Langsigtet kateterisation af Intestinal lymfeknuder Trunk og Indsamling af lymfeknuder i neonatale Pigs

Introduction

Lymfesystemet er et dublerede område fysiologi. Prækliniske modeller af lymfe kateterisation forekomme i forskellige dyrearter ^1-8 og bruges af medicinalindustrien og forskningsinstitutioner for at undersøge mekanismer, der er involveret i lipid ^8-12 og lægemiddelmetabolisme ^13-15, kræft metastaser ¹⁶ med eksperimentel behandling ^17, og immunforsvar ^{18 -26.} Denne undersøgelse undersøger anvendelsen af ​​intestinal lymfeknuder trunk kateterisering i en tamsvin model til at måle komponenter af lipoproteinmetabolismen. Lipoprotein metabolisme er involveret i produktion og sekretion af chylomikroner, samt ændringer i tilknyttede lipider og totalt protein. Det er vigtige overvejelser, som der er store forskelle i lipidmetabolisme mellem almindeligt anvendte gnaver modeller og mennesker, og som sådan, beskæftiger svin modeller til at indsamle tarm lymfeknuder kunne give mere sammenlignelige oplysninger for at studere lipid migtabolism i mennesker ^27-31.

Adskillige kirurgiske teknikker anvendes til at opsamle den intestinale lymfeknuder i store dyrearter: en kraniel skulder tilgang (dvs. ductus thoracicus kateterisering) ^5, en lateral øvre flanke tilgang ^32-34, og en ventral midtlinje eller paramedian tilgang ^22,35. Denne video beskriver detaljeret den kirurgiske procedure hos svin under anvendelse af en ventral midtlinje kirurgisk tilgang til kateterisation af tarmens lymfeknuder stammen. Omhyggelige kirurgisk teknik tillader denne metode af lymfatisk kateterisation at indsamle store mængder af lymfe og dets bestanddele i længere tid.

Denne teknik åbner et utal af ansøgninger til mange discipliner undersøger forskellige fysiologiske funktioner. Applikationer kan omfatte, men er ikke begrænset til, hele kroppen lipoprotein og lipidmetabolisme, immunosurveillance, tumorgenese og metastase, tarmfunktion og development og progression af intestinal inflammatorisk sygdom.

Protocol

Alle procedurer på forsøgsdyr beskrevet i både video og manuskriptet blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg og fulgte de retningslinjer, som den canadiske Råd Animal Care.

1. Kirurgisk Anæstesi og Kirurgisk Forberedelse af Neonatal Svin

1. I en adskilt forrum, premedicate 25 kg svin nær bunden af ​​halsen med en intramuskulær sedativ-bedøvelsesmiddel lægemiddelcocktail indeholdende: azaperon (0,3 mg / kg), ketaminhydrochlorid (10 mg / kg), dexmedetomidin (15 ug / kg).
   Bemærk: Tilføj buprenorphin (0,005-0,02 mg / kg) i præ-anæstetisk lægemiddelcocktail for øget intra-operative smerter kontrol.
2. Bedøver grisene med inhaleret isofluran inhalation gas (4-5% isofluran ved 500 ml-1000 ml / min O ₂₎ ved anvendelse af en ansigtsmaske. Visualiser stemmebånd ved hjælp af en veterinær larynx omfang (17-25 cm lange lige klinge), og anvende aktuel 10% lidocain spay til vokalledninger. Lad lidocain spray til at kontakte stemmebånd 30-60 sek før intubation at reducere muligheden for vokal snor spasmer og luftvejsobstruktion.
3. Intubere grisene ved at føre en håndjern endotrakealtube (5,0-7,0 mm indvendig diameter (ID)) mellem stemmebåndene og vedligeholde anæstesi med isofluran gas (0,5-2,0% isofluran ved 1.000-2.000 ml / min O ₂₎ med en lukket kredsløb genindånding bedøvelsesmiddel system i hele operationen. Vurdere niveauet af anæstesi ved kæben tone, og begge pedal og øjenlågsreflekser svar. Udløbet bedøvende gas indfanges og udluftet uden for kirurgiske suite.
4. Rens den ydre overflade af øret med 2,0% klorhexidin kirurgisk krat opløsning efterfulgt af en 70% isopropylalkohol skyl. Med en 20 G intravenøst ​​kateter, selvkaterisation en ørevene at tilvejebringe intravenøse væsker (Ringerlaktat opløsning; 5-10 ml / kg / time) under operationen. Skaf et pulsoximeter til slimhindeoverfladen af ​​tungen med withical tape til at overvåge puls og mætningen af perifert blod iltning (SpO _2).
5. Placer bedøvede gris i en dorsal liggende stilling og barbere den ventrale maven fra midten thorax kaudalt til den ventrale aspekt af pubis. Rengør dette område med to skiftevis 2,0% klorhexidin kirurgiske krat og sterile vand vaske.
6. Overfør bedøvet gris til den kirurgiske suite og anvende den endelige kirurgiske krat på 70% isopropylalkohol skyl, lad det tørre, og derefter drapere dyret.
7. Indsæt en rektal temperatur sonde ca. 2-4 cm ind i endetarmen for at overvåge kropstemperaturen. Placer svin på en vand recirkulerende varmepude til at opretholde normal kropstemperatur (38-40 ° C) under kirurgisk procedure.
8. Drapere gris med fire håndklæder gardiner anbragt i et overliggende kvadrant mønster omkring maven. Anbring den første drapere tværs xiphisternum, den anden drapere langs laterale side af maven ca. 5 cm lateralt til den abdominale midterlinjen. Placer tredje afdækningsstykke tværs af ileal crest af bækkenet og den fjerde afdækningsstykke, ligesom det andet afdækningsstykke (selv på den modsatte side), er langs laterale side af maven ca. 5 cm lateralt for den abdominale midterlinjen.
9. Placer en stor tabel afdækningsstykke, med en slids-åbning, der tillader adgang til det kirurgiske sted, i løbet af de underliggende håndklæde gardiner og dækker grisen og hele kirurgisk bord. Den endelige drapere er en engangs Steri-drapere placeret over det store bord drapere.

