Abstract
وزادت القابلية للموت الخلايا العصبية المرتبطة التنكس العصبي ونقص التروية جدا في الدماغ ولكن الذين تتراوح أعمارهم بين الآليات المسؤولة معروفة بشدة. التحفيز الزائدة، وهي عملية يعتقد أنها تساهم في تلف الخلايا العصبية الناجمة عن كل من الشتائم، وبوساطة تنشيط مستقبلات الغلوتامات يعزز الكالسيوم 2+ تدفق والميتوكوندريا الكالسيوم 2+ الزائد. تغيير كبير في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن أو إعادة عرض من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن قد تفضل تلف الخلايا العصبية في الخلايا العصبية القديمة. للتحقيق في كاليفورنيا 2+ إعادة عرض في الشيخوخة وقد استخدمنا تصوير الخلايا الحية في الثقافات على المدى الطويل من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران التي تشبه في بعض الجوانب الخلايا العصبية في الجسم الحي الذين تتراوح أعمارهم. لهذه الغاية، وخلايا قرن آمون هي، في المقام الأول، فرقت حديثا من الحصين الفئران ولدت جديدة ومطلي على بولي-D-يسين coverslips المغلفة، والزجاج. ثم يتم الاحتفاظ الثقافات في وسائل الإعلام التي تسيطر عليها لعدة أيام أو عدة ثeeks عن التحقيق في الخلايا العصبية صغارا وكبارا، على التوالي. ثانيا، يتم تحميل الخلايا العصبية مثقف مع fura2 ويخضع لقياسات من عصاري خلوي تركيز الكالسيوم 2+ باستخدام التصوير الرقمي نسبة مضان. ثالثا، و transfected الخلايا العصبية مثقف مع البلازميدات معربا عن جنبا إلى جنب من aequorin منخفضة تقارب وGFP تستهدف الميتوكوندريا. بعد 24 ساعة، وإعادة تشكيل aequorin داخل الخلايا مع coelenterazine ويتعرضون الخلايا العصبية التصوير تلألؤ بيولوجي لرصد الميتوكوندريا تركيز الكالسيوم 2+. يسمح هذا الإجراء ثلاث خطوات رصد عصاري خلوي وردود كا 2+ الميتوكوندريا لمحفزات ذات الصلة وعلى سبيل المثال ناهض مستقبلات الغلوتامات NMDA وقارن بين ما إذا كانت تتأثر هذه وغيرها من ردود الشيخوخة. هذا الإجراء قد تسفر عن رؤى جديدة عن كيفية تأثير الشيخوخة عصاري خلوي والميتوكوندريا الردود الكالسيوم 2+ للمؤثرات مختارة، فضلا عن اختبار عقاقير مختارة تهدف إلى منع الخلايا العصبيةالموت في الأمراض المرتبطة بالعمر.
Introduction
التحفيز الزائدة هي واحدة من أهم الآليات التي تسهم في تلف الخلايا العصبية وموت الخلايا العصبية في الشتائم مثل نقص التروية، وبعض الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر 1. وتتوسط هذا النوع من العصبية أساسا من الغلوتامات التمثيل حول Ca 2+ -permeable، مستقبلات ionotropic NMDA (NMDAR) 2. تعرض الخلايا العصبية مثقف لالغلوتامات يمكن أن يؤدي إلى التحفيز الزائدة 3، والذي يسبب موت الخلايا المبرمج العصبية 4. نحن وغيرنا قد ذكرت في وقت سابق ان ضعف الخلايا العصبية التي يسببها NMDA موت الخلايا المبرمج قد تتغير مع تطور في المختبر والشيخوخة 5-8.
ومن المسلم به على نطاق واسع أن زيادة خالية من عصاري خلوي كا 2+ تركيز ([كا 2+] CYT) يؤدي إلى تنشيط الخلايا. ومع ذلك، إذا كان هذا الارتفاع مرتفع جدا و / أو المحافظة بما فيه الكفاية، يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا 9. وعلاوة على ذلك، فقد تم اقتراحأن التحفيز الزائدة يتطلب الكالسيوم الميتوكوندريا 2+ امتصاص 10، منذ علاج الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية uncoupler الميتوكوندريا محمي ضد الغلوتامات التي يسببها خلية الموت 11. إذا الميتوكوندريا يستغرق الكثير من الكالسيوم 2+، قد تحدث افتتاح الميتوكوندريا نفاذية المسام الانتقالية، مما أدى إلى الإفراج عن السيتوكروم ج وغيرها من العوامل المؤيدة لأفكارك، ويحفز الخلايا. لقد أظهرنا مؤخرا أن هذه الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص يرتبط مباشرة إلى قابلية تعتمد على عمر إلى التحفيز الزائدة، عن طريق قياس مباشرة NMDA التي يسببها الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص الخلايا العصبية في قرن آمون واحدة 5، الطريقة التي يتم عرضها في هذا المقال. الحصين، والمشاركة في العمليات الفسيولوجية مثل التعلم والذاكرة والعمليات المعرفية الأخرى 12، هو عرضة للشيخوخة والاضطرابات العصبية 13. وقد اقترح أنه بعد عدة أسابيع في المختبر، مثقفتظهر الخلايا العصبية الحصين عددا من الخصائص المميزة للخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين 14. وبناء على ذلك، يمكن أن توفر الخلايا العصبية الحصين مثقف على المدى الطويل نموذج شامل للتحقيق الكالسيوم 2+ آليات بوساطة من تعزيز التحفيز الزائدة في الشيخوخة.
