Abstract
Восприимчивость к гибели клеток нейрон, связанный с нейродегенерацией и ишемии чрезвычайно увеличился в возрасте мозга, но механизмы, ответственные плохо известны. Эксайтотоксичность, процесс полагают, способствует повреждению нейронов, вызванной обоих инсультов, опосредовано активацией глутаматных рецепторов, что способствует притоку Ca2 + и Ca 2+ митохондриальной перегрузки. Существенное изменение внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза или реконструкции внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза нейронов может способствовать повреждению нейронов в старых. Для исследования Са 2+ ремоделирования в процессе старения мы использовали изображений живых клеток в долгосрочных культурах гиппокампа крысы нейронов, которые напоминают в некоторых аспектах в возрасте нейроны в естественных условиях. Для этого, гиппокампа клетки, в первую очередь, недавно разошлись с новыми родился крыс гиппокампе и высевали на поли-D-лизин покрытием, покровные стекла. Затем культуры хранятся в контролируемой средах в течение нескольких дней или нескольких шEEKs для исследования молодых и старых нейронов, соответственно. Во-вторых, культивируемые нейроны загружены фура2 и подвергали измерениям цитозольном Ca 2+ концентрации с использованием цифровых изображений отношение флуоресценции. В-третьих, культивируемые нейроны трансфицировали плазмидами, выражающих тандем низкоаффинных акворина и GFP, ориентированные на митохондрии. Через 24 часа, экворин внутри клеток восстанавливают коэлентеразином и нейроны подвергали визуализации биолюминесценции для контроля митохондриальной Ca 2+ концентрации. Это три шага процедура позволяет контролировать цитозольного и митохондриальных ответов Ca 2+ в соответствующих стимулов как, например, агонист рецептора NMDA глутамата и сравнить ли эти и другие ответы влиянием старения. Эта процедура может привести к новому пониманию того, как старение влияние цитозольных и митохондриальных ответов Ca 2+ в выбранных раздражителей, а также тестирование некоторых лекарственных препаратов, направленных на предотвращение нейронов клеткисмерть в возрастных заболеваний.
Introduction
Эксайтотоксичность является одним из наиболее важных механизмов, способствующих повреждению нейронов и гибели клеток в неврологических инсультов, таких как ишемия, а в некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера 1. Этот тип нейротоксичности в основном при посредничестве глутамата, действующего на Ca 2+ -permeable, рецепторы NMDA ионотропический (NMDAR) 2. Воздействие культивируемых нейронов на глутамат может привести к эксайтотоксичности 3, который вызывает апоптоза нейронов 4. Мы и другие, ранее сообщалось, что нейронная уязвимость к апоптозу NMDA-индуцированной может измениться с развитием в пробирке и старения 5-8.
Это широко признано, что увеличение цитозольной без Ca 2+ концентрации ([Са 2+] цит) приводит к активации клеток. Однако, если этот подъем является слишком высокой и / или замедленным достаточно, это может вызвать гибель клеток 9. Кроме того, было предложеночто эксайтотоксичность требует митохондриальную Са 2+ поглощения 10, так как нейроны лечения с митохондриальной разобщающий охраняемых нейронов против индуцированной глутаматом гибели клеток 11. Если митохондрии занимают слишком много Са 2+, открытие митохондриальной проницаемости перехода поры может произойти, ведущих к выпуску цитохрома с и других про-апоптотических факторов, и индукции апоптоза. Мы недавно показали, что это митохондриальная Са 2+ поглощение непосредственно связано с возрастной зависит восприимчивость к эксайтотоксичности, путем непосредственного измерения NMDA-индуцированной митохондриальной Ca 2+ поглощение в отдельных нейронах гиппокампа 5, метод, который сообщается в этой статье. Гиппокамп, участвует в физиологических процессах, таких как обучение, память и другие когнитивные процессы 12, весьма уязвима к старению и нейродегенеративных расстройств 13. Было предложено, что после нескольких недель в пробирке, культивируемыхнейронов гиппокампа показать ряд характерных особенностей в возрасте 14 нейронов. Соответственно, долгосрочные культивированный нейронов гиппокампа может обеспечить комплексную модель для исследования Ca 2+ опосредованной механизмов повышения эксайтотоксичности в старении.
