Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; У пожилых нейронов гиппокампа

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресценции и Биолюминесценция изображений субклеточных Ca

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53330

⸱

1 декабря 2015 г.

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

В этой статье

Краткое содержание

Внутриклеточное ремоделирование Ca²⁺ при старении может способствовать эксайтотоксичности и повреждению нейронов, процессам, опосредованным перегрузкой Ca²⁺. Мы стремились исследовать ремоделирование^Ca2+ в стареющем мозге с помощью флуоресцентной и биолюминесцентной визуализации цитозольного и митохондриального^Ca2+ в долговременных культурах нейронов гиппокампа крыс, что является моделью старения нейронов.

Аннотация

Восприимчивость к гибели клеток нейрон, связанный с нейродегенерацией и ишемии чрезвычайно увеличился в возрасте мозга, но механизмы, ответственные плохо известны. Эксайтотоксичность, процесс полагают, способствует повреждению нейронов, вызванной обоих инсультов, опосредовано активацией глутаматных рецепторов, что способствует притоку ^Ca2 + и ^Ca 2+ митохондриальной перегрузки. Существенное изменение внутриклеточного ^Ca 2+ гомеостаза или реконструкции внутриклеточного ^Ca 2+ гомеостаза нейронов может способствовать повреждению нейронов в старых. Для исследования ^Са 2+ ремоделирования в процессе старения мы использовали изображений живых клеток в долгосрочных культурах гиппокампа крысы нейронов, которые напоминают в некоторых аспектах в возрасте нейроны в естественных условиях. Для этого, гиппокампа клетки, в первую очередь, недавно разошлись с новыми родился крыс гиппокампе и высевали на поли-D-лизин покрытием, покровные стекла. Затем культуры хранятся в контролируемой средах в течение нескольких дней или нескольких шEEKs для исследования молодых и старых нейронов, соответственно. Во-вторых, культивируемые нейроны загружены фура2 и подвергали измерениям цитозольном ^Ca 2+ концентрации с использованием цифровых изображений отношение флуоресценции. В-третьих, культивируемые нейроны трансфицировали плазмидами, выражающих тандем низкоаффинных акворина и GFP, ориентированные на митохондрии. Через 24 часа, экворин внутри клеток восстанавливают коэлентеразином и нейроны подвергали визуализации биолюминесценции для контроля митохондриальной ^Ca 2+ концентрации. Это три шага процедура позволяет контролировать цитозольного и митохондриальных ответов ^Ca 2+ в соответствующих стимулов как, например, агонист рецептора NMDA глутамата и сравнить ли эти и другие ответы влиянием старения. Эта процедура может привести к новому пониманию того, как старение влияние цитозольных и митохондриальных ответов ^Ca 2+ в выбранных раздражителей, а также тестирование некоторых лекарственных препаратов, направленных на предотвращение нейронов клеткисмерть в возрастных заболеваний.

Введение

Эксайтотоксичность является одним из наиболее важных механизмов, способствующих повреждению нейронов и гибели клеток в неврологических инсультов, таких как ишемия, а в некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера ^1. Этот тип нейротоксичности в основном при посредничестве глутамата, действующего на ^Ca 2+ -permeable, рецепторы NMDA ионотропический (NMDAR) ^2. Воздействие культивируемых нейронов на глутамат может привести к эксайтотоксичности ^3, который вызывает апоптоза нейронов ^4. Мы и другие, ранее сообщалось, что нейронная уязвимость к апоптозу NMDA-индуцированной может измениться с ра....