الهدف العام من الطريقة المعروضة هي، بالتالي، للتحقيق تغييرات جوهرية في الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن أو الكالسيوم 2+ إعادة عرض في المخ من الشيخوخة بما في ذلك الردود والفرق الكالسيوم 2+ التي تسببها NMDA منبهات مستقبلات في المدى الطويل الخلايا العصبية الحصين مثقف . يتضمن الأسلوب وصفا تفصيليا للثقافة الجرذ الخلايا العصبية قرن آمون ورصد الكالسيوم 2+ تركيزات عصاري خلوي والميتوكوندريا التي كتبها مضان والتصوير تلألؤ بيولوجي في الخلايا العصبية الفردية، على التوالي. التصوير مضان من الكالسيوم عصاري خلوي 2+ في الخلايا العصبية مثقف هو الإجراء العادي. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو أقل موثوقية لالفرعيةخلوي كا 2+ القياسات بما في ذلك الميتوكوندريا الكالسيوم 2+. ومن أسباب ذلك عدم وجود استهداف السليم للتحقيقات الاصطناعية وتقارب غير مناسب ل Ca 2+ تركيزات التي قد تتغير في الميتوكوندريا من مستوى منخفض ميكرومتر حتى إلى مستوى ملي. استخدام الكالسيوم 2+ تحقيقات على أساس البروتينات كما على سبيل المثال aequorin، وقد سمح لاستهداف لعضيات التحت خلوية واستخدام مشتقات مختلفة كا 2+ الانتماءات باستخدام coelenterazines مختلفة أو تحقيقات تحور تفتقر إلى الكالسيوم محدد 2+ مواقع الربط 15. في هذه الطريقة، التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا معربا عن استهداف الميتوكوندريا aequorin قد تسمح رصد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ التركيزات في الخلايا العصبية الفردية. ومع ذلك قد يتطلب هذا الإجراء استخدام كاميرات العد الفوتون أو كاميرات CCD فائقة الحساسية للتلألؤ بيولوجي التصوير 16-18. هذه الطريقة قد تسفر عن نتائج الرواية التي ينبغي تأكيد بمزيد من إسطبلished نماذج شيخوخة الدماغ كما، على سبيل المثال، شرائح الدماغ من الحيوانات القديمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات قد تم التعامل معها في إطار البروتوكولات التي وافق عليها مرفق إيواء الحيوانات جامعة بلد الوليد في اتفاق مع / مجلس الاتفاقية الأوروبية 123 من أوروبا والتوجيه 86/609 / EEC.
1. الثقافة قصيرة وطويلة الأجل من الفئران الحصين الخلايا العصبية
- إعداد بولي-D-يسين المغلفة، 12 مم coverslips الزجاج.
- تعقيم 12 مم coverslips الزجاج قطر في الإيثانول لمدة لا تقل عن 24 ساعة. تسمح لهم لتجف تحت ظروف معقمة.
- توزيع لل coverslips على شريط من parafilm في طبق بتري. تغطية سطح كل ساترة مع 200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل بولي-D-يسين. تسمح علاج O / N.
- في اليوم التالي يغسل لل coverslips مع الماء المعقم مزدوجة المقطر كل 15 دقيقة لمدة 90 دقيقة تحت ظروف معقمة.
- ملء طبق multidish أربعة جيدا مع 500 ميكرولتر من Neurobasal الثقافة المتوسطة لكل بئر. Neurobasal الثقافة المتوسطة يجب أن تستكمل مع10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ B27، 1 ميكروغرام / جنتاميسين مل و 2 مم L-الجلوتامين.
- ضع لل coverslips في لوحة multidish. المحافظة عليها في ترطيب 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة حتى الاستخدام.
- عزل الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران حديثي الولادة.
- إعداد 1.8 مل من محلول غراء (شراؤها مباشرة) في قارورة (20 ميكرولتر / مل) تحت ظروف معقمة: للحصول على التركيز النهائي من 20 ميكرولتر / مل إضافة نحو 40 ميكرولتر غراء في 1.8 مل من هانك بالإضافة إلى 0.6٪ BSA (يجب أن تحسب ميكرولتر تبعا للظروف المورد). يتم إعداد 0.6٪ BSA هانك عن طريق خلط 85 مل من HBSS المتوسطة مع 15 مل من الألبومين 4٪ المصل البقري (BSA، أعد حل 4 غرام من BSA في 100 مل HBSS). إعداده في غطاء العقيمة.
- احتضان غراء في لهانك بالإضافة إلى 0.6٪ BSA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تصفية الحل باستخدام فلتر 0.22 ميكرون قبل استخدامها.
- إعداد هام في F-12 المتوسطة عن طريق إضافة لDulbeccoتعديل متوسطة مسحوق النسر (13.5 غرام لكل لتر) في 900 مل من الماء المعقم مزدوجة المقطر. ثم إضافة 6 ز HEPES و 336 ملغ NaHCO 3 وضبط درجة الحموضة إلى 7،42 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 4 N. أضف الماء المعقم للحصول على حل وتصفية 1 L ذلك باستخدام 0.20 ميكرون polyethersulfone (PES) زجاجة كبار التصفية. تحمل هذه العملية في غطاء العقيمة. أخيرا تشبع حل مع CO 2 تحت ظروف معقمة قبل الاستخدام. مخزن الحلول في 4 درجة مئوية واستخدامها مبردة.
- الموت ببطء حديثي الولادة (P0) الفئران الوليدة عن طريق قطع الرأس وغسل الرأس في العقيمة المتوسطة HBS. فتح الجمجمة مع مساعدة من مقص العقيمة. استخراج الدماغ مع ملعقة، وأغسلها بسرعة في هام في F-12 متوسطة.
- اجراء خفض قطري مع المعونة من مشرط في كل نصف الكرة الأرضية (الشكل 1B)، وحملها إلى طبق بتري تحتوي على لحم الخنزير F-12 متوسطة.
- السحايا تجاهل بعناية بمساعدة ملقط تشريح وتحت عدسة مكبرة. <لى> تحديد الحصين في موقع مقعر مميزة على القشرة باستخدام عدسة مكبرة. ثم، فصل الحصين من القشرة عن طريق سحب بعناية من الحدود واحدة وإزالته من موقعه باستخدام مقص العين.
- نقل الأنسجة الحصين إلى لوحة 4 بشكل جيد مليئة المتوسطة معقم هانك تفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ بالإضافة إلى 0.6٪ BSA وغسل الأنسجة قرن آمون. دون إزالة قطع وسائل الإعلام الأنسجة في قطع صغيرة (حوالي 2 × 2 مم) باستخدام مقص العين نفسها.
- نقل قطع الحصين إلى قارورة تحتوي على 1.8 مل من محلول غراء قبل تصفيتها. ثم احتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع بعض الأحيان، الهز لطيف. بعد 15 دقيقة، إضافة 90 ميكرولتر من الدناز I الحل (50 ميكروغرام / مل النهائي)، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية.
- نقل الأنسجة لأنبوب الطرد المركزي 10 مل وغسل شظايا مع الطازجة Neurobasal الثقافة المتوسطة. الحصول على تعليق خلية عن طريق تمرير شظايا الأنسجة من خلال البلاستيك 5 مل نقطةETTE.
- تعليق خلية الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة باستور وتعليق بيليه بعناية مع 1 مل الآلي ماصة في 1 مل من Neurobasal الثقافة المتوسطة.
- قياس كثافة الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. وضع ساترة الزجاج على الحجرة نويباور. إضافة 10 ميكرولتر من التعليق الخلية. تأكد من تعليق خلية يدخل الغرفة بشكل موحد واتخاذ أي فقاعات. حساب عدد الخلايا تحت المجهر وتنفيذ العمليات الحسابية المقابلة للحصول على قطرة مناسبة من 40-80 ميكرولتر تحتوي على 30 × 10 3 خلايا. فإن العدد الكلي للخلايا تعتمد على عدد الحيوانات المستخدمة.
- أكثر من لوحة multidish أربعة جيدا تحتوي على 500 ميكرولتر من Neurobasal الثقافة المتوسطة التي أعدت قبل وأبقى في الحاضنة، لوحة حوالي 30 × 10 3 خلايا في قطرة من حوالي 50 ميكرولتر على كلبئر من لوحة multidish تحتوي على واحد بولي المغلفة D-ليسين، 12 مم الزجاج قطر ساترة.
- الحفاظ على خلايا قرن آمون الأولية في ترطيب 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 2-5 أيام في المختبر (DIV، على المدى القصير، ثقافات الشباب) أو> 15 DIV (على المدى الطويل والثقافات الذين تتراوح أعمارهم بين) قبل التجارب دون تغيير الثقافة وسائل الإعلام.
2. الإسفار التصوير الكالسيوم عصاري خلوي 2+ تركيز
- إعداد اختبار الحلول للتصوير مضان.
- إعداد مخزنة المالحة HEPES (HBS) حل خارجي يتضمن، في ملي: كلوريد الصوديوم 145، بوكل 5، MgCl 2 1، CaCl 2 1، 10 الجلوكوز والصوديوم-HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
- إعداد خارجي، والمغنيسيوم 2+ خالية، والمياه المالحة HEPES مخزنة (HBS) محلول يحتوي على، في ملي: كلوريد الصوديوم 146، بوكل 5، CaCl 2 1، الجلوكوز 10 و HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
- حل المالحة NMDA في المغنيسيوم 2+ خالية، HEPES مخزنة (HBS) في الاتحاد الدولي للسباحةتركيز لتر من 100 ميكرومتر وتكمل مع 10 ميكرومتر الجلايسين.
- يعد حل HBS تحتوي على بوكل بدلا من كلوريد الصوديوم عن طريق حل (مم): 145 بوكل، MgCl 2 1، CaCl 2 1، الجلوكوز 10 و HEPES 10 (الرقم الهيدروجيني 7.42).
- تحميل خلايا قرن آمون مع الفلورسنت التحقيق الكالسيوم fura2 / AM.
- خذ ثقافة الخلية التي تحتوي على coverslips من الحاضنة وغسلها مع HBS المتوسطة في RT بنقلهم إلى أربع سنوات جيدا لوحة multidish جديدة تحتوي على 500 ميكرولتر من HBS لكل بئر.
- احتضان الخلايا مع fura2 / AM 4 ميكرومتر (المعد في نفس HBS المتوسطة) لمدة 60 دقيقة في RT (25 درجة مئوية) في مكان مظلم.
- بعد 60 دقيقة، وغسل coverslips مع الطازجة المتوسطة HBS.
- تسجيل الصور مضان من عصاري خلوي [كا 2+] في الخلايا المستزرعة.
- تشغيل مصباح، المجهر، نظام الارواء، وكاميرا مضان والكمبيوتر.
- ضع لل coverslips في منصة thermostated لفتح 12 ملم coverslips الزجاج على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب وحدد حقل مجهري باستخدام الهدف 40X (النفط، NA: 1،3). يروي الخلايا بشكل مستمر مع قبل حرارة (37 درجة مئوية) HBS المتوسطة في غياب أو وجود مواد الاختبار. الحفاظ على تدفق بمعدل حوالي 5-10 مل / دقيقة.
ملاحظة: يتم تركيب نظام نضح الخلايا لخلايا حية في منصة thermostated لفتح 12 ملم coverslips الزجاج. 8-خطوط نظام نضح يحركها الجاذبية مجهزة مع وحدة تحكم صمام يستخدم ليروي الحلول. مضخة فراغ هي المسؤولة عن إزالة أي وسيط الزائد. يتم تسخين الحلول باستخدام نظام التدفئة في أنبوب. - التقاط صورة الخلفية مع مصراع أغلق عند كل من موجات الإثارة.
- برنامج التحصين الموسع، تضيء الخلايا بالتناوب في 340 و 380 نانومتر. ضوء سجل تنبعث عند 520 نانومتر كل 5-10 ثانية مع كاميرا مضان، الذي تم تصفيته من قبل مزدوج اللون مرآة FURA-2.
- عند الانتهاء من فترة التسجيل، تخزين التسلسل الكامل سصور و تنبعث عند 520 نانومتر في الكمبيوتر لمزيد من التحليل.
- تحليل الصور فلوري المسجلة.
- فتح ملف التجربة. باستخدام برنامج aquacosmos، انقر على 'نسبة' وحدد نطاق النسبة المطلوبة. حساب نسبة بكسل بكسل في الصور الناتجة من أجل الحصول على سلسلة من الصور النسبة.
- طرح الخلفية عن طريق ضبط "القضاء الخلفية". اضغط على "حساب بداية".
- اضغط على "جميع الأوقات تسلسل 'زر ومحو المناطق القديمة من الفائدة (رويس). للتحليل الكمي من الخلايا الفردية، وإنشاء مناطق جديدة في المصالح أو رويس الموافق الخلايا العصبية الفردية. متوسط كل القيم النسبة في كل بكسل المقابلة لكل ROI وكل صورة للحصول على تسجيل القيم مضان نسبة لرويس الفردية (خلايا).
- إلى الرسم البياني التسجيلات الفردية تصدير القيم نسبة مضان المقابلة لكل ROI إلى progr الرسوم البيانيةصباحا.
- جعل الحسابات المقابلة لتقدير حجم الزيادات في fluorescences نسبة استجابة لكل التحفيز باستخدام تحليل البيانات مناسبة والرسوم البيانية البرمجيات.
3. ضوء بارد التصوير من الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ تركيز
- ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين مثقف مع البلازميد mitGAmut.
و transfected خلايا أولا مع البلازميد mitGAmut تحتوي على تسلسل استهداف الميتوكوندريا وaequorin تحور تفتقر إلى موقع ملزم الكالسيوم 2+ تنصهر للبروتين الفلورية الخضراء (GFP): ملاحظة. هذا البناء بالكشف عن ارتفاع كبير في الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص ويسمح بتحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من قبل مضان GFP. وقد وضعت البلازميد وقدمت تفضلت P. Brûlet وزملاء العمل 18 (CNRS، باريس).- إعداد Neurobasal TF، التي تحتوي على Neurobasal الثقافة المتوسطة، التي تفتقر إلى مصل بقري جنيني، B27، gentamicفي و2 مم L-الجلوتامين.
- إعداد 50 ميكرولتر من Neurobasal TF زائد 2.5 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن في قارورة (الحل A). إعداد 50 ميكرولتر من Neurobasal TF بالإضافة إلى 4 ميكروغرام mitGAmut البلازميد في قارورة (الحل B). إضافة بلطف حل B على حل A. السماح خلط خلال 20 دقيقة، دون أن تهتز.
- نقل لل coverslips تحتوي على الخلايا العصبية الحصين لوحات multidish جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر من TF Neurobasal الطازجة.
- إضافة قطرة قطرة 100 ميكرولتر من محلول A + B على كل ساترة. احتضان لمدة 30 دقيقة. إزالة المتوسطة. يغسل مرة واحدة الخلايا مع TF Neurobasal الطازجة. العودة لل coverslips إلى الأصلي Neurobasal الثقافة المتوسطة.
- الخلايا العصبية الثقافة ل24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 بعد ترنسفكأيشن للسماح التعبير كفاءة واستهداف لجنة التحقيق.
- إعداد اختبار الحلول للتصوير تلألؤ بيولوجي.
- إعداد الحلول HBS تحتوي على NMDA 100 ميكرومتر أو 145 ملي بوكل كماأعلاه (الخطوة 2.1). إعداد HBS محلول يحتوي على 10 ملي كا 2+ بالإضافة إلى ديجيتونين 100 ميكرومتر.
- إعادة تشكيل استهداف الميتوكوندريا aequorin مع coelenterazine ن.
- coverslips نقل تحتوي على الخلايا العصبية الحصين transfected إلى لوحة أربع جيدا تحتوي على 200 ميكرولتر من HBS.
- إضافة 4 ميكرولتر من coelenterazine ن (200 ميكرومتر) إلى 200 ميكرولتر من HBS لتركيز النهائي من 4 ميكرومتر وتخلط بلطف. احتضان لمدة 2 ساعة على RT (25 درجة مئوية)، وفي الظلام.
- تسجيل الصور تلألؤ بيولوجي من الميتوكوندريا [كا 2+].
- بدوره على المجهر، ومصباح، ونظام نضح، وكاميرا تلألؤ بيولوجي والكمبيوتر.
- نقل coverslips أعيد إلى thermostated (37 درجة مئوية) غرفة نضح ويروي باستمرار مع درجة حرارة ما قبل حل HBS بمعدل 5-10 مل / دقيقة.
- باستخدام الهدف 40X (النفط، NA: 1،3)، حدد الحقل المجهري تحتوي على خلايا معربا عن لpoaequorins كما يتضح من الانبعاثات مضان المرتبطة التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) باستخدام مرشحات FITC. قد يحتوي حقل نموذجي 1-2 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. التقاط صورة GFP مضان، وذلك باستخدام كاميرا CCD.
- إيقاف ضوء المجهر. إزالة مربع تحتوي على مزدوج اللون تقع في مسار الضوء. إيقاف ضوء الإثارة وإغلاق مربع مظلم لظلام دامس.
- يروي الخلايا في 5-10 مل / دقيقة مع HBS المتوسطة مع أو بدون حلول اختبار قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية.
- التقاط صور الانبعاثات الضوئية كل 10 ثانية مع كاميرا الفوتون العد التعامل مع معالج الصور.
- في نهاية كل تجربة، permeabilize الخلايا مع 0.1 ملي ديجيتونين في 10 ملي CaCl 2 في HBS من أجل الإفراج عن جميع الانبعاثات الضوئية المتبقية.
ملاحظة: يجب أن تضاف هذه الانبعاثات الضوئية تصل من أجل تقدير مجموع الانبعاثات الضوئية، وهي القيمة المطلوبة للمعايرة في كا 2+ تركيزات <./ لى> - تخزين الصور تلألؤ بيولوجي في الكمبيوتر مع GFP المرتبطة صورة مضان اعتقلت قبل التصوير الفوتون العد.
- تحليل الصور تلألؤ بيولوجي يعكس الميتوكوندريا [كا 2+].
- قياس الانبعاثات الضوئية باستخدام برامج معينة. ويمكن تحويل الانبعاثات الضوئية إلى الكالسيوم الحرة الميتوكوندريا 2+ تركيز ([كا 2+] معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا) باستخدام الخوارزمية التي وصفها بريني وآخرون. 15.
- فتح التجربة والصورة GFP مضان. اختر المناطق ذات الاهتمام (رويس) مع مساعدة من برنامج معين عن طريق رسم شكل الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وفقا لصور مضان القبض في بداية التجربة.
- لصق نفس رويس في كل صورة. يتم احتساب مجموع الانبعاثات الضوئية في كل ROI مع برامج معينة للحصول على قيمة الانبعاثات التلألؤ (L) لكل خلية في كل نقطة في الوقت المناسب.
- تضيف ما يصل جميع emiss الضوئيةالأيونات في الصور تلألؤ بيولوجي، بما في ذلك تلك التي تم الحصول عليها بعد ديجيتونين permeabilization، وذلك باستخدام برامج معينة، للحصول على صورة تلألؤ بيولوجي يحتوي على جميع الانبعاثات الضوئية.
- قيمة الصادرات من الانبعاثات الضوئية عن كل منطقة من الفائدة لبرامج معينة لإجراء العمليات الحسابية. للقيام بذلك، انقر على 'الرسم البياني' من أجل حساب القيم تلألؤ بيولوجي لكل ROI في كل مرة. حدد "القيمة الإجمالية" و "استخدام ROI الحالي لجميع الصور. اضغط على "حساب". حفظ "txt.file 'وتصدير البيانات إلى ورقة عمل. لكل ROI، [كا 2+] يحسب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا باستخدام الخوارزمية التالية:
[كا 2+] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)].
الى اين،
R = [L / (L مجموعه λ)] 1 / ن
L هو التلألؤ المنبعثة في وقت القياس في كل منطقة من الفائدة.
L المجموع هوالتلألؤ الكلي المتبقي بعد إضافة التهم موجودة في الأنسجة في ذلك الوقت في وقت القياس لكل منطقة من الفائدة. λ، K TR، K R و N ثوابت القيم التي تعتمد على مزيج من aequorin (النوع البري أو تحور) وcoelenterazin المستخدمة (النوع البري أو نوع ن) وكذلك تسجيل درجة حرارة 16. لمزيج المستخدمة هنا (تحور AEQ وcoelenterzine ن)، في 37 درجة مئوية، استخدمنا القيم التالية: K R = 8.47 × 10 7، K TR = 165،6 × 10 3، ن = 1204 وλ = 0138.
- جعل الحسابات المقابلة لتقدير حجم الزيادات في تلألؤ بيولوجي ردا على كل التحفيز باستخدام تحليل البيانات مناسبة والرسوم البيانية البرمجيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا وصف طريقة بسيطة لتقييم الكالسيوم 2+ إعادة عرض وآثار NMDA على عصاري خلوي والميتوكوندريا [كا 2+] في الخلايا العصبية المسنين. ويبين الشكل 1 التخطيطي من إجراءات عزل وزراعة الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران حديثي الولادة. قبل البدء، نحتاج إلى إعداد العقيمة، وبولي-D-يسين المغلفة، coverslips الزجاج والعثور عليهم في طبق 4-جيدا. ثم، الفئران حديثي الولادة يتعرضون للقتل والدماغ إزالتها. بعد عزل الحصين، وفرقت الأنسجة بعناية باستخدام غراء. تغسل الخلايا المعزولة ومطلي coverslips على المغلفة. ثم الخلايا المستنبتة لمدة 2-5 DIV أو> 15 DIV للحصول الشباب أو الذين تتراوح أعمارهم بين الثقافات، على التوالي، وتستخدم ل Ca 2+ تجارب التصوير.
باستخدام استراتيجية المذكورة أعلاه، فإنه من الممكن أن تكون الخلايا العصبية الصغار والكبار من نفس عينة لاختبار، على سبيل المثال، ما إذا كان NMDA يدفع التأثيرات المتباينة على عصاري خلوي [كا 2+] في cultu الشبابالدقة من في الثقافات القديمة. يبين الشكل 2 أن NMDA 100 ميكرومتر يدفع زيادات أكبر في عصاري خلوي [كا 2+] في الثقافات القديمة من في الثقافات الشابة. وبالمثل، NMDA يدفع موت الخلية في الخلايا العصبية القديمة ولكن ليس في الخلايا العصبية الشباب 5. في الحالات التي يكون فيها استجابات الكالسيوم 2+ مرتفعة جدا، تجارب مماثلة يمكن القيام بها مع الكالسيوم 2+ تحقيقات مع أقل تقارب ل Ca 2+ لتجنب صبغ التشبع مثل، على سبيل المثال fura4F 5. بنفس الطريقة، فمن الممكن أيضا أن تعلم ما إذا كانت مستويات الراحة من عصاري خلوي [كا 2+] مختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين هذا البروتوكول مع المناعي الكمي باستخدام أجسام مضادة محددة لمفارز NMDAR قد تسمح التغييرات ترتبط في الاستجابة مع وجود اختلافات في التعبير عن مفارز مستقبلات NMDA شريطة أن تكون الاجسام المضادة المحددة المتاحة 5. قياسات عصاري خلوي [كا 2+] يمكن أن تستخدم أيضا لتقييم paramete الأخرى ذات الصلةروبية بما في ذلك الكالسيوم 2+ تخزين المحتوى، ويستريح نفاذية الى كا 2+، كا 2+ معدلات إزالة والخلافات المحتملة بين الخلايا العصبية الشباب والمسنين.
بطريقة مماثلة، فمن الممكن أيضا لاختبار آثار هذه المحفزات على الميتوكوندريا [كا 2+]. ويبين الشكل 3 مثال على التصوير تلألؤ بيولوجي من الخلايا العصبية قرن آمون مع transfected استهداف الميتوكوندريا aequorin. الإفراج عن الانبعاثات الضوئية بعد التحفيز هو وظيفة من ارتفاع في الميتوكوندريا [كا 2+] تحقيقه. لاحظ أن ارتفاع الناجم عن NMDA في الميتوكوندريا [كا 2+] هي أكبر من ذلك بكثير في الخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين من الخلايا العصبية في قرن آمون الشباب، حيث بالكاد يزيد NMDA الانبعاثات الضوئية. هذه النتائج يمكن أن تسهم في تفسير سبب NMDA يدفع الخلايا فقط في الخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين ولكن ليس في ثقافات الشباب من خلايا قرن آمون 5. بنفس الطريقة، فمن الممكن لاختبار الفروق إضافية في الميتوكوندرياكاليفورنيا 2+ التعامل مع الخلايا العصبية بين الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين وباستخدام بروتوكولات المصممة خصيصا لاختبار، على سبيل المثال، كاليفورنيا 2+ خروج من الميتوكوندريا، الميتوكوندريا كاليفورنيا 2+ امتصاص الخلايا العصبية في permeabilized والميتوكوندريا كاليفورنيا 2+ امتصاص الكالسيوم الناجم عن إطلاق 2+ من مخازن داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم هذه المنهجية لاختبار الأدوية المؤثرة في الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ الزائد يمكن أن تكون ذات فائدة لالعصبية ضد التحفيز الزائدة.