Общая цель метода, изложенного, следовательно, исследовать существенные изменения внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза Са 2+ или реконструкции в том числе старение мозга дифференциальных Ca 2+ ответов, вызванных NMDA рецепторов агонистов через долгосрочных культурных нейронов гиппокампа , Способ включает подробное описание культуры нейронов гиппокампа крысы и мониторинга цитозольных и митохондриальных концентрации Ca 2+ с помощью флуоресцентной визуализации и биолюминесценции в отдельных нейронов, соответственно. Флуоресценции визуализации цитозольными Ca 2+ в культивируемых нейронов является стандартной процедурой. Тем не менее, этот метод является менее надежным для субсотовая Са 2+ измерения, включая митохондриальной Ca 2+. Причины для этого включают в себя отсутствие адресности синтетических зондов и ненадлежащего сродством к концентрации Са 2+, которые могут изменяться в митохондриях из-за низкого уровня мкМ даже до уровня мм. Использование Ca 2+ зондами на основе белков, как, например, акворина, позволило ориентации на субклеточных органелл и использование производных различных Ca 2+ сродства с использованием различных coelenterazines или мутировавших зонды отсутствует специальное Ca 2+ сайты связывания 15. Таким образом, биолюминесценции визуализации клеток, экспрессирующих митохондрий, ориентированных экворин может позволить мониторинг митохондриальных Ca2 + концентрации в отдельных нейронов. Тем не менее, эта процедура может потребовать использования фотонных счетных камер или камер сверхчувствительных ПЗС для биолюминесценции визуализации 16-18. Этот метод может дать новые результаты, которые должны быть подтверждены более были обванного модели старения мозга, как, например, кусочки мозга от старых животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
О себе этика: Процедуры с участием животных предметы были обработаны в соответствии с протоколами, утвержденными Вальядолид университета жилья за животными в соответствии с Европейской конвенцией 123 / Совета Европы и положений директивы 86/609 / EEC.
1. краткосрочной и долгосрочной перспективе Культура гиппокампа крыс нейроны
- Подготовка поли-D-лизина с покрытием, 12 мм покровные стекло.
- Стерилизация диаметр 12 мм покровные стекла в этаноле в течение не менее 24 ч. Позвольте им сохнуть в стерильных условиях.
- Распределите покровные на полосу парафильма в чашке Петри. Покрыть поверхность каждом покровном стекле с 200 мкл 1 мг / мл поли-D-лизином. Разрешить лечения O / N.
- На следующий день мыть покровные бидистиллированной стерильной водой каждые 15 мин в течение 90 мин в стерильных условиях.
- Заполните четыре а multidish пластину с 500 мкл культуральной среды Neurobasal на лунку. Neurobasal культуральной среде должно быть дополнено10% фетальной бычьей сыворотки, 2% B27, 1 мкг / мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина.
- Поместите покровные в multidish пластины. Поддерживать их в увлажненной 37 ° С и 5% СО 2 инкубатора до использования.
- Выделение нейронов гиппокампа крыс из неонатальных.
- Приготовьте 1,8 мл папаин решение (непосредственно приобрели) во флаконе (20 мкл / мл) в стерильных условиях: Для получения конечной концентрации 20 мкл / мл добавить около 40 мкл папаина в 1,8 мл Хэнка плюс 0,6% BSA (мкл следует рассчитывать в зависимости от условий поставщиков). 0,6% БСА Хэнка получают путем смешивания 85 мл HBSS среды с 15 мл 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA, приготовленный решении 4 г BSA в 100 мл HBSS). Готовят его в стерильных капот.
- Инкубируйте папаин в Хэнкса плюс 0,6% BSA в течение 30 мин при 37 ° С перед использованием. Фильтр решение с использованием 0,22 мкм фильтр перед использованием.