2. abdominal kirurgi og kateterisation af Intestinal lymfatisk Trunk

1. Lav en 20 cm incision i huden med en skalpel til at afsløre de underliggende mavemuskler. Incise de abdominale muskler lag med mono-polar elektrokauterisation (20 watt indstilling) at eksponere parietal peritoneum. Åbn en 20 cm lineært segment af parietal peritoneum med Metzenbaum saks for at få adgang til abdominale organer og lymfekar.
2. Fugt alle væv med varmt (37 ° C) sterilt saltvand for hele kirurgiske procedure. forsigtigt løfte en stor del af tarmen, herunder tyktarmen, coecum, ileum og jejunum fra bughulen og eksteriorisere den til venstre flanke af rørrenseren at få adgang til øvre abdomen, lever og lymfekar. Fastgør blotlagt tarmen på plads med yderligere håndklæde gardiner til at danne en slynge til forsigtigt at støtte tarmen.
3. Find den lymfekar, det lægger ca. 4 cm kraniel-mediale af retten renal vene, 6 cm caudale-medial- ventrale af de caVal formænd og under antiamerikanisme aspekt af retten leveren lap nær bugspytkirtlen ^22,36,37. Identificer lymfekar som en gennemskinnelig struktur sammenstillet til højre ventrale segment af portalen vene ^36,37.
4. Adskil lymfe Vessel fra de omgivende fascia ved forsigtigt drille væk vedlagte væv med Q-tip applikatorer. Når de laterale sider af fartøjet er adskilt fra det omgivende væv, skabe en "tunnel" åbning under fartøjet med fine stump spids pincet.
5. Pass tre 2-0 silkesuturer under lymfekar med fine tænger. Ligere mest caudale sutur først at lukke, spile og fylde beholderen med lymfe. Målrettet forlade enderne af denne sutur forholdsvis lang (4 cm) for at fastgøre kateteret til det lymfatiske kar. Placer to andre suturer adskilt 1,0 cm fra hinanden og er ca. 1,0-1,5 cm kraniel til den sikrede caudale sutur. Lad disse to suturer med en enkelt løs ligatur slips 'at give mulighed for hurtigere sikring af kateteret ind i karret.
   Bemærk: segment af lymfekar placeret mellem de mest caudale ligering sutur og midterste sutur (af de to kranielle suturer) er stedet for kateterisation. Med hensyn til suklatur materiale, kan 2-0 polyglactin sutur erstatte 2-0 silkesuturer hvis det kræves.
6. Skær et lille hul i beholderen med iris saks og spile skibet med fine stumpe pincet. Indsæt ca. 1,0-1,5 cm af specialiserede kateterrør (4,06 Udvendig diameter (OD) x 2,31 mm ID) med en affaset ende ind i beholderen og binde de to kraniale suturer for at fastgøre kateteret på plads. Brug lange suturender af den kaudale sutur for at fastgøre kateteret til fartøjet.
7. Vask blotlagt tarmen med rigelige mængder varmt saltvand og forsigtigt returnere den til bughulen sikrer korrekt anatomisk placering af tarmen.
8. Eksteriorisere kateteret ved venstre midten flanke (5-10 cm ventralt fra paralumbar fossa). Lav en incision i huden med en skalpel og bestå en trokar fra bughulen til hudoverfladen for at skabe en åbning til eksteriorisering af kateteret. Brug en stor Kelly pincet til eksteriorisere katetret fra den abdominale CAVity gennem trokaren åbning.
9. Luk parietale peritoneum med en simpel kontinuert sutur mønster af 2-0 polyglactin sutur med en runde (tilspidset) nål. Luk abdominal muskel lag med en simpel afbrudt sutur mønster med en 2-0 polyglactin sutur på en rund nål.
10. Luk huden i en subkutikulær mønster med 2-0 polyglactin sutur på en skæring nål. Fastgør eksterioriseret kateter til huden med en pung-string sutur mønster og en 2-0 nylon sutur på en skæring nål.
11. Placer en specialiseret jakke på grisen, mens den stadig bedøvet at lette dens placering og reducere stress i grisen under restitution.

