Långtids Kateterisering av tarm Lymph Trunk och Insamling av lymfa i neonatala grisar

Introduction

Det lymfatiska systemet är ett understudied område i fysiologi. Prekliniska modeller av lymfatisk kateterisering förekommer i olika djurarter ^1-8 och används av läkemedelsindustrin och forskningsinstitutioner för att undersöka mekanismer som är involverade i lipid ^8-12 och läkemedelsmetabolism ^13-15, cancermetastaser ¹⁶ med experimentell behandling ^17, och immunförsvaret ^{18 -26.} Denna studie undersöker användningen av intestinala lymfa stammen kateterisering i en tamsvin modell för att mäta komponenter i lipoprotein metabolism. Lipoproteinmetabolism är inblandade i produktionen och utsöndringen av kylomikroner, liksom förändringar i samband lipider och totalt protein. Dessa är viktiga faktorer eftersom det finns stora skillnader i lipidmetabolismen mellan vanligen används gnagarmodeller och människor och som sådan, som sysselsätter svinmodeller för att samla in tarm lymfa skulle kunna ge mer jämförbar information för att studera lipid migtabolism hos personer ^27-31.

Flera kirurgiska tekniker används för att samla tarm lymfan i stora djurarter: en hjärn skuldra strategi (dvs bröstgången kateterisering) ^5, en lateral riktning övre flanken ^32-34, och en ventrala mittlinjen eller para tillvägagångssätt ^22,35. Denna video beskriver i detalj det kirurgiska ingreppet i svin med hjälp av en ventrala mittlinjen kirurgisk metod för kateterisering av tarm lymfa stammen. Noggranna kirurgiska tillstånd teknik denna metod för lymfatiska kateterisering för att samla in stora mängder av lymfa och dess beståndsdelar under långa tidsperioder.

Denna teknik öppnar en myriad av applikationer till många discipliner som undersöker olika fysiologiska funktioner. Applikationer kan inkludera, men är inte begränsade till, hela kroppen lipoprotein och lipidmetabolism, immunosurveillance, tumör genes och metastas, tarmfunktion, och Development och progression av tarm inflammatorisk sjukdom.

Protocol

Alla förfaranden på försöksdjur beskrivs i både video- och manuskript har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén och följt de riktlinjer som den kanadensiska rådet Animal Care.

1. Kirurgisk anestesi och kirurgisk Framställning av neonatala grisar

1. I en separat hall, premedicate 25 kg grisar nära basen av halsen med en intramuskulär lugnande-bedövningsmedel drogcocktail innehållande: azaperon (0,3 mg / kg), ketamin hydroklorid (10 mg / kg), dexmedetomidin (15 mikrogram / kg).
   Obs: Lägg buprenorfin (0,005 till 0,02 mg / kg) i pre-narkosmedel drogcocktail för ökad intra-operativ smärtkontroll.
2. Söva grisar med inhalerade isofluran inandning gas (4-5% isofluran på 500 ml-1000 ml / min _O2) med hjälp av en ansiktsmask. Visualisera stämbanden med hjälp av en veterinär laryngeal omfattning (17-25 cm lång rak blad), och tillämpa aktuella 10% lidokain spay till sångsladdar. Låt lidokain spray för att kontakta stämbanden 30-60 sek före intubation att minska risken för stämbandskramp och luftvägshinder.
3. Intuberas grisarna genom att en kuffad endotrakealtub (5,0-7,0 mm innerdiameter (ID)) mellan stämbanden och upprätthålla anestesi med isofluran gas (0,5-2,0% isofluran vid 1,000-2,000 ml / min _O2) med hjälp av en sluten krets återandningssystemet i hela operationen. Bedöma nivån av anestesi genom käken ton, och båda pedal och ögonlocksreflexer svar. Utgångna anestesigas spolas och avluftas utanför operations svit.
4. Rengöra den yttre ytan av örat med 2,0% klorhexidin kirurgisk skrubblösning följt av en 70% isopropylalkohol sköljning. Med en 20 G intravenös kateter, ANVÄNDA KATETER en öronven för att ge intravenösa vätskor (lakterad Ringers lösning; 5-10 ml / kg / h) under kirurgi. Säkra en pulsoximeter på slemhinneytan av tungan med MediCal tejp för att övervaka hjärtfrekvensen och mättnaden av syre perifert blod (SpO _2).
5. Placera sövda grisen i ryggliggande ställning och raka ventrala buken från mitten bröstkorgen kaudalt till den ventrala aspekten av pubis. Rengör detta område med två alternerande 2,0% klorhexidin kirurgisk buskmarker och sterila vattentvättar.
6. Överför bedövade grisen till operations sviten och tillämpa den slutliga kirurgiska scrub av 70% isopropylalkohol skölj, låt det torka och sedan drapera djuret.
7. Sätt en rektal temperaturgivare ca 2-4 cm in i ändtarmen för att övervaka kroppstemperaturen. Placera grisar på en vattencirkulationsvärmedyna för att upprätthålla normal kroppstemperatur (38-40 ° C) under kirurgiska ingrepp.
8. Drapera gris med fyra handdukar draperier placeras i ett överliggande kvadrant mönster runt buken. Placera första draperings tvärs xiphisternum, den andra draperings längs laterala delen av buken ungefär 5 cm lateralt till den abdominala mittlinjen. Placera den tredje duken tvärs den ileala krönet av bäckenet och den fjärde drapering, liksom den andra draperings (även på den motsatta sidan), är placerad längs den laterala sidan av buken ca 5 cm lateralt till den abdominala mittlinjen.
9. Placera en stor tabell drapering, med en slits-öppning som ger tillgång till det kirurgiska stället, över de underliggande handduks draperier och täcka gris och hela operationsbordet. Den slutliga duken är en engångs Steri-drapera placeras över det stora bordet drapera.