الشكل 1: إجراء لعزل الفئران الأساسي الخلايا العصبية قرن آمون (A) بولي-D-ليسين، تم إعداد 12 ملم الزجاج المطلي coverslips في طبق بتري ونقل أخيرا إلى طبق 4 جيدا. (B) عرض الظهرية من الدماغ الفئران. خط منقط يشير حيث ينبغي خفض الانتاج. (C) الحصول على النحوuspension الخلايا العصبية الحصين الابتدائية. بعد إزالة الحصين، يتم الحصول على تعليق خلية. ومطلي ثم الخلايا في الأطباق 4-جيد يحتوي على بولي-D-يسين coverslips المغلفة. (D) برايت صورة الميدان تظهر الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الأولية في الثقافة. شريط يمثل 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: NMDA يزيد عصاري خلوي تم تحميلها [كا 2+] في الخلايا العصبية الحصين قصيرة والخلايا العصبية الحصين مثقف طويلة الأمد مع fura2 / AM وتعرض للتصوير مضان. تظهر الصور صور تمثيلية مشرق الميدان وpseudocolor (نسبة F340 / F380) قصيرة الأجل (A) وطويلة الأجل (B 2+] (يتم عرض جداول pseudocolor في الأسفل). تظهر آثار تمثيلية والتسجيلات وحيدة الخلية من عصاري خلوي [كا 2+] ردا على 100 ميكرومتر NMDA في المدى القصير (A) وطويلة الأجل (B) الخلايا العصبية الحصين مثقف. لاحظ أن عصاري خلوي [كا 2+] زيادات أكبر بكثير في المدى الطويل من الخلايا العصبية في تربيتها على المدى القصير. شريط يمثل 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: NMDA يدفع الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ الزائد في الخلايا العصبية الحصين الحصين neur مثقفو transfected الوظائف مع تقارب منخفضة، الميتوكوندريا aequorin المستهدفة تنصهر إلى GFP، حضنت مع 4 ميكرومتر coelenterazine وتعرض للتصوير تلألؤ بيولوجي من الميتوكوندريا [كا 2+]. تظهر الصور مضان (GFP) والانبعاثات الضوئية المتراكمة (aequorin تلألؤ بيولوجي) صور القصير ممثل (A) وطويلة الأجل (B) الخلايا العصبية الحصين مثقف. يتم ترميز شدة استضاءة في pseudocolor (1-16 الانبعاثات الضوئية لكل بكسل). وتشير التسجيلات الإفراج عن الانبعاثات الضوئية (معبرا عنه الميتوكوندريا [كا 2+]) في القصير (A) وطويلة الأجل (B) الخلايا العصبية الحصين مثقف. NMDA 100 ميكرومتر زيادة الميتوكوندريا [كا 2+] في الخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين الشباب ولكن ليس في الخلايا العصبية الحصين مثقف. شريط يمثل 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </ أ>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ارتبط في إعادة بناء الكالسيوم داخل الخلايا 2+ التوازن في المخ من الشيخوخة إلى فقدان المعرفية، وزيادة التعرض للنقص تروية الضرر، التحفيز الزائدة والتنكس العصبي. لتحقيق هذه الفرضية في المختبر، تتوفر إجراءات التصوير الكالسيوم 2+. للأسف، ثقافات قابلة للحياة الخلايا العصبية الحصين القديمة لا يمكن التعويل عليها. في الآونة الأخيرة، فقد لوحظ أن الثقافات على المدى الطويل من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران العديد الحالي من السمات المميزة نموذجية الشيخوخة في الجسم الحي بما في ذلك تراكم ROS، تشكيل حبيبات يبوفوسين، بؤر heterochromatic، وتفعيل pJNK والبروتين p53 / مسارات P21، وفقدان الكولسترول، و يغير كثافة قنوات الكالسيوم 2+ وNMDA مستقبلات 14. وفقا لذلك، تجارب التصوير الكالسيوم 2+ في الثقافات الصغار والكبار من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران قد يقدم فكرة جديدة من الكالسيوم 2+ إعادة عرض في المخ من الشيخوخة. وهناك شرط أن أمر حاسم لزراعة hippocaالخلايا العصبية mpal على المدى الطويل هو اثنين أضعاف. أولا، من المهم لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة منخفضة جدا كما هو مذكور أعلاه. ثانيا، يتم استزراع الخلايا في استكمال Neurobasal المتوسطة دون تغيير المتوسطة. يسمح هذا النهج وجود الدبقية ولكن تجنب مفرط نموها. ويرد التخطيطي لمثل هذه الثقافة في الشكل 1.
التصوير مضان مع الاصطناعية الكالسيوم 2+ تحقيقات يسمح رصد عصاري خلوي [كا 2+] في الخلايا العصبية الفردية 19. استخدام هذا النهج في الخلايا العصبية الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين ويسمح لرصد التغيرات في الردود مع التقدم في العمر في مجال الثقافة. على سبيل المثال يبين الشكل 2 حقل مشرق نموذجي والصور الكالسيوم 2+ للزيادات في [كا 2+] يسببها CYT من قبل NMDA في الخلايا العصبية والخلايا العصبية من الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين الثقافات. لاحظ أن استجابات الخلايا العصبية في سن أكبر بكثير من الخلايا العصبية في الشباب. ومع ذلك، فإن هذا الإجراء لا يمكن الاعتماد عليها ل[كا 2+] القياسات داخل عضيات التحت خلوية كما، على سبيل المثال، الميتوكوندريا، حيث [كا 2+] قد تختلف من تحت ميكرومتر إلى فوق مستوى ملي. في تلك الحالات، والبروتين على أساس، وقد تم تطوير الاختبارات التي تستهدف الميتوكوندريا كما، على سبيل المثال، aequorin. هذا التحقيق المثير للاهتمام بشكل خاص منذ تفضيله ل Ca 2+ يمكن ضبطها بدقة لرصد [كا 2+] ظروف مثل تلك التي وصلت داخل الميتوكوندريا في الراحة وحفزت منخفضة جدا أو مرتفعة جدا، على التوالي. على وجه التحديد، فمن الممكن لتحديد إما نوع aequorin البرية أو aequorin تحور دون الكالسيوم 2+ مواقع الربط لتعديل النسب. ويتحقق صقل عندما يتم استخدام coelenterazines مختلفة (النوع البري، ح، ن) في تركيبة مع aequorins مختلفة 17. ومع ذلك، في حين أن استخدام مضان للتصوير الكالسيوم 2+ على نطاق واسع، ورصد تلألؤ بيولوجي ليست واضحة، وربما تحتاج الفوتون كاميرات العد. لحسن الحظ، aequorinتحقيقات، مثل تلك المستخدمة هنا، قد تحسنت للمشاركة في التعبير عن GFP 18 مما يجعلها أكثر استقرارا، وقادرة على الافراج عن مزيد من الانبعاثات الضوئية والسماح تحديد بسيط من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل من قبل GFP المرتبطة مضان. النجاح في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي في الخلايا العصبية لا يتوقف فقط على كفاءة الكاميرا الفوتون العد المستخدمة ولكن أيضا على كفاءة ترنسفكأيشن لجنة التحقيق التي تستهدف الميتوكوندريا. في حالة الخلايا العصبية قرن آمون، وهو ترنسفكأيشن الكيميائية بسيط يصنع عمل شريطة أن تكون حساسة كاميرا عالية الفوتون العد متاح. ويبين الشكل 2 أمثلة من حقل مشرق، GFP مضان والصور تلألؤ بيولوجي من الشباب والذين تتراوح أعمارهم في الخلايا العصبية ثقافة الحصين. وثمة أيضا الزيادات في الميتوكوندريا [كا 2+] الناجمة عن NMDA المسجلة في الخلايا العصبية الحصين transfected. لاحظ أن تأثير NMDA هو أكبر من ذلك بكثير في الخلايا العصبية مثقف الذين تتراوح أعمارهم بين من الخلايا العصبية في الشباب. في حالات أخرى، كفاءة transfecويمكن زيادة نشوئها باستخدام ناقلات المشتقة من فيروس 16،18. بدلا من ذلك، وضع الفئران المعدلة وراثيا إيواء القائم على البروتين، الكالسيوم التحت خلوية 2+ تحقيقات هو خيار الناشئة عن نهج المستقبل، وربما حتى في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Culture Medium | Gibco | 21103-049 | |
| HBSS medium | Gibco | 14170-088 | |
| Ham's F-12 medium | Gibco | 31330-038 | |
| DNase I (from bovine pancreas) | Sigma | D5025-15KU | |
| Fetal Bobine Serum | Lonza | DE14-801E | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-032 | |
| 12 mm glass coverslips | Labolan | 0111520/20012 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| 4-well multidish plaques | Nunc | 176740 | |
| Petry dishes | JD Catalan s.l. | 2120044T | |
| Sterile pipettes | Fisher Scientific | 431030 | |
| Fura2-AM | Life Technologies | F1201 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Coelenterazine n | Biotium | BT-10115-2250 uG | |
| Digitonin | Sigma | D5628 | |
| NMDA | Sigma | M3262 | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss Inc. | ||
| Xcite ilumination system | EXFO | ||
| ORCA ER fluorescence camera | Hamamatsu | ||
| VIM photon counting CCD camera | Hamamatsu | ||
| VC-8 valve controller | Warner Instruments | ||
| SH-27B heating system | Warner Instruments | ||
| Aquacosmos Software | Hamamatsu Photonics |
References
- Sattler, R., Tymianski, M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).
- MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones. Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).
- Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).
- Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).
- Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium. Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).
- Liu, Y., et al. NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo. The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).
- Zhou, M., Baudry, M. Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).
- Brewer, L. D. Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels. Brain Research. 1151, 20-31 (2007).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).
- Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake. Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).
- Pivovarova, N. B., et al. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).
- Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).
- Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives. Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).
- Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro. Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).
- Brini, M., et al. Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation. The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).
- Villalobos, C., Alonso, M. T., Garcìa-Sancho, J. Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles. Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).
- Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).
- Rogers, K. L., et al. Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters. The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).
- Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).