3. Post-kirurgisk Recovery og lymfeknuder Collection

1. Ca. 10 minutter før afviklingen af ​​indånding anæstesi, administrere bupenorphine (0,1 mg / kg) intramuskulært at yde øjeblikkelig post-kirurgi analgesi. Fortsæt bupenorphine (0,1 mg / kg) hver 12 timer til 24-48 timer for at opretholdepost-kirurgi analgesi.
2. Overvåg grisene for postoperative komplikationer hver 8-12 timer i en periode syv dage.
3. Opsaml lymfeknuder i 500 ml polypropylen vaskeflasker, overtrukket med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), og suppleret med antibiotika; penicillin (6000 IU), streptomycin (6 mg) og amphotericin B (3 mg) hver 12 timer i en periode syv dage.

4. Kvantificering af lipoprotein ApoB48, triglycerid, kolesterol og Total protein Indsamlet fra lymfeknuder

1. Centrifugeres lymfeknuder prøven ved 1800 xg i 5 min ved 4 ° C. Opsaml supernatanten og bruge det til kvantificering af triglycerid, cholesterol og total protein.
2. Opdel supernatanten i tre prøver: en ufortyndet prøve, en prøve fortyndet 1:20 destilleret vand og en endelig prøve fortyndet 1: 100 med destilleret vand.
3. Brug ufortyndet supernatant at måle kolesteroltallet, med et kommercielt tilgængeligt kit.
4. Brug 1:20 og 1:100 fortyndede prøver at måle triglycerid og totale protein niveauer med et kommercielt tilgængeligt kit og bicinchoninsyre-total proteinanalyse hhv.

5. Kvantificering af lipoprotein ApoB48, Indsamlet fra lymfeknuder ³⁸

1. Bestem koncentrationen af lipoprotein ApoB48 med en tilpasset immun vestlige Blotting metode ^38. Separat samlede lymfeknuder med 3-8% tris-acetat- natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE).
2. Overfør de separerede proteiner til en polyvinylidenfluoridmembran (0,45 um) og inkuber dem med et gede-polyklonalt antistof til ApoB (1: 4.000), derefter binder med et anti-gede-sekundært antistof.
3. Kvantificere lipoproteinet ApoB48 med kemiluminescens under anvendelse af en lineær densitometrisk sammenligning med oprenset gnaver ApoB48 proteinstandard.

Representative Results

Lymfe kateterisation af tarmens lymfe stammen af ​​neonatale grise muliggør samling af ca. 1 L / 24 timer af centrale lymfeknuder i løbet af en periode på 7 dage. Det opsamlede i denne eksperimenter lymfeknuder indeholdt komponenter af lipidmetabolisme, nemlig fuldstændig lymfe protein, ApoB48 lipoprotein, triglycerider, total protein og cholesterol. Tabel 1 højdepunkter repræsentative mængder af disse lipid komponenter fra puljede lymfeknuder prøver af tre grise. Især lymfe flow og lipid bestanddele, er på linje med værdierne i det centrale lymfe rapporteret af andre forskere efter kateterisation af intestinale lymfekar (lymfeknuder flow 570 ± 158-979 ± 284 ml / 24 timer ^25, 360 ± 120 MLL / 24 timer til 1080 ± 720 ml / 24 timer ^26; triglycerid 687 ± 110 mg / dl ^9; cholesterol 63,1 ± 5,6 mg / dl ^9); indikerer korrekt placering af katetret i lymfekar.

Indholdsproduktion "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 2. En hurtigt Protein Liquid Chromatography (FPLC) profil demonstrerer renheden af chylomikron præparat i neonatal pig intestinal lymfeknuder. Lymfe samlet fra separeres under anvendelse af en 1,006 g / ml densitetsgradient ultracentrifugering protokol tre grise. Profilen viser en enkelt top for (A) kolesterol og (B) triglycerid i lymfeknuder prøven. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 1. Et repræsentativt Western blot-analyse demonstrerer bidrag ApoB48 og ApoB100 lipoproteiner i neonatal pig intestinal lymfeknuder. Lymfeknuder indsamlet fra tresvin separeres under anvendelse af en 1,006 g / ml densitetsgradient ultracentrifugering protokol. Figuren viser en lille mængde af forurening med ca. 15% af plasma afledt ApoB100. Klik her for at se en større version af dette tal.

	lymfeknuder Kendetegn
ApoB48 (mg / ml)	3022,4 ± 440,4
Triglycerid (mg / dL)	607 ± 203,6
Cholesterol (mg / dl)	58,5 ± 9,6
Resultater udtrykkes som middel ± SD (n = 3)

Tabel 1. Bestanddele af intestinal lymfe indsamlet fra neonatale grise 7 dage efter kirurgi. Resultater er gentagne meager af lymfeknuder og udtrykt som betyder SD (n = 3)

Discussion

Indsamling tarm lymfeknuder er en fremragende metode til at undersøge mekanismer, der er involveret i lipid ^8-12 og narkotika ^13-15 stofskifte, kræft metastaser ^16,17, celle menneskehandel og immunforsvaret ^18-26, i forskellige eksperimentelle dyremodeller. Faktisk har evnen til at høste store mængder enten perifere (afferent) og central (efferente og store trunk fartøjer) lymfeknuder i en længere periode været særlig vigtige for forståelsen tidsmæssige forandringer, der sker i cellepopulationer følgende udfordringer med immunmodulerende midler ^{18-22 , 25,26.} Tilsvarende er samling af centrale lymfeknuder været nyttigt i afgrænse processer involveret i lipoprotein metabolisme ^8-12. Anvendeligheden af ​​lymfeknuder samling afhænger succesen af ​​kateteriseringsprocedure og åbenheden af ​​kateteret i lymfekar.

Kateterisation af de store lymfekar er involveret iintestinal lymfedræning i store dyr, som almindeligvis anvender en af ​​tre kirurgiske metoder. Den første teknik anvender en kraniel skulder tilgang til at indtaste den thorakale kanal ligger over fælles halsvene (ko ductus thoracicus) ^5. Den anden anvender en øvre flanke tilgang over midtlaterale aspekt af den højre nyre ^32,33. Den tredje teknik som beskrevet i denne video beskæftiger enten en ventral midtlinje eller paramedian ^22,35 laparotomi for at blotlægge den intestinale lymfatisk stammen nær bugspytkirtlen og sidestillet til højre ventrale aspekt af portåren ^22,36,37. Selv om både den øvre flanke og ventral midterlinjen kirurgiske teknikker gør det muligt kateterisation af tarmens lymfe stammen, mener vi, den ventrale midterlinjen tilgang giver mulighed for bedre eksponering af fartøjet med tilstrækkelig plads inden for den øvre del af maven til at håndtere og manipulere skibet.

Vigtigere er det, som i enhver eksperimentel kirurgi der er skridt, der er particularly afgørende for det vellykkede resultat af den eksperimentelle procedure. Der er fire centrale områder, der kræver særlig opmærksomhed ved hjælp af den ventrale midterlinjen tilgang for at få adgang tarmens lymfekar. Først fremragende blodforsyning til eksterioriseret tarmen påkrævet, da langvarig kompromitteret cirkulation til tarmen inducerer iskæmisk tarmslimhinde nekrose og kirurgisk fiasko. I denne procedure en "håndklæde slynge 'reducerer spændingen på de mesenteriske blodkar ved at støtte vægten af ​​tarmene, der sikrer fremragende vævsperfusion. For det andet, omhyggelige manipulationer af fartøjet, herunder: frigivelse af fartøjet fra omgivende fascia og fedtvæv, indsætte og fast fastgørelse af kateteret i karret for langsigtet lymfeknuder kollektion er afgørende for en vellykket kateterisation. Faktisk er det foreslået, at den strukturelle integritet af de fartøjer i neonatale grise er ikke så robust som i modne dyr og som sådan nemt kan rive ^39,40 41, er det meget vanskeligt at fjerne blodproppen fra kateteret som blodproppen udvikler i kateteret og er dybtliggende i lymfekar. Derfor vil det i høj grad reducere (ca. 40%) antallet af dyr med succes kateter til langsigtet eksperimenter (upublicerede data). Derfor, hvis lymfeknuder flow forsinkes eller har afbrudt under proceduren, lymfe kateter bør genindsættes kranialt 0,5-1 cm fra den indledende kateterisation webstedet.

Alle modeller, der anvendes til at undersøge videnskabelige spørgsmål har inherant begrænsninger og kateterisation af tarmens lymfe stammen er ingen undtagelse. Den mest udtalte begrænsning for fremgangsmåden er den manglende evne til effektivt at isolere, selvkaterisation den lymfekar, og stabilisere kateteret inden i beholderen. Som sådan, denne procedure kræver folk med fremragende tekniske og kirurgiske færdigheders. En anden væsentlig begrænsning er, at forlængede kirurgiske gange i løbet af større abdominal kirurgi øger risikoen og postoperative morbiditet og mortalitet. Især imidlertid grisene i vores eksperiment udvindes hurtigt fra kirurgi og der var ingen komplikationer såsom infektioner, intestinal ileus, overdreven vævsskade eller appetitløshed efter proceduren. Helt sikkert, blev grise observeret at være lyse, lydhør, ambulating og spise normalt 24 timer efter kirurgi og denne fortsatte i løbet af lymfeknuder indsamlingen 7 dages periode. Især selvom serum kemi eller komplette blodtal ikke blev vurderet i disse svin efter 7 dage eksperimentet, tidligere arbejde af efterforskerne i langvarig lymfeknuder samling hos får ⁴¹ viste, at kateter får var aldrig leukopeniske, lymphopenic, hypoproteinemic med elektrolytforstyrrelser eller klinisk portrættere dårligt helbred (upublicerede data). Vigtigere og som anført ovenfor, denne observation korrelerer med catheterized grise også vise kliniske karakteristika for et godt helbred.

Interessant, efterforskere bemærkede variationer i mængden af ​​lymfe flow. Strømmen var størst i løbet af dagen, da svinene blev fodring og aktiv med ca. 70% af den daglige indsamlede lymfeknuder forekommer på dette tidspunkt. De resterende 30% af lymfestrøm sker i aften under hvile og søvn.

Yderligere karakterisering af lymfeknuder prøver er tilvejebragt i figur 1, 2 og tabel 1. Figur 1 viser en lille mængde forurening med ca. 15% af plasmaafledt ApoB100. Tilstedeværelsen af plasma lipoprotein inden intestinal lymfeknuder er en observation, der ofte forekommer hos svin ^42. I pattegrise, er størstedelen af ​​lipoprotein produceres af leveren og frigives i plasma. Fra plasmaet, ApoB100 sandsynligvis siver ind indsamle lacteals ⁴² og derefter gennem det lymfatiske vaskulære netværkløber ud i tarmen lymfe stammen. Forskellige metoder til kromatografi bruges til at vurdere kolesterol, triglycerider og andre phospholipid indhold i indsamlede lymfeknuder prøver ^42-45. Den enkelt top i figur 2 viser klart kolesterol og triglycerider er til stede i chylomikron fraktion. Denne metode er en bekvem og nøjagtig teknik profilering lymfeknuder lipoproteiner og bør overvejes ved vurderingen af renheden af chylomicron prøver fra tarm lymfeknuder ^45. Endelig Tabel 1 indeholder de biokemiske komponenter af intestinal lymfe samlet fra neonatale grise 7 dage efter kirurgi.

Afslutningsvis langsigtet kateterisering af den intestinale lymfe stammen er vellykket hos unge grise. Med denne teknik kan lymfatiske kateterisation anvendes til at indsamle og undersøge komponenter af lipidmetabolismen. Renheden af ​​lymfeknuder, mængden af ​​lymfeknuder produceret og de mængder af bestanddele i fedtstofskiftetligner mængder til stede i gris centrale lymfeknuder i andre eksperimenter ^9,25,26,42. Resultaterne indikerer, at ansætte en ventral midterlinjen kirurgisk tilgang med omhyggelig væv dissektion og skib håndtering ved selvkaterisation tarmens lymfe stammen hos unge grise er en fremragende metode til at indsamle store mængder af det centrale lymfe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay