומן שצריך להיות מאושרת יותר establמודלים ished הזדקנות המוח כמו, למשל, פרוסות מוח מבעלי חיים ישנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאים בעלי חיים טופלו בפרוטוקולים שאושרו על ידי מתקן דיור בעלי החיים האוניברסיטה ויאדוליד בהסכם עם האמנה האירופית 123 / מועצת אירופה והוראה 86/609 / EEC.
1. תרבות קצרה וארוך-טווח של עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס
- הכנת poly-D- ליזין מצופה, 12 coverslips מ"מ זכוכית.
- לעקר coverslips זכוכית קוטר 12 מ"מ באתנול לפחות 24 שעות. לאפשר להם להתייבש בתנאים סטריליים.
- להפיץ את coverslips על רצועת parafilm בצלחת פטרי. מכסה את פני השטח של כל coverslip עם 200 μl של 1 מ"ג / פולי-D ליזין מיליליטר. לאפשר טיפול O / N.
- למחרת לשטוף את coverslips עם מים מזוקקים פעמיים סטריליים כל 15 דקות למשך 90 דקות בתנאים סטריליים.
- מלא ארבעה-גם צלחת multidish עם 500 μl של Neurobasal תרבות בינוני בכל טוב. Neurobasal תרבות בינוני צריך להיות בתוספת10% בסרום שור עוברי, B27 2%, 1 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין וL- גלוטמין 2 מ"מ.
- מניחים את coverslips בצלחת multidish. לשמור אותם בCO 37 המעלות צלזיוס, 5% 2 חממת humidified עד לשימוש.
- בידוד של תאי עצב בהיפוקמפוס של חולדות בילוד.
- הכן 1.8 מיליליטר פתרון פפאין (שנרכש ישירות) בבקבוקון (20 μl / מיליליטר) בתנאים סטריליים: כדי להשיג ריכוז סופי של 20 μl / מ"ל להוסיף כ -40 פפאין μl ב1.8 מיליליטר האנק של תוספת 0.6 BSA% (יש לחשב μl בהתאם לתנאי הספק). BSA 0.6% של האנק הוא מוכן על ידי ערבוב 85 מיליליטר של מדיום HBSS עם 15 מיליליטר של אלבומין 4% בסרום שור (BSA, שהוכן על פתרון 4 גרם של BSA ב100 מיליליטר HBSS). להכין אותו במכסת מנוע סטרילית.
- דגירה פפאין בהאנק של תוספת 0.6% BSA למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
- הכן בינוני F-12 של בשר חזיר על ידי הוספה של Dulbeccoהשתנה האבקה בינונית של הנשר (13.5 גר 'לכל ליטר) ב900 מיליליטר של מים מזוקקים פעמיים סטריליים. ואז להוסיף 6 HEPES גרם ו 336 מ"ג NaHCO 3 ולהתאים את ה- pH ל 7.42 באמצעות נ 'NaOH 4 מוסיף מים סטריליים כדי להשיג פתרון 1 ליטר ולסנן אותו באמצעות polyethersulfone 0.20 מיקרומטר (PES) בקבוק מסנן עליון. לבצע תהליך זה במנדף סטרילי. לבסוף להרוות את הפתרון עם CO 2 בתנאים סטריליים לפני השימוש. פתרונות חנות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בם מצוננים.
- להרדים גורי חולדה יילוד (P0) על ידי עריפת ראש ולשטוף את הראש במדיום HBS סטרילי. פתח את הגולגולת בעזרת המספריים סטרילי. חלץ את המוח עם מרית ולשטוף אותה במהירות במדיום של בשר חזיר F-12.
- לעשות חתך אלכסוני בסיוע אזמל בכל חצי הכדור (איור 1), ולשאת אותו לצלחת פטרי המכילה בינוני של בשר חזיר F-12.
- קרומי המוח בטל בזהירות בעזרת מלקחיים לנתיחה ותחת זכוכית מגדלת. <li> זהה את ההיפוקמפוס במיקום אופייני קעור מעל הקליפה באמצעות זכוכית מגדלת. לאחר מכן, להפריד את ההיפוקמפוס מהקליפה על ידי משיכת בזהירות מגבול אחד ולהסיר אותו מתפקידו באמצעות מספריים העין.
- להעביר את הרקמה בהיפוקמפוס לצלחת 4 היטב מלאה הבינוני של האנק סטרילי חסר Ca 2 + וMg 2 + בתוספת 0.6% BSA ולשטוף רקמות בהיפוקמפוס. מבלי להסיר את התקשורת לחתוך את הרקמה בחתיכות קטנות (סביב 2 x 2 מ"מ) תוך שימוש באותו המספריים העין.
- העבר את החתיכות בהיפוקמפוס לבקבוקון המכיל 1.8 מיליליטר פתרון פפאין מסונן מראש. אז דגירה אותם 37 המעלות צלזיוס עם רעד מדי פעם, עדין. 15 דקות מאוחר יותר, להוסיף 90 μl של DNase אני פתרון (50 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) ודגירה במשך 15 דקות נוספות.
- העברת הרקמה לצינור צנטריפוגות 10 מ"ל ולשטוף את שברים עם טרי Neurobasal תרבות בינוני. להשיג השעיה תא על ידי העברת שברי רקמות באמצעות PIP פלסטיק 5 מיליליטרette.
- השעיה תא צנטריפוגה ב 160 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant בעזרת פיפטה פסטר סטרילי פלסטיק ולהשעות גלולה בזהירות עם 1 מיליליטר האוטומטי פיפטה ב 1 מיליליטר של Neurobasal תרבות בינוני.
- למדוד צפיפות תאים באמצעות תא ספירת נויבאואר. שים coverslip הזכוכית מעל תא נויבאואר. הוסף 10 μl של השעיה תא. ודא ההשעיה התא נכנסה לתא באופן אחיד ולא עשה כל בועות. לספור את מספר התאים מתחת למיקרוסקופ ולבצע חישובים מקביל להשיג ירידה מתאימה של 40-80 μl המכיל 30 x 10 3 תאים. המספר הכולל של תאים יהיה תלוי במספר בעלי החיים המשמשים.
- על צלחת ארבעה היטב multidish המכילה 500 μl של Neurobasal תרבות בינוני מוכן לפני והמשיך בחממה, הצלחת סביב 30 x 10 3 תאים בירידה של כ -50 μl לכלגם של צלחת multidish מכילה אחד פולי-D ליזין מצופה, coverslip זכוכית קוטר 12 מ"מ.
- שמור על תאים בהיפוקמפוס עיקריים בCO 2 באינקובטור humidified 37 מעלות צלזיוס, 5% במשך 2-5 ימים במבחנה (DIV, קצר-טווח, תרבויות צעירות) או> 15 DIV (לטווח ארוך, תרבויות גיל) לפני ניסויים מבלי לשנות את התרבות כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת.
2. דימות פלואורסצנטי של Cytosolic Ca 2 + ריכוז
- הכנה של פתרונות בדיקת הדמיה הקרינה.
- הכן פתרון חיצוני שנאגר מלוח HEPES (HBS) המכיל, במ"מ: 145 NaCl, KCl 5, MgCl 2 1, 2 CaCl 1, גלוקוז 10, נתרן-HEPES 10 (pH 7.42).
- הכן פתרון -חינם חיצוני, Mg 2 +, מלח HEPES שנאגר (HBS) המכיל, במ"מ: 146 NaCl, KCl 5, CaCl 2 1, גלוקוז 10 וHEPES 10 (pH 7.42).
- לפתור מלוח NMDA ב-חינם Mg 2 +, HEPES שנאגר (HBS) בFINAריכוז l של 100 מיקרומטר ולהשלים אותו עם 10 מיקרומטר גליצין.
- הכן פתרון HBS המכיל KCl במקום NaCl על ידי פתרון (מ"מ): 145 KCl, MgCl 2 1, 2 CaCl 1, גלוקוז 10 ו -10 HEPES (pH 7.42).
- טעינה של תאים בהיפוקמפוס עם fura2 / AM בדיקה סידן ניאון.
- קח את תרבות התא המכילה coverslips את החממה ולשטוף אותם עם מדיום HBS ב RT על ידי העברת לארבעה-גם צלחת multidish חדשה המכילה 500 μl של HBS לכל טוב.
- דגירה תאים עם fura2 / AM 4 מיקרומטר (שהוכן באותו המדיום HBS) במשך 60 דקות ב RT (25 מעלות צלזיוס) במקום חשוך.
- לאחר 60 דקות, לשטוף coverslips עם מדיום HBS טרי.
- תמונות הקלטת הקרינה של cytosolic [Ca 2 +] בתאים בתרבית.
- מדליק את המנורה, מיקרוסקופ, מערכת זלוף, המצלמה הקרינה ומחשב.
- מניחים את coverslips בפלטפורמת thermostated ל12 coverslips מ"מ זכוכית הפתוח על הבמה של מיקרוסקופ ההפוך ובחר שדה מיקרוסקופי באמצעות מטרת 40X (שמן, NA: 1.3). Perfuse תאים ברציפות עם מדיום HBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בהעדר או נוכחות של חומרי בדיקה. לשמור על הזרימה בשיעור של כ 5-10 מיליליטר / דקה.
הערה: מערכת זלוף סלולארי לתאי חיים היא רכובה בפלטפורמת thermostated לcoverslips מ"מ זכוכית הפתוחה 12. 8-קווי מערכת זלוף מונע כובד מצויד בשסתום בקר משמש לינקבו את הפתרונות. משאבת ואקום אחראית להסרת כל מדיום עודף. פתרונות מחוממים באמצעות מערכת חימום בצינור. - ללכוד תמונת רקע עם הצמצם סגור בשני אורכי גל העירור.
- Epi-להאיר תאים לסירוגין ב 340 ו 380 ננומטר. שיא אור הנפלט ב520 ננומטר כל שניות 5-10 עם מצלמה הקרינה, אשר מסוננת על ידי מראה dichroic פורע-2.
- כאשר תקופת ההקלטה נגמרה, לאחסן o הרצף המלאהתמונות ו נפלטות ב520 ננומטר במחשב לניתוח נוסף.
- ניתוח של תמונות ניאון נרשמו.
- פתח את קובץ הניסוי. שימוש בתוכנת aquacosmos, לחץ על "יחס" ובחר את טווח היחס הרצוי. לחשב את פיקסל על ידי יחס פיקסל בתמונות וכתוצאה מכך על מנת לקבל רצף של תמונות יחס.
- לחסר רקע על ידי התאמת 'חיסול הרקע ". "חישוב התחל" לחץ.
- לחץ על "כל הפעמים רצף 'כפתור ולמחוק את האזורים העתיקים של עניין (ROIs). לניתוח כמותי של תאים בודדים, להקים אזורים החדשים של ריבית או ROIs המתאים לנוירונים בודדים. כל ערכי היחס הממוצע בכל פיקסל המתאים לכל החזר על השקעה וכל תמונה כדי להשיג הקלטה של ערכי הקרינה יחס לROIs בודדת (תאים).
- גרף ההקלטות בודדות לייצא את ערכי הקרינה היחס המתאימים לכל החזר על השקעה לprogr גרפיםאני.
- הפוך את החישובים המקביל להערכת הגודל של העליות בfluorescences יחס בתגובה לכל גירוי באמצעות ניתוח נתונים מתאים וגרפי תוכנה.
3. פליטת אור הדמיה של מיטוכונדריאלי Ca 2 + ריכוז
- Transfection של תאי עצב בהיפוקמפוס תרבותיים עם פלסמיד mitGAmut.
הערה: תאים transfected ראשון עם פלסמיד mitGAmut מכיל רצף ממוקד מיטוכונדריה וaequorin מוטציה חסרת אתר קישור Ca 2 + התמזג החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בנייה זו מזהה עלייה גדולה בספיגת Ca 2 + המיטוכונדריה ומאפשרת זיהוי של תאי transfected על ידי הקרינה GFP. פלסמיד פותח וסופק באדיבות על ידי פ 'Brûlet ועמיתים לעבודה 18 (CNRS, פריס).- הכן Neurobasal TF, המכיל Neurobasal תרבות בינוני, חסר בסרום שור עוברי, B27, gentamicובL- גלוטמין 2 מ"מ.
- הכן 50 μl של Neurobasal TF בתוספת 2.5 מגיב transfection μl בבקבוקון (פתרון). הכן 50 μl של TF Neurobasal בתוספת 4 מיקרוגרם mitGAmut פלסמיד בבקבוקון (פתרון B). להוסיף בעדינות הפתרון B מעל א פתרון אפשר ערבוב במשך 20 דקות, בלי ללחוץ.
- העבר את coverslips המכיל תאי עצב בהיפוקמפוס לצלחות multidish חדשות המכילות 200 μl של TF Neurobasal הטרי.
- הוסף טיפה אחרת טיפה של פתרון B + 100 μl על כל coverslip. דגירה למשך 30 דקות. הסר את המדיום. שטפי פעם עם תאי TF Neurobasal הטרי. להחזיר את coverslips למקור Neurobasal התרבות בינוני.
- נוירונים תרבות ל24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לאחר transfection כדי לאפשר ביטוי יעיל ומיקוד של החללית.
- הכנה של פתרונות בדיקת הדמיה פליטת אור.
- הכן את פתרונות HBS מכילים NMDA 100 מיקרומטר או 145 מ"מ KCl כלעיל (שלב 2.1). הכן פתרון HBS המכיל 10 מ"מ Ca 2 + תוספת digitonin 100 מיקרומטר.
- הכינון מחדש של aequorin-ממוקד מיטוכונדריה עם n coelenterazine.
- coverslips העברה המכיל תאי עצב בהיפוקמפוס transfected לצלחת ארבעה-היטב המכילה 200 μl של HBS.
- הוסף 4 μl של n coelenterazine (200 מיקרומטר) 200 μl של HBS לריכוז סופי של 4 מיקרומטר ומערבבים בעדינות. דגירה עבור שעה 2 ב RT (25 מעלות צלזיוס) ובחושך.
- תמונות הקלטת פליטת אור של המיטוכונדריה [Ca 2 +].
- הפעל מיקרוסקופ, המנורה, מערכת זלוף, מצלמה פליטת אור והמחשב.
- העבר את coverslips מחדש לתא זלוף thermostated (37 מעלות צלזיוס) ותנקב ברציפות עם פתרון HBS מראש חימם בשיעור של 5-10 מיליליטר / דקה.
- באמצעות מטרת 40X (שמן, NA: 1.3), בחר שדה מיקרוסקופי המכיל תאים המבטאים אתpoaequorins כפי שמוצג על ידי פליטת הקרינה קשורה בביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באמצעות מסנני FITC. שדה טיפוסי עשוי להכיל 1-2 תאי transfected. ללכוד את תמונת הקרינה GFP, באמצעות מצלמת CCD.
- כבה את אור מיקרוסקופ. הסר את התיבה המכיל dichroic ממוקמת בנתיב האור. לכבות את אור העירור ולסגור את התיבה הכהה לחושך מוחלט.
- Perfuse תאים ב5-10 מיליליטר / דקה עם מדיום HBS עם או בלי פתרונות בדיקה מחוממים מראש על 37 מעלות צלזיוס.
- צלם תמונות פליטת פוטונים בכל שנייה 10 עם מצלמה פוטון ספירה טיפלה עם מעבד תמונה.
- בסופו של כל ניסוי, permeabilize תאים עם 0.1 מ"מ digitonin ב 10 מ"מ CaCl 2 בהרוורד כדי לשחרר את כל פליטת פוטונים שנותרה.
הערה: פליטת פוטונים אלה יש להוסיף את כדי להעריך את פליטת פוטונים הכוללת, ערך הדרוש לכיול בCa 2 + ריכוזים <./ Li> - תמונות פליטת אור חנות במחשב עם תמונת הקרינה GFP קשורה נתפסו לפני ההדמיה ספירת פוטון.
- ניתוח של תמונות פליטת אור המשקפות המיטוכונדריה [Ca 2 +].
- לכמת את פליטת פוטונים באמצעות תוכנה ספציפית. ניתן להמיר את פליטת פוטונים לCa החופשי המיטוכונדריה 2 + ריכוז (MIT [Ca 2 +]) באמצעות האלגוריתם שתואר על ידי et al Brini. 15.
- פתח את הניסוי ותמונת הקרינה GFP. אזורי בחירה של עניין (ROIs) בעזרת תוכנה ספציפית על ידי ציור הצורה של תאי transfected על פי תמונות הקרינה שנתפסו בתחילת הניסוי.
- הדבק את אותו ROIs על כל תמונה. פליטה פוטוניים הכוללת בכל החזר על השקעה מחושבת עם תוכנה ספציפית כדי להשיג את ערך פליטת הארה (L) לכל תא בכל נקודה בזמן.
- הוסף את כל emiss פוטונייםיונים בתמונות פליטת אור, כוללים אלה המתקבלים לאחר digitonin permeabilization, באמצעות התוכנה הספציפית, כדי לקבל תמונת פליטת אור המכילה את כל פליטת פוטונים.
- ערכי יצוא של פליטת פוטונים לכל אזור של עניין לתוכנה ספציפית לחישובים. כדי לעשות זאת, לחץ על "גרף" על מנת לחשב את ערכי פליטת אור לכל החזר על השקעה בכל פעם. בחירה 'שווי כולל' ו 'להשתמש ROI הנוכחי לכל התמונות. 'המחשבון' לחץ. שמור את 'txt.file' ונתוני יצוא לגיליון עבודה. לכל החזר על השקעה, [Ca 2 +] mit מחושב באמצעות האלגוריתם הבא:
[Ca 2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)];
אֵיפֹה,
R = [L / (λ L סך הכל)] 1 / n
L הוא הארה הנפלטת בעת מדידה בכל אזור של עניין.
סך L הואהארה הכוללת שנותרה לאחר תוספת של הספירה הנוכחית ברקמה באותו הזמן בעת המדידה עבור כל אזור של עניין. λ, K TR, K R וn הם קבועים שערכיה תלויים בשילוב של aequorin (סוג בר או מוטציה) וcoelenterazin משמשים (סוג בר או סוג n), כמו גם את הקלטת הטמפרטורה 16. לשילוב משמש כאן (מוטציה AEQ וn coelenterzine), על 37 מעלות צלזיוס, השתמשנו בערכים הבאים: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165.6 x 10 3, n = 1,204 λ = 0138 ו.
- הפוך את החישובים המקביל להערכת הגודל של העליות בפליטת אור בתגובה לכל גירוי באמצעות ניתוח נתונים מתאים וגרפי תוכנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה להעריך שיפוץ Ca 2 + ואת ההשפעות של NMDA בcytosolic והמיטוכונדריה [Ca 2 +] בתאי עצב בגיל. איור 1 מציג את סכמטי של הליך הבידוד וculturing תאי עצב בהיפוקמפוס של חולדות בילוד. לפני שמתחיל, אנחנו צריכים להכין coverslips סטרילי, פולי-D ליזין המצופה, זכוכית ולאתר אותם בצלחת 4-היטב. לאחר מכן, חולדות בילוד נהרגות והסיר את המוח. לאחר בידוד היפוקמפוס, רקמה מפוזרת בזהירות באמצעות פפאין. תאים מבודדים נשטפים ומצופים על coverslips המצופה. אז תאים בתרבית במשך 2-5 DIV או> 15 DIV לקבל תרבויות צעירות או זקנות, בהתאמה, ומשמש לCa 2 + ניסויי הדמיה.
שימוש באסטרטגיה לעיל, ניתן לי נוירונים צעירים ומבוגרים מאותה הדגימה לבדיקה, לדוגמא, אם NMDA גורם השפעות ההפרש בcytosolic [Ca 2 +] בcultu הצעירהמיל מאשר בתרבויות מבוגרות. איור 2 מראה כי NMDA 100 מיקרומטר גורם עליות גדולות יותר בcytosolic [Ca 2 +] בתרבויות מבוגרות יותר מאשר בתרבויות צעירות. כמו כן, NMDA גורם מוות של תאים בתאי עצב ישנים אך לא בתאי עצב צעירים 5. במקרים שבם תגובות Ca 2 + הן גבוהות מאוד, יכולים להתבצע ניסויים דומים עם Ca 2 + בדיקות עם פחות זיקה לCa 2 + כדי למנוע הרוויה צבע כמו, למשל fura4F 5. באותו אופן, אפשר גם ללמוד אם רמות מנוחה של cytosolic [Ca 2 +] שונות. יתר על כן, שילוב של פרוטוקול זה עם immunofluorescence כמותי באמצעות נוגדנים ספציפיים ליחידות משנת NMDAR עשוי לאפשר שינויים לתאם בהיענות עם הבדלים בביטוי של תת-יחידות הקולטן NMDA ובלבד שנוגדנים ספציפיים זמינים 5. מדידות של cytosolic ניתן להשתמש [Ca 2 +] גם להערכת paramete הרלוונטי אחרRS כולל תוכן החנות 2 + Ca,, Ca 2 + שיעורי פינוי נחים חדירות לCa 2 + וההבדלים האפשריים בין הנוירונים שלהם צעירים ובנים.
באופן דומה, אפשר גם לבחון את ההשפעות של גירויים כגון על המיטוכונדריה [Ca 2 +]. איור 3 מציג דוגמא של הדמיה פליטת אור של תאי עצב בהיפוקמפוס transfected עם aequorin-ממוקד מיטוכונדריה. שחרורו של פליטת פוטונים לאחר הגירוי הוא פונקציה של העלייה בהמיטוכונדריה [Ca 2 +] הושג. שים לב שעלייה מושרה NMDA בהמיטוכונדריה [Ca 2 +] הם הרבה יותר גדול בתאי עצב בגילים מאשר בתאי עצב בהיפוקמפוס צעירים, שבו NMDA בקושי מגביר את פליטת פוטונים. תוצאות אלו עשויות לתרום לנמק מדוע NMDA גורם למות תאים רק בתאי עצב בגיל אבל לא בתרבויות צעירות של תאים בהיפוקמפוס 5. באותו אופן, ניתן לבחון הבדלים נוספים בהמיטוכונדריהCa 2 + טיפול בין נוירונים צעירים וגילים באמצעות פרוטוקולים שתוכננו במיוחד כדי לבדוק, למשל, Ca 2 + יציאה ממיטוכונדריה, Ca 2 + ספיגה של המיטוכונדריה בתאי עצב permeabilized וספיגת Ca 2 + המיטוכונדריה הנגרמים על ידי שחרור Ca 2 + מחנויות תאיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות המשפיעות על עומס Ca 2 + המיטוכונדריה שיכולה להיות עניין של neuroprotection נגד הפעלת יתר רעילה.
איור 1: נוהל הבידוד של תאי עצב בהיפוקמפוס עכברוש ראשי () פולי-D ליזין, coverslips זכוכית מצופה 12 מ"מ מוכן בצלחת פטרי ולבסוף הועבר לצלחת 4 היטב.. תצוגה (B) הגבי של מוח חולדה. הקו המקווקו מציין היכן לחתוך צריך להיעשות. (ג) קבלת כuspension של תאי עצב בהיפוקמפוס עיקריים. לאחר הסרת ההיפוקמפוס, השעיה תא מתקבלת. אז תאים מצופה במנות 4 גם המכילות את coverslips המצופה פולי-D ליזין. (ד) תמונה בשדה בהירה מראה נוירונים בהיפוקמפוס העכברוש עיקריים בתרבות. בר מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. NMDA מגביר cytosolic [Ca 2 +] בתאי עצב בהיפוקמפוס קצר ונוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים ארוך טווח היו עמוסים fura2 / AM ונתונים להדמית הקרינה. תמונות מראות תמונות נציג בהירות שדה וpseudocolor (F340 / F380 יחס) של טווח קצר () וארוך טווח (B 2 +] (קשקשי pseudocolor מוצגים בתחתית). עקבות להראות הקלטות של cytosolic נציג, תא בודד [Ca 2 +] בתגובה ל -100 מיקרומטר NMDA בטווח קצר () וארוך טווח (B) נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים. הערה cytosolic ש[ Ca 2 +] עליות גדולות בהרבה בטווח ארוך יותר מאשר בנוירונים בתרבית לטווח קצר. בר מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. NMDA גורם עומס Ca 2 + המיטוכונדריה בתאי עצב בהיפוקמפוס neur היפוקמפוס מתורבתתוספות היו transfected עם הזיקה נמוכה, aequorin הממוקד מיטוכונדריה התמזג GFP, מודגרות עם 4 coelenterazine מיקרומטר ונתונים להדמית פליטת אור של המיטוכונדריה [Ca 2 +]. תמונות להראות את הקרינה (GFP) ופליטה נצברה פוטוניים (פליטת אור aequorin) תמונות של נציג קצר () וארוך טווח (B) נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים. עוצמת הארה מקודדת בpseudocolor (1 עד 16 פליטת פוטונים לפיקסל). הקלטות להראות את שחרורו של פליטת פוטונים (המבוטאת המיטוכונדריה [Ca 2 +]) בטווח קצר () וארוך טווח (B) נוירונים בהיפוקמפוס תרבותיים. NMDA 100 מיקרומטר המיטוכונדריה גדלה [Ca 2 +] בתאי עצב בגיל אבל לא בתאי עצב בהיפוקמפוס תרבותיים צעירים. בר מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיפוץ של Ca 2 + הומאוסטזיס תאיים במוח המזדקן כבר קשור לאובדן הקוגניטיבי, הגדיל את הרגישות לנזק איסכמי, הפעלת יתר רעילה וניוון של מערכת עצבים. כדי לחקור את ההשערה הזאת במבחנה, נהלי ההדמיה Ca 2 + זמינים. למרבה הצער, תרבויות קיימא של נוירונים בהיפוקמפוס ישנים הן לא אמינות. לאחרונה, זה נצפה כי תרבויות ארוכת טווח של תאי עצב בהיפוקמפוס העכברוש נוכחי רבים מסימני ההיכר האופייניים להזדקנות in vivo כולל הצטברות ROS, היווצרות של גרגרי lipofuscin, מוקדי heterochromatic, הפעלה של pJNK וp53 / מסלולי p21, אובדן כולסטרול, ו משנה את הצפיפות של ערוצי 2 + Ca וNMDA קולטני 14. בהתאם לכך, ניסויי ההדמיה Ca 2 + בתרבויות צעירות וזקנות של נוירונים בהיפוקמפוס החולדה עשויים לספק תובנות חדשות של שיפוץ Ca 2 + במוח המזדקן. מצב שהוא קריטי לhippoca culturingנוירונים mpal בטווח הארוך הוא שני קיפול. ראשית, חשוב צלחת התאים בצפיפות נמוכה מאוד, כאמור לעיל. שנית, תאים בתרבית Neurobasal בינוני בתוספת מבלי לשנות את המדיום. גישה זו מאפשרת הנוכחות של גליה אבל הימנעות יתר על המידה את הצמיחה שלהם. סכמטי לתרבות כזו מוצגת באיור 1.
הדמיה הקרינה עם Ca 2 + בדיקות סינתטיות מאפשרת הניטור של cytosolic [Ca 2 +] בנוירונים בודדים 19. השימוש בגישה זו בתאי עצב צעירים וגילים מאפשר הניטור של שינויים בתגובות עם גיל בתרבות. לדוגמא איור 2 מראה שדה בהיר אופייני ותמונות 2 + Ca של העליות ב[ Ca 2 +] מושרה CYT ידי NMDA בנוירונים צעירים ונוירונים מתרבויות בגיל. שים לב שתגובות בתאי עצב בגיל הרבה יותר גדולות מאשר בתאי עצב צעירים. עם זאת, הליך זה אינו אמין ל[ Ca 2 +] מדידות בתוך אברונים subcellular כ, למשל, מיטוכונדריה, בי [Ca 2 +] עשוי להשתנות מלמטה מיקרומטר למעל לרמת מ"מ. במקרים אלה, המבוססים חלבון, בדיקות-ממוקד מיטוכונדריה פותחו כ, למשל, aequorin. בדיקה זו היא מעניינת במיוחד מאז זיקתה לCa 2 + יכולה להיות מכוונת היטב כדי לפקח על תנאים נמוכים מאוד או גבוהים מאוד [Ca 2 +] כמו אלה הגיעו בתוך המיטוכונדריה במנוחה ומגורה, בהתאמה. באופן ספציפי, זה אפשרי כדי לבחור באפשרות aequorin הסוג בר או aequorin מוטציה ללא Ca 2 + אתרי קישור כדי לשנות את הזיקה. כוונון עדין מושגת כאשר coelenterazines שונה (סוג בר, h, n) משמש בשילוב עם aequorins שונה 17. עם זאת, בעוד שהשימוש בקרינה להדמיה Ca 2 + הוא נרחבת, ניטור פליטת אור הוא לא פשוט ועשויה לדרוש מצלמות פוטון ספירה. למרבה המזל, aequorinבדיקות, כמו זה המשמש כאן, שופרו לשתף מפורש GFP 18 שהופך אותם יציבים יותר, תוכל לשחרר יותר את פליטת פוטונים ומאפשרים זיהוי פשוט של תאי transfected על ידי הקרינה GFP קשורה. הצלחה בתחום ההדמיה פליטת אור בתאי עצב תלויה לא רק ביעילות של המצלמה ספירת הפוטון משמשת אלא גם על היעילות של transfection של החללית-ממוקד מיטוכונדריה. במקרה של תאי עצב בהיפוקמפוס, transfection הכימי פשוט עשוי לעבוד בתנאים שמצלמת ספירת פוטון רגישה גבוהה זמינה. איור 2 דוגמאות מופעים של שדה בהיר, הקרינה GFP ותמונות פליטת אור של צעירים ובנים בנוירונים בהיפוקמפוס התרבות. כמו כן מוצגת הם העלייה בהמיטוכונדריה [Ca 2 +] הנגרם על ידי NMDA נרשם בתאי עצב בהיפוקמפוס transfected. שים לב כי ההשפעה של NMDA היא הרבה יותר גדולה בנוירונים בתרבית בגילים מאשר בתאי עצב צעירים. במקרים אחרים, היעילות של transfection יכול להיות מוגבר על ידי שימוש בוקטורים הנגזרים וירוס 16,18. לחלופין, הפיתוח של עכברים הטרנסגניים מחסה המבוסס על חלבונים, בדיקות subcellular Ca 2 + הוא אפשרות המתעוררות לגישות עתיד, אולי אפילו בvivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