2. bukkirurgi och Kateterisering av tarm Lymphatic Trunk

1. Gör en 20 cm hud snitt med ett skalpellblad för att exponera de underliggande magmusklerna. Incise buken muskelskikt med mono-polär diatermi (20 inställning Watt) för att exponera parietal peritoneum. Öppna en 20 cm linjär segment av parietal peritoneum med Metzenbaum sax för att få tillgång till buken inälvor och lymfkärl.
2. Fukta alla vävnader med varmt (37 ° C) steril saltlösning för hela kirurgiska proceduren. Lyft försiktigt en stor del av tarmen, inklusive kolon, blindtarmen, ileum och jejunum från bukhålan och exteriorize den till vänsterkanten av grisen att få tillgång till den övre delen av buken, levern och lymfkärl. Säkra exteriorized tarmen på plats med ytterligare handduk draperier för att bilda en sele för att försiktigt stöd tarmen.
3. Leta upp lymfkärl, lägger det ca 4 cm kranial-mediala av rätten renal ven, 6 cm kaudalt-medial- ventrala av cava förmän och under visceral aspekt av rätten lever lob nära bukspottkörteln ^22,36,37. Identifiera lymfkärl som en genomskinlig struktur intill till höger ventrala segment av portvenen ^36,37.
4. Separera det lymfatiska vessel från de omgivande fascia genom att försiktigt retas bort den bifogade vävnad med Q-tip applikatorer. När de laterala aspekterna av kärlet separeras från den omgivande vävnaden, skapa en "tunnel" öppning under fartyget med fina trubbiga lutad pincett.
5. Passera tre 2-0 silke suturer under lymfkärl med fin pincett. Ligera mest caudal sutur först att täppa, vidga och fylla kärlet med lymfan. Målmedvetet lämnar ändarna av denna sutur relativt lång (4 cm) för att fästa katetern till det lymfatiska kärl. Placera två andra suturer separerade 1,0 cm från varandra och är ca 1,0-1,5 cm kraniala till det säkra caudal sutur. Lämna dessa två suturer med en "enda lös ligatur slips" för att möjliggöra snabbare säkring av katetern in i kärlet.
   Obs: Den del av det lymfatiska fartyg som ligger mellan de mest caudal ligering sutur och mitt sutur (av de två kraniala suturer) är platsen för kateterisering. avseende suTure material, kan 2-0 polyglaktin sutur ersätta 2-0 silke suturer om det behövs.
6. Skär ett litet hål in i kärlet med iris sax och vidga kärlet med fina trubbiga pincett. Infoga ca 1,0-1,5 cm av specialiserad kateterrör (4,06 Yttre diameter (OD) x 2,31 mm ID) med en avfasad ände in i kärlet och knyta de två kraniala suturer för att fästa katetern på plats. Använda de långa sutur ändarna av den kaudala sutur för att säkra katetern till kärlet.
7. Tvätta exteriorized tarmen med kopiösa mängder varm saltlösning och försiktigt tillbaka den till bukhålan säkerställa korrekt anatomisk placering av tarmen.
8. Exteriorize katetern till vänster mitten flanken (5-10 cm ventralt från Hålrummet). Göra en hud incision med en skalpell och passera en trokar från bukhålan på hudytan för att skapa en öppning för exteriorisering av katetern. Använd en stor Kelly pincett för att exteriorize katetern från buken cavIty genom trokaren öppningen.
9. Stäng parietal peritoneum med en enkel kontinuerlig sutur mönster av 2-0 polyglaktin sutur med en rund (avsmalnande) nål. Stäng buken muskelskikt med en enkel avbruten sutur mönster med en 2-0 polyglaktin sutur på en rund nål.
10. Stäng huden i en subkutikulär mönster med 2-0 polyglaktin sutur på en styckning nål. Fäst exterioriserad katetern till huden med en handväska sträng sutur mönster och en 2-0 nylon sutur på en styckning nål.
11. Placera en specialiserad jacka på grisen samtidigt sövda för att underlätta dess placering och minska stressen i grisen under återhämtning.