- Подготовьте F-12 среду Хэма добавлением по способу ДульбеккоМодифицированной среде Игла порошок (13,5 г на л) в 900 мл бидистиллированной стерильной водой. Затем добавить 6 г HEPES и 336 мг NaHCO 3 и доведения рН до 7,42 с помощью NaOH 4 Н. добавить стерильную воду для того, чтобы получить 1 л раствора и фильтровать его с помощью полиэфирсульфон 0,20 мкм (ПЭС) бутылки верхнюю фильтр. Провести этот процесс в стерильных капот. Наконец насыщения раствора с CO 2 в стерильных условиях перед использованием. Хранить растворы при 4 ° С и использовать их охлажденным.
- Эвтаназии новорожденного (Р0) крысят путем обезглавливания и мыть голову в стерильной среде HBS. Откройте череп с помощью стерильных ножниц. Выписка мозг с помощью шпателя и промойте его быстро F-12 среде Хэма.
- Сделайте диагональный срез с помощью скальпеля в каждом полушарии (рис 1B), и носить его в чашку Петри, содержащую F-12 среду Хэма.
- Отбросить оболочек тщательно с помощью щипцов и рассечение под увеличительным стеклом. <LI> Определить гиппокамп в характерной вогнутой месте по коре, используя увеличительное стекло. Затем отделить от гиппокамп коры, потянув тщательно от одной границы и удаления его из положения с помощью глаз ножницы.
- Передача ткани гиппокампа на 4-луночного планшета, заполненной стерильности среды Хенкса хватает Са 2+ и Mg 2+ плюс 0,6% BSA и мыть ткани гиппокампа. Не снимая СМИ вырезать ткань в мелкие кусочки (примерно 2 х 2 мм), используя те же ножницы глазные.
- Перевести гиппокампа штук во флакон, содержащий 1,8 мл предварительно отфильтрованного раствора папаин. Тогда инкубировать их при 37 ° С при периодическом встряхивании, нежный. Через 15 мин, добавить 90 мкл раствора ДНКазы I (50 мкг / мл) Окончательное и инкубировать в течение 15 мин дополнительного.
- Передача ткани в 10 мл центрифужную пробирку и промыть фрагменты со свежим Neurobasal культуральной среде. Получение клеточной суспензии путем пропускания фрагментов ткани через 5 мл пластиковую PIPEtte.
- Центрифуга клеточной суспензии при 160 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант с помощью пластиковой пипетки стерильной пастеровской и тщательно приостановить гранул с 1 мл пипетки автоматизированных в 1 мл культуральной среды Neurobasal.
- Измерьте плотность клеток с помощью Счетной палаты Нейбауера. Положите стекло покровное на камеру Нойбауэра. Добавить 10 мкл клеточной суспензии. Убедитесь, что клеточная суспензия поступает в камеру равномерно и не делая никаких пузырьков. Подсчитайте количество клеток под микроскопом и выполнять соответствующие вычисления, чтобы получить подходящую капли 40-80 мкл, содержащей 30 х 10 3 клеток. Общее количество клеток будет зависеть от количества животных, используемых.
- За четыре хорошо multidish пластину, содержащую 500 мкл культуральной среды Neurobasal подготовлен до и хранится в инкубаторе, плиты около 30 х 10 3 клеток в капле около 50 мкл в каждуюа в multidish пластину, содержащую одно поли-D-лизин покрытием, диаметр 12 мм стекло покровное.
- Поддержание первичных клеток гиппокампа в увлажненной 37 ºC и 5% CO 2 инкубаторе в течение 2-5 дней в пробирке (DIV, краткосрочных, молодые культуры) или> 15 DIV (долгосрочные, в возрасте до культуры) экспериментов без изменения культуры СМИ.
2. флуоресценции изображений цитозольного Ca 2+ Концентрация
- Подготовка тестовых решений для флуоресценции.
- Подготовьте внешний HEPES-солевой буфер (ОБД) раствор, содержащий, в мм: 145 NaCl, KCl 5, MgCl 2 1, 2 1 CaCl, глюкоза, натрия 10-HEPES (рН 10) 7.42.
- Подготовка внешней, Mg 2+ -бесплатный, HEPES-солевой буфер (ОБД) раствор, содержащий, в мм: 146 NaCl, KCl 5, CaCl 2 1, глюкозы 10 и 10 HEPES (рН 7,42).
- Решите NMDA в Mg 2+ -свободных, HEPES-буферный солевой раствор (HBS) на FINAКонцентрация л 100 мкм и дополнить его с 10 мкМ глицина.
- Готовят раствор, содержащий KCl HBS вместо NaCl, решая (в мМ): KCl 145, MgCl 2 1, 2 1 CaCl, глюкозу 10 и 10 HEPES (рН 7,42).
- Загрузка клеток гиппокампа с флуоресцентного зонда кальция фура2 / АМ.
- Возьмите культуру клеток, содержащий покровные от инкубатора и промыть их HBS среде при комнатной температуре путем передачи их в новом четырехэтажном а multidish пластину, содержащую 500 мкл HBS каждую лунку.
- Инкубируйте клетки с фура2 / АМ 4 мкм (получают таким же HBS среды) в течение 60 мин при комнатной температуре (25 ° C) в темном месте.
- Через 60 мин, промыть покровные с пресной HBS среды.
- Запись флуоресцентные изображения цитозольного [Ca 2+] в культивируемых клетках.
- Включите лампы, микроскоп, системы перфузии, флуоресценции камерой и компьютером.
- Поместите покровные в термостатированном платформы дляОткрыто 12 мм покровные стекла на стадии инвертированного микроскопа и выбрать микроскопическое поле, используя цель 40X (нефть, Н. А.: 1.3). Заливать клетки непрерывно подогретого (37 ° С) HBS среды в отсутствие или в присутствии исследуемых веществ. Поддерживать поток со скоростью примерно 5-10 мл / мин.
Примечание: Система перфузии сотовый для живых клеток устанавливается в термостатированном платформы для открытых 12 мм покровные стекла. 8 линий гравитационного приводом перфузии системы, оснащенные контроллером клапана используется для перфузии растворов. Вакуумный насос отвечает за удаление избытка среды. Решения нагревают с помощью внутритрубной системы отопления. - Захват фонового изображения затвор закрыт на обеих длинах волн возбуждения.
- Эпи-осветить клетки попеременно 340 и 380 нм. Запись свет, излучаемый на длине волны 520 нм каждые 5-10 сек с флуоресцентной камеры, который фильтруют с помощью фура-2 дихроичного зеркала.
- Когда срок завершения записи, хранения полной последовательности выводаF изображения испускается при 520 нм в компьютер для дальнейшего анализа.
- Анализ записанных флуоресцентных изображений.
- Откройте файл эксперимента. Использование программного обеспечения aquacosmos, нажмите на кнопку "Соотношение" и выберите желаемый диапазон кадра. Рассчитывают отношение пиксель за пиксель в полученных изображений, чтобы получить последовательность соотношение изображений.
- Вычтите фон, регулируя 'фона ликвидацию ". Нажмите 'Start расчет.
- Нажмите 'все времена последовательность "кнопка и стереть древние регионы интереса (трансформирования). Для количественного анализа отдельных клеток, установить новые регионы интересов или трансформирования соответствующие отдельных нейронов. Средние значения отношения все в каждом пикселе, соответствующие каждому ROI и каждого изображения, чтобы получить запись значений флуоресценции отношение для отдельных трансформирования (ячеек).
- Для график индивидуальных записей экспортировать значения соотношения флуоресценции, соответствующие каждой ROI в графический прогресть.
- Сделайте соответствующие расчеты для оценки размера повышений в соотношении fluorescences в ответ на каждый стимуляции с помощью подходящего анализа данных и графическое программное обеспечение.
3. Биолюминесценция Визуализация митохондриальной Ca 2+ Концентрация
- Трансфекция культивируемых нейронах гиппокампа с плазмидой mitGAmut.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки сначала трансфицировали плазмидой, содержащей mitGAmut митохондрий, ориентированных последовательность и мутантный экворин хватает на Ca 2+ сайт связывания, слитый с зеленого флуоресцентного белка (GFP). Эта конструкция определяет большие подъемы в митохондриальной Ca 2+ поглощения и позволяет идентифицировать трансфекции клеток по флуоресценции GFP в. Плазмида была разработана и любезно предоставил П. Brûlet и сотрудниками 18 (CNRS, Париж).- Подготовка Neurobasal TF, содержащий Neurobasal культуральной среде, не хватает фетальной бычьей сыворотки, В27, gentamicВ и 2 мМ L-глутамина.
- Готовят 50 мкл Neurobasal TF плюс 2,5 мкл реагента для трансфекции в ампуле (раствор А). Подготовка 50 мкл Neurobasal TF плюс 4 мкг плазмиды mitGAmut в пробирке (раствор Б). Добавить мягко решение B над раствора А. Разрешить смешивания в течение 20 мин, без встряхивания.
- Передача покровные содержащие нейроны гиппокампа на новые multidish пластины, содержащие 200 мкл свежей Neurobasal TF.
- Добавить по капле 100 мкл раствора A + B в течение каждого покровное. Инкубируют в течение 30 мин. Удалить среду. Вымойте раз с пресной клеток Neurobasal TF. Вернуться покровные к первоначальному Neurobasal культуральной среде.
- Культура нейроны в течение дополнительных 24 ч при 37 ° С и 5% CO 2 после трансфекции, чтобы позволить эффективную экспрессию и ориентации зонда.
- Подготовка тестовых решений для визуализации биолюминесценции.
- Готовят растворы, содержащие NMDA HBS 100 мкм или 145 мм KCl, каквыше (Шаг 2.1). Получают раствор HBS, содержащем 10 мМ Са 2+ плюс дигитониновых 100 мкм.
- Восстановление митохондрий, ориентированных акворина с коэлентеразин п.
- Передача покровные содержащие трансфицированные нейронов в гиппокампе четыре скважины пластину, содержащую 200 мкл HBS.
- Добавить 4 мкл коэлентеразином п (200 мкм) до 200 мкл HBS для конечной концентрации 4 мкМ и осторожно перемешать. Инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре (25 ° C) и в темноте.
- Запись биолюминесценции изображения митохондриальной [Ca 2+].
- Включите микроскоп, лампы, системы перфузии, биолюминесценции камерой и компьютером.
- Передача восстановленных покровные к термостатированный (37 ºC) перфузии камеры и заливать непрерывно подогретого раствора HBS со скоростью 5-10 мл / мин.
- Использование цели 40X (нефть, Н. А.: 1.3), выбрать микроскопическое поле, содержащий клетки, экспрессирующие Apoaequorins, как показано на флуоресценции, связанного с экспрессией зеленого флуоресцентного белка (GFP) с использованием фильтров FITC. Типичный поле может содержать 1-2 трансфицированных клеток. Захват изображения флуоресценции GFP, используя ПЗС-камеры.
- Выключите свет микроскопа. Извлеките дихроичный содержащих коробку, расположенную в световом пути. Выключите свет возбуждения и закрытия темно-окно для полной темноте.
- Заливать клеток в 5-10 мл / мин с HBS среде с или без испытуемые растворы предварительно нагретого до 37 ° С.
- Захват фотонных эмиссионные изображения каждые 10 сек с счета фотонов камеры обрабатываются процессором изображения.
- В конце каждого эксперимента, проницаемыми клетки с 0,1 мМ дигитониновым в 10 мМ CaCl 2 в HBS, чтобы освободить все оставшиеся фотонные выбросов.
Примечание: Эти фотонные излучения должны быть добавлены до того, чтобы оценить общее фотонных выбросов, значение, необходимое для калибровки в концентрациях Са 2+ <./ LI> - Магазин биолюминесценции изображения в компьютер с GFP флуоресценции изображение связано захватили до визуализации счета фотонов.
- Анализ биолюминесценции изображений, отражающих митохондриальную [Ca 2+].
- Количественно фотонных выбросы, используя специальное программное обеспечение. Фотонные выбросы могут быть преобразованы в митохондриальной свободного Ca2 + концентрации ([Ca2 +] MIT) с использованием алгоритма, описанного Brini соавт. 15.
- Откройте эксперимент и изображение флуоресценции GFP. Выберите регионы интереса (трансформирования) с помощью специального программного обеспечения по разработке форму трансфицированных клеток в соответствии с флуоресценции изображений, снятых в начале эксперимента.
- Вставить те же трансформирования на каждом изображении. Всего фотонные выбросы в каждой ROI вычисляются с конкретного программного обеспечения, чтобы получить значение излучения люминесценции (L) для каждой ячейки в каждый момент времени.
- Сложите все фотонный Emissионы в биолюминесценции изображений, в том числе тех, полученных после дигитониновым пермеабилизации, используя специальное программное обеспечение, чтобы получить изображение, содержащее биолюминесценции все фотонные выбросов.
- Экспорт значения фотонных излучений для каждого региона интереса к специальным программным обеспечением для расчетов. Чтобы сделать это, нажмите на кнопку "График" для того, чтобы вычислить значения биолюминесценции для каждого ROI в каждый момент времени. Выберите "общая стоимость" и "использовать текущий ROI для всех изображений. Нажмите 'вычислить'. Сохранить '' txt.file и экспортировать данные в таблицу. Для каждого ROI, [Са 2+] рассчитывается мит, используя следующий алгоритм:
[Са 2+] (М) = [R · (R · К ТР) - 1] / [K R - (R · К R)];
где,
R = [L / (L Общая λ)] 1 / п
L представляет люминесценции в момент измерения в каждой области, представляющей интерес.
L Всегообщее люминесценции, остающийся после того графов, присутствующих в ткани в то время во время измерения для каждой области, представляющей интерес. λ, K TR К Р и п постоянные, значения которых зависят от комбинации акворина (дикого типа или мутантный) и coelenterazin используется (дикого типа или типа N), а также температура 16 записи. Для комбинации, используемой здесь (мутировал AEQ и coelenterzine п), при 37 ° С, мы использовали следующие значения: К = 8,47 R х 10 7, К = 165,6 TR х 10 3, п = 1,204 и λ = 0,138.
- Сделайте соответствующие расчеты для оценки размера повышений в биолюминесценции в ответ на каждый стимул с помощью подходящего анализа данных и графическое программное обеспечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы опишем простой метод для оценки Ca 2+ ремоделирования и влияния на NMDA цитозольного и митохондриальной [Са 2+] в возрасте нейронов. Рисунок 1 показывает схему процедуры для выделения и культивирования гиппокампа нейроны от новорожденных крыс. Перед началом, нам нужно подготовить стерильные поли-D-лизин покрытием покровные стекла, и найти их в 4-а блюдо. Затем новорожденных крыс погибают и мозг удаляется. После выделения гиппокамп, ткань тщательно диспергируют, используя папаин. Изолированные клетки промывают и помещают на покровные стекла с покрытием. Затем клетки культивировали в течение 2-5 DIV или> 15 DIV, чтобы получить молодых или старых культур, соответственно, и используется для Са 2 + экспериментов изображений.
Используя вышеупомянутый стратегию, можно иметь молодых и старых нейроны от того же образца для испытания, например, индуцирует ли NMDA дифференциальные эффекты на цитозольной [Ca2 +] в молодых cultuразрешением, чем в старых культурах. Рисунок 2 показывает, что NMDA-100 мкМ индуцирует более значительное увеличение в цитозоле [Са 2+] в старых культурах, чем в молодых культурах. Точно так же, NMDA индуцирует гибель клеток в старых нейронов, но не в молодых нейронов 5. В случаях, когда ответ Ca 2+ очень высоки, подобные эксперименты могут быть выполнены с Са2 + зондов с меньшим сродством к Ca2 +, чтобы избежать насыщения краситель, как, например fura4F 5. Таким же образом, можно также узнать, является ли [Са 2+] отличаются отдыха уровни цитозольного. Кроме того, сочетание этого протокола с количественным иммунофлуоресценции с использованием антител, специфичных для NMDA-субъединиц может позволить соотнести изменения в отзывчивости с различиями в экспрессии рецепторов NMDA субъединиц при условии, что специфические антитела можно 5. Измерения цитозольного [Ca2 +] может быть использован также для оценки другой соответствующей parameteRS в том числе Са 2+ магазине содержания, отдыха проницаемость для Ca 2+, Са 2+ освобожденных и их возможные различия между молодыми и в возрасте нейронов.
Аналогичным образом, можно также проверить воздействие таких стимулов митохондриальной [Ca2 +]. На рисунке 3 показан пример биолюминесценции визуализации нейронов гиппокампа, трансфецированных митохондрий, ориентированных акворина. Выпуск фотонных выбросов после стимуляции является функцией роста митохондрий [Са 2+] достигнуто. Обратите внимание, что NMDA-индуцированной поднимается в митохондриальной [Са 2+] в возрасте нейронов намного больше, чем в молодых нейронах гиппокампа, где NMDA-едва возрастает выбросов фотонные. Эти результаты могут способствовать объясняет, почему NMDA индуцирует апоптоз только в возрасте нейронов, но не у молодых культур клеток гиппокампа 5. Таким же образом, можно проверить дополнительные различий в митохондриальныхСа 2+ обработки между молодыми и в возрасте нейронов с использованием протоколов, специально предназначенные для тестирования, например, Са 2+ выход из митохондрий, митохондрий Са 2+ поглощение в проницаемыми нейронов и индуцированных Ca 2+ выпуска из внутриклеточных депо митохондриальной Ca 2+ поглощения. Кроме того, эта методика может быть использована для проверки лекарственных средств, влияющих митохондриальной Ca 2+ перегрузки, которые могут представлять интерес для нейропротекции против эксайтотоксичности.
Рисунок 1: Процедура изоляции первичных нейронов гиппокампа крыс (А) поли-D-лизина, 12 мм стекла с покрытием покровные получают в чашке Петри, и, наконец переносили в чашку 4-а.. (Б) Спинной зрения мозга крысы. Пунктирная линия показывает, где разрез должно быть сделано. (С) Получение, какuspension первичных гиппокампа нейронных клеток. После удаления гиппокампа, клетка суспензию. Затем клетки высевают в 4-блюд, содержащими покровные покрытые поли-D-лизина. (D) светлое поле изображение, показывающее основные нейроны гиппокампа крыс в культуре. Бар представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. NMDA увеличивает Цитозольные [Са 2+] в нейронах гиппокампа Краткосрочные и долгосрочные культивированный нейронов гиппокампа были загружены фура2 / AM и подвергали флуоресценции. Фотографии показывают репрезентативные яркие полевые и псевдоцвете изображения (соотношение F340 / F380) на короткий срок (A) и долгосрочные (B [Са 2+] (псевдоцвете весы показали на дне). Следы показать представительства, одноклеточные записи цитозольного [Ca 2+] в ответ на 100 мкМ NMDA в краткосрочной перспективе (A) и долгосрочной (B), культивируемых нейронов гиппокампа. Обратите внимание, что Цитозольные [Са 2+] увеличивается в долгосрочной перспективе гораздо больше, чем в краткосрочных культивируемых нейронов. Бар представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. NMDA индуцирует митохондриальной Ca 2+ перегрузки в нейронах гиппокампа гиппокампа Искусственный NeurДополнения трансфицировали с низким сродством, митохондрии ориентированы экворин, слитый с GFP, инкубируют с 4 мкМ коэлентеразина и подвергали визуализации биолюминесценции митохондриальных [Са 2+]. Фотографии показывают флуоресценции (GFP) и накопленных фотонных выбросов (экворин биолюминесценции) изображения представительной кратко- (A) и долгосрочной (B), культивируемых нейронов гиппокампа. Интенсивность люминесценции кодируется в псевдоцвете (от 1 до 16 фотонные выбросы на пиксель). Записи показывают, выпуск фотонных излучений (выраженных в митохондриальной [Са 2+]) в кратко- (А) и долгосрочной (B), культивируемых нейронов гиппокампа. NMDA 100 мкМ увеличился митохондриального [Са 2+] в возрасте нейронов, но не в молодых культивируемых нейронов гиппокампа. Бар представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. </ а>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модернизации внутриклеточного Ca 2+ гомеостаз в стареющем мозге была связана с познавательной потери, повышенную восприимчивость к ишемии, эксайтотоксичности и нейродегенеративные. Чтобы исследовать эту гипотезу в пробирке, процедуры отображения Ca 2+ доступны. К сожалению, жизнеспособные культуры нейронов гиппокампа старых не являются надежными. Недавно было обнаружено, что долгосрочные культуры гиппокампа крыс нейроны присутствуют многие из типичных признаков старения в естественных условиях, включая накопления АФК, формирование липофусциновых гранул, гетерохроматиновых очагов, активации pJNK и p53 / p21 путей, потеря холестерина, и изменяет плотность каналов Ca 2+ и NMDA-рецепторы 14. Соответственно, эксперименты изображений Ca 2+ в молодых и старых крыс культур нейронов гиппокампа может предоставить новые идеи о Ca 2+ ремоделирования в старения мозга. Состояние, имеет решающее значение для культивирования hippocampal нейроны в долгосрочной перспективе является в два раза. Во-первых, важно, чтобы пластина клеток при весьма низкой плотностью, как указано выше. Во-вторых, клетки культивируют в обогащенной среде без Neurobasal замены среды. Такой подход позволяет наличие глии, но избежать их однобоко рост. Схема такого культуры показано на фиг.1.
Флуоресценции изображений с синтетическими Са 2+ зондов позволяет контролировать цитозольного [Ca 2+] в отдельных нейронов 19. Использование этого подхода в молодых и в возрасте нейронов позволяет осуществлять мониторинг изменений в ответах с возрастом в культуре. Например рис 2 показаны типичные яркий поле и изображений Ca 2+ увеличивается [Са 2+] цит индуцируется NMDA молодых нейронов и нейронов в возрасте культур. Обратите внимание, что ответы в возрасте нейронов намного больше, чем в молодых нейронов. Тем не менее, эта процедура не является надежным для [Ca 2+] Измерений в пределах субклеточные органеллы, как, например, митохондрий, где [Са 2+] может варьироваться от ниже мкМ до над уровнем мм. В этих случаях, на основе белка, митохондрии, ориентированных зонды были разработаны как, например, экворин. Этот зонд является особенно интересным, так как его сродство к Ca 2+ может быть тонко настроена для мониторинга очень низкие или очень высокие [Ca 2+], как те, достигнутые в митохондриях отдыха и стимулировали условия, соответственно. В частности, можно выбрать либо дикого типа экворин или мутированный экворин без Са2 + сайты связывания для изменения сродства. Подстройка достигается, когда различные coelenterazines (дикий тип, H, N) используют в сочетании с различными aequorins 17. Тем не менее, в то время как использование флуоресценции для визуализации Са 2+ широко распространены, мониторинг биолюминесценции не является простым и может потребовать подсчета фотонов камеры. К счастью, экворинзонды, как тот, используемый здесь, были улучшены для совместного экспресс GFP 18 делает их более стабильными, в состоянии выпустить более фотонные выбросов и позволяет простой идентификации трансфицированных клеток со стороны GFP связана флуоресценции. Успех в визуализации биолюминесценции в нейронах зависит не только от эффективности счета фотонов камеры, используемой, но и от эффективности трансфекции митохондрий, ориентированных зонда. В случае нейронов гиппокампа, простое химическое трансфекции может работать при условии, что высокая чувствительность счета фотонов камера доступна. Рисунок 2 показывает примеры светлом поле, флуоресценция GFP и биолюминесценции изображений молодых и в возрасте в культуре нейронов гиппокампа. Также показаны увеличение митохондрий [Ca2 +], индуцированный NMDA, записанной в трансфицированных нейронов гиппокампа. Обратите внимание, что эффект NMDA в возрасте культивируемых нейронах значительно больше, чем у молодых нейронов. В других случаях, эффективность transfecции может быть увеличена с помощью вирусных векторов, полученных 16,18. Кроме того, развитие трансгенных мышей, несущих на основе белков, субклеточные Ca 2+ зондов является новым вариантом для будущих подходов, возможно, даже в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