3. Post-kirurgisk återhämtning och lymfa Collection

1. Cirka 10 minuter före utsättande av inhalationsanestesi, administrera bupenorphine (0,1 mg / kg) intramuskulärt för att ge omedelbart efter kirurgi smärtlindring. Fortsätt bupenorphine (0,1 mg / kg) var 12 h för 24-48 timmar för att upprätthållaefter operationen analgesi.
2. Övervaka grisarna för postoperativa komplikationer varje 8-12 timmar för en 7-dagars period.
3. Samla lymfan i 500 ml polypropen tvättflaskor, belagd med etylendiamintetraättiksyra (EDTA), och kompletterat med antibiotika; penicillin (6000 lU), streptomycin (6 mg) och amfotericin B (3 mg) varje 12 h under en 7-dagarsperiod.

4. Kvantifiering av lipoprotein ApoB48, triglycerider, kolesterol och totalt protein Insamlade från Lymph

1. Centrifugera lymfan provet vid 1800 xg under 5 min vid 4 ° C. Samla in supernatanten och använda den för kvantifiering av triglycerid, kolesterol och totalt protein.
2. Dela upp supernatanten i tre prover: ett outspätt prov, ett prov utspätt 1:20 destillerat vatten och ett slutligt prov utspädd 1: 100 med destillerat vatten.
3. Använd outspädd vätskan för att mäta kolesterolnivåer, med ett kommersiellt tillgängligt kit.
4. Använd 01:20 och 01:100 utspädda prover för att mäta triglycerid och den totala proteinnivåer med ett kommersiellt tillgängligt kit och bicinkoninsyra-total proteinanalys respektive.

5. Kvantifiering av lipoprotein ApoB48, Collected från Lymph ³⁸

1. Bestäm koncentrationen av lipoprotein ApoB48 med en anpassad immun Western blotting metod ^38. Separat totala lymfa med 3-8% tris-acetate- natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE).
2. Överföra de separerade proteinerna till en polyvinylidenfluorid-membran (0,45 ^ m) och inkubera dem med en get polyklonal antikropp till ApoB (1: 4000), och sedan binda den med en anti-get-sekundär antikropp.
3. Kvantifiera lipoprotein ApoB48 med kemiluminiscens med hjälp av en linjär densitometrisk jämförelse med renat gnagare ApoB48 proteinstandard.

Representative Results

Lymfatiska kateterisering av tarm lymfatiska stammen av neonatala grisar möjliggör insamling av ungefär 1 L / 24 h av central lymfa under en 7-dagarsperiod. Lymfan samlas in på detta experiment innehöll komponenter av lipidmetabolismen, nämligen total lymfa protein, ApoB48 lipoprotein, triglycerider, totalt protein och kolesterol. Tabell 1 belyser representativa mängder av dessa lipidkomponenter från poolade lymfkörtlar prover av tre grisar. Noterbart är lymfflödet och lipid komponenterna är i linje med värden i centrala lymfa rapporterats av andra forskare efter kateterisering av tarm lymfkärl (lymfa flöde 570 ± 158 till 979 ± 284 ml / 24 h ^25, 360 ± 120 MLL / 24 h till 1080 ± 720 ml / 24 h ^26, triglycerider 687 ± 110 mg / dl ^9, kolesterol 63,1 ± 5,6 mg / dL ^9); vilket indikerar korrekt placering av katetern i det lymfatiska kärlet.

INNEHÅLL "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2. En Snabb Protein Liquid Chromatography (FPLC) profil som visar renheten hos kylomikron beredningen i neonatal gris intestinala lymfa. Lymfa samlas in från tre grisar separeras med hjälp av en 1,006 g / ml densitetsgradient ultracentrifugering protokoll. Profilen visar en enda topp för (A) kolesterol och (B) triglycerid i lymfan provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1. En representativ Western blot-analys visar bidrag ApoB48 och apoB100 lipoproteiner i neonatal gris intestinala lymfa. Lymph samlats in från tregrisar separeras med användning av en 1,006 g / ml densitetsgradient-ultracentrifugering protokoll. Figuren visar en liten mängd föroreningar med ca 15% av plasma härledd apoB100. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

	lymfa Kännetecken
ApoB48 (mg / ml)	3022,4 ± 440,4
Triglycerid (mg / dl)	607 ± 203,6
Kolesterol (mg / dl)	58,5 ± 9,6
Resultaten uttrycks som medel ± SD (n = 3)

Tabell 1. Komponenter i tarm lymfa som samlats in från neonatala grisar 7 dagar efter operation. Resultaten upprepade meader av lymfa och uttryckt som medelvärde SD (n = 3)

Discussion

Samla tarm lymfa är en utmärkt metod för att undersöka mekanismer som är involverade i lipid ^8-12 och drog ^13-15 metabolism, cancermetastaser ^16,17, cellhandel och immunfunktion ^18-26, i olika experimentella djurmodeller. I själva verket har förmågan att skörda stora mängder av antingen perifera (afferent) och centrala (efferenta och stora stamfartyg) lymfa under en längre tid varit särskilt viktigt för att förstå tids förändringar som sker i cellpopulationer följande utmaningar med immunmodulerande medel ^{18-22 , 25,26.} På liknande sätt har samling av centrala lymfa varit till hjälp i avgränsar processer i lipoprotein metabolism ^8-12. Användbarheten av lymfa samling är beroende av framgången med kateterisering förfarandet och öppenheten hos katetern inuti det lymfatiska kärlet.

Kateterisering av de stora lymfkärl som är involverade iintestinal lymfdränage i stora djur använder i allmänhet en av tre kirurgiska metoder. Den första tekniken använder en kraniell axel strategi för att komma in i bröstgången ligger över gemensamma halsvenen (ko bröstgången) ^5. Den andra använder en övre flank strategi över mitten sido aspekt av den högra njuren ^32,33. Den tredje teknik som beskrivs i denna video använder antingen en ventrala mittlinjen eller para ^22,35 laparotomi att exponera intestinala lymfatiska stammen nära bukspottkörteln och intill till höger ventrala aspekten av portvenen ^22,36,37. Även om både den övre flanken och ventrala mittlinjen kirurgiska tekniker möjliggör kateterisering av tarm lymfatiska bålen, tror vi den ventrala mittlinjen metod ger bättre exponering av fartyget med tillräckligt utrymme i den övre delen av buken för att hantera och manipulera fartyget.

Viktigt, som i alla experimentell kirurgi det finns åtgärder som är partiskilt avgörande för det framgångsrika resultatet av den experimentella proceduren. Det finns fyra nyckelområden som kräver noggrann uppmärksamhet med hjälp av den ventrala mittlinjen metod för att få tillgång till tarm lymfkärl. Först utmärkt blodtillförseln till exterioriserad tarmen krävs, såsom långvarig äventyras cirkulationen i tarmen inducerar ischemisk tarmslemhinnans nekros och kirurgiska fel. I detta förfarande en "handduk sling" minskar spänningen på mesenteriala blodkärl genom att stödja vikten av tarmen säkerställer utmärkt vävnadsperfusion. För det andra, noggranna manipulationer av fartyget inklusive: är avgörande för framgångsrik kateterisering frisläppandet av fartyget från omgivande fascia och fettvävnad, sätta in och stadigt fästa katetern i kärlet för långsiktig lymfa samling. I själva verket är det föreslås att den strukturella integriteten av fartygen i neonatala grisar är inte så robust som i vuxna djur och som sådan kan lätt riva ^39,40 41, är det mycket svårt att ta bort koagel från katetern som koaglet utvecklas inuti katetern och är djupt rotad i den lymfatiska kärlet. Följaktligen kommer detta i hög grad minska (ca 40%) av antalet djur framgångsrikt kateter för långsiktig experiment (opublicerade data). Därför, om lymfflödet bromsas eller har upphört under förfarandet, det lymfatiska katetern bör återinföras cranially 0,5-1 cm från den ursprungliga kateterisering plats.

Alla modeller som används för att undersöka vetenskapliga frågor har inherant begränsningar och kateterisering av tarm lymfatiska stammen är inget undantag. Den mest uttalad begränsning för förfarandet är oförmågan att effektivt isolera, ANVÄNDA KATETER det lymfatiska kärl, och stabilisera katetern inuti kärlet. Som sådan kräver människor med utmärkta tekniska och kirurgisk skicklighet detta förfarandes. En annan viktig begränsning är att förlängda kirurgiska gånger under större bukoperation ökar risken och postoperativ morbiditet och mortalitet. Noterbart är dock grisarna i vårt experiment återhämtade sig snabbt från kirurgi och det fanns inga komplikationer såsom infektioner, tarm ileus, överdriven vävnadsskada, eller aptitlöshet efter förfarandet. Sannerligen, var grisarna observerades vara ljusa, lyhörd, ambulerande och äta normalt 24 timmar efter operationen och detta fortsatte under 7 dagar lymfa insamlingsperioden. Noterbart är även serumkemi eller fullständigt blodstatus inte bedömdes i dessa svin efter 7 dagars experiment, tidigare arbete av utredarna i långsiktig lymfa samlingen i får ⁴¹ visade att kateter får var aldrig leukopenic, lymfopen, hypoproteinemic med elektrolytobalans eller kliniskt porträttera dålig hälsa (opublicerade data). Viktigt och som nämnts ovan, korrelerar denna iakttagelse att catheteriZed grisar uppvisar också kliniska egenskaper för god hälsa.

Intressant, utredare noterade variationer i volym lymfflödet. Flödet var störst under dagen när grisar utfodring och aktiv med cirka 70% av den dagliga insamlade lymfan uppträder vid denna tidpunkt. De återstående 30% av lymfa flöde händer på kvällen under vila och sömn.

Ytterligare karakterisering av lymf prover ges i figurerna 1, 2 och Tabell 1. Figur 1 visar en liten mängd kontaminering med ca 15% av plasma härledd apoB100. Närvaron av plasma lipoprotein inom tarm lymfa är en observation som ofta förekommer hos svin ^42. I spädgrisar, är huvuddelen av lipoproteinet som produceras av levern och frigörs i plasma. Från plasma, apoB100 sipprar sannolikt in i samla lacteals ⁴² och sedan genom det lymfatiska vaskulära nätverketrinner ut i tarm lymfatiska stammen. Olika metoder för kromatografi används för att bedöma kolesterol, triglycerider och andra fosfolipid-innehållet i insamlade lymfa prover ^42-45. Den enda topp i figur 2 visar tydligt kolesterol och triglycerider är närvarande i kylomikron fraktionen. Denna metod är en bekväm och korrekt teknik för profilering lymfan lipoproteiner och bör beaktas vid bedömningen renhet kylomikron prover från tarm lymfa ^45. Slutligen Tabell 1 ger de biokemiska komponenterna av intestinal lymfa samlas in från neonatala grisar 7 dagar efter kirurgi.

Sammanfattningsvis är långsiktig kateterisering av tarm lymfa trunk framgångsrik i unga grisar. Med denna teknik kan lymfatiska kateterisering användas för att samla och undersöka komponenterna i lipidmetabolismen. Renheten av lymfa, mängd lymfa produceras och mängder av beståndsdelar av lipidmetabolismliknar mängderna i svin central lymfa i andra experiment ^9,25,26,42. Resultaten tyder på att anställa en ventrala mittlinjen kirurgisk metod med noggrann vävnad dissektion och kärlhantering ANVÄNDA KATETER tarm lymfatiska stammen i unga grisar är en utmärkt metod för att samla in stora mängder i centrala lymfa.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay