Introduction
O sistema linfático é uma área pouco estudada da fisiologia. Modelos pré-clínicos de cateterismo linfático ocorrer em diferentes espécies animais e 1-8 são utilizados pelas indústrias farmacêuticas e instituições de investigação para investigar mecanismos envolvidos em lípidos 8-12 e 13-15 metabolismo da droga, metástase de câncer 16 com tratamento experimental 17, 18 e a função imunológica -26. Este estudo explora o uso de cateterismo intestinal tronco linfático em um modelo de porco doméstico para medir componentes do metabolismo de lipoproteínas. metabolismo das lipoproteínas está envolvido na produção e secreção de quilomicrons, bem como as alterações nos lípidos associados e proteína total. Essas considerações são importantes, pois há grandes diferenças no metabolismo lipídico entre modelos de roedores comumente usados e os seres humanos e, como tal, empregando modelos de suínos para coletar linfa intestinal poderia fornecer informação mais comparável para o estudo de lipídios memetabolização em pessoas 27-31.
Várias técnicas cirúrgicas são usados para coletar a linfa intestinal em espécies de animais de grande porte: uma abordagem ombro cranial (ou seja, o cateterismo ducto torácico) 5, uma abordagem lateral superior flanco 32-34, e uma linha média ventral ou abordagem paramediana 22,35. Este vídeo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico em suínos utilizando uma abordagem cirúrgica ventral para o cateterismo do tronco linfático intestinal. Cuidadosas autorizações técnicas cirúrgicas este método de cateterismo linfática para recolher grandes quantidades de linfa e dos seus componentes ao longo de períodos de tempo prolongados.
Esta técnica abre uma miríade de aplicações para muitas disciplinas que examinam várias funções fisiológicas. Aplicações podem incluir, mas não estão limitados a, todo lipoproteína corpo e o metabolismo lipídico, imunovigilância, génese de tumores e metástases, função intestinal, e a development e progressão da doença inflamatória intestinal.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais experimentais descritas, tanto no vídeo e manuscrito foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal e seguiu as orientações estabelecidas pelo Conselho Canadense de Animal Care.
1. anestesia cirúrgica e preparo cirúrgico do Pigs Neonatais
- Em uma antecâmara separada, premedicate 25 kg porcos perto da base do pescoço, com um cocktail de drogas sedativo-anestésico intramuscular contendo: azaperona (0,3 mg / kg), cloridrato de cetamina (10 mg / kg), a dexmedetomidina (15 ug / kg).
Nota: Adicionar buprenorfina (0,005-0,02 mg / kg) no coquetel de drogas pré-anestésica para maior controle da dor intra-operatória. - Anestesiar os porcos com gás para inalação de isoflurano inalado (4-5% de isoflurano em 500 ml-1000 ml / min O 2) usando uma máscara facial. Visualizar as cordas vocais usando um espaço da laringe veterinário (lâmina reta 17-25 cm de comprimento), e aplicar tópica 10% spay lidocaína ao vocalcabos. Permitir que o spray de lidocaína a contactar as cordas vocais 30-60 seg antes da intubação para reduzir a possibilidade de espasmo das cordas vocais e obstrução das vias aéreas.
- Entubar os porcos por meio de um tubo endotraqueal (5,0-7,0 mm de diâmetro interno (ID)) entre as cordas vocais e manter a anestesia com isoflurano gás (0,5-2,0% de isoflurano em 1.000-2.000 ml / min de O2) usando um fechada circuito de reinalação sistema anestésico durante toda a cirurgia. Avaliar o nível de anestesia pelo tom mandíbula, e ambas as respostas reflexas dos pedais e da pálpebra. gás anestésico expirado é eliminado e ventilado fora do centro cirúrgico.
- Limpar a superfície exterior da orelha com uma solução de limpeza cirúrgica 2,0% de clorexidina seguido por uma lavagem com álcool isopropílico a 70%. Com um cateter intravenoso 20 L, catheterize uma veia da orelha para fornecer fluidos intravenosos (solução de lactato de Ringer; 5-10 ml / kg / hr) durante a cirurgia. Garantir um oxímetro de pulso à superfície da mucosa da língua, com medfita iCal para monitorar a frequência cardíaca ea saturação de oxigenação do sangue periférico (SpO2).
- Coloque o porco anestesiado em uma posição reclinada dorsal e raspar o abdômen ventral a partir de meados do tórax caudalmente ao aspecto ventral do púbis. Limpar esta área com os dois alternando 2,0% clorexidina cirúrgico esfrega e lavagens de água estéril.
- Transferir o porco anestesiados ao centro cirúrgico e aplicar a paramentação final de 70% lavagem de álcool isopropílico, deixe-a secar, e depois armar o animal.
- Insira uma sonda de temperatura rectal cerca de 2-4 cm no recto para monitorizar a temperatura do corpo. Coloque os suínos de uma almofada de aquecimento de recirculação de água para manter a temperatura corporal normal (38-40 ° C) durante o procedimento cirúrgico.
- Armar o porco com quatro toalhas cortinas colocadas em um padrão quadrante sobreposta em torno do abdômen. Coloque a primeira cortina em todo processo xifóide do esterno, a segunda cortina junto aspecto lateral do abdômen cerca de 5 cm lateral à linha média abdominal. Coloque a terceira cortina entre a crista do íleo da pelve e a quarta cortina, como a segunda cortina (embora no lado oposto), é colocada ao longo da face lateral do abdómen cerca de 5 cm lateralmente à linha média abdominal.
- Coloque uma grande cortina de mesa, com uma fenda de abertura permitindo o acesso ao local da cirurgia, sobre as cortinas toalha subjacentes e cubra o porco e toda mesa cirúrgica. A cortina final é um Steri-cortina descartável colocado sobre a grande cortina mesa.
2. Cirurgia Abdominal e cateterismo do Tronco linfático intestinal
- Faça uma incisão na pele 20 cm, com uma lâmina de bisturi para expor os músculos abdominais subjacentes. Inciso as camadas musculares abdominais com electrocauterização mono-polar (20 configuração Watts) para expor o peritoneu parietal. Abra um segmento linear 20 cm de peritônio parietal com uma tesoura Metzenbaum para acessar as vísceras abdominais e vasos linfáticos.
- Humedecer todos os tecidos com água morna (37 ° C) de soro fisiológico estéril por todo o procedimento cirúrgico. Levante cuidadosamente um grande segmento do intestino incluindo o de cólon, ceco, íleo e jejuno da cavidade abdominal e exteriorizar-lo para o flanco esquerdo do porco para acessar a parte superior do abdome, fígado e vasos linfáticos. Fixe o intestino exteriorizado na posição com cortinas toalhas adicionais para formar um estilingue para apoiar delicadamente o intestino.
- Localize o vaso linfático, estabelece aproximadamente 4 cm crânio-medial da veia renal direita, 6 cm ventral caudal-medial- dos capatazes cava e sob o aspecto visceral do lobo direito do fígado perto do pâncreas 22,36,37. Identificar o vaso linfático como uma estrutura transparente justaposto ao segmento ventral direito da veia porta 36,37.
- Separe o Vess linfáticael dos fascia em torno suavemente provocando afastado o tecido anexado com aplicadores Q-tip. Uma vez que os aspectos laterais do recipiente são separados a partir do tecido circundante, criar uma abertura "túnel" debaixo do navio com excelentes sem corte com ponta fórceps.
- Passe três 2-0 suturas de seda por baixo do vaso linfático com uma pinça fina. Ligadura da sutura mais caudal primeira para ocluir, dilatar e encher o recipiente com linfa. Propositadamente deixar as extremidades deste fio de sutura relativamente longo (4 cm), para fixar o cateter para o vaso linfático. Colocar duas outras suturas separadas de 1,0 cm um do outro e são de aproximadamente 1,0-1,5 cm cranianos à sutura caudal garantido. Deixar estas duas suturas com um "laço solto ligadura único" para permitir a fixação mais rápido do cateter para dentro do vaso.
Nota: O segmento do vaso linfático localizado entre o fio de sutura liga�o da sutura e mais caudal do meio (de as duas suturas cranianas) é o local para a cateterização. Em relação sumaterial de ture, poliglactina 2-0 sutura pode substituir o fio de seda 2-0, se necessário. - Corte um pequeno buraco dentro do vaso com íris tesouras e dilatar o vaso com uma pinça sem corte finas. Inserção de aproximadamente 1,0-1,5 cm de tubo de cateter especializado (4,06 Diâmetro exterior (OD) X 2,31 milímetros ID) com uma extremidade chanfrada para dentro do vaso e amarrar as duas suturas cranianas para fixar o cateter no lugar. Use as extremidades longas de sutura da sutura de caudal para fixar o cateter para o recipiente.
- Lave o intestino exteriorizado com grandes quantidades de solução salina quente e devolvê-lo suavemente para a cavidade abdominal garantindo posicionamento anatômico correto do intestino.
- Exteriorizar o cateter no flanco meados esquerda (5-10 cm ventral da fossa paralombar). Adicione uma incisão na pele com um bisturi e passar um trocarte a partir da cavidade abdominal para a superfície da pele para criar uma abertura para a exteriorização do cateter. Use um grande fórceps de Kelly para exteriorizar o cateter da cav abdominaldade através da abertura trocar.
- Fechar o peritônio parietal com um padrão de sutura simples contínua de poliglactina 2-0 sutura com uma agulha rodada (cônico). Feche as camadas musculares abdominais com um padrão de sutura simples interrompido com uma sutura de poliglactina 2-0 em uma agulha rodada.
- Feche a pele em um padrão subcuticular com poliglactina 2-0 sutura em uma agulha de corte. Fixe o cateter exteriorizada na pele com um padrão de sutura em bolsa e uma sutura 2-0 nylon em uma agulha de corte.
- Coloque um revestimento especializado no porco enquanto ainda anestesiados para facilitar sua colocação e reduzir o estresse do porco durante a recuperação.
Recuperação 3. pós-cirúrgica e Cobrança A linfa
- Cerca de 10 minutos antes da interrupção da anestesia inalatória, administrar bupenorphine (0,1 mg / kg) por via intramuscular para fornecer imediato analgesia pós-cirurgia. Continuar bupenorphine (0,1 mg / kg) a cada 12 h durante 24-48 h, para manteranalgesia pós-cirurgia.
- Monitorar os porcos para complicações pós-cirúrgicas a cada 8-12 horas, por um período de 7 dias.
- Recolha a linfa em 500 ml de frascos de lavagem de polipropileno, revestido com ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), e suplementado com antibióticos; penicilina (6000 UI), estreptomicina (6 mg) e anfotericina B (3 mg) a cada 12 h durante um período de 7 dias.
4. Quantificação de Lipoproteína apoB48, triglicerídeos, colesterol e proteína total arrecadado de linfa
- Centrifugar a amostra de linfa a 1.800 xg durante 5 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e usá-lo para a quantificação de triglicéridos, colesterol e proteína total.
- Divide-se o sobrenadante em três amostras: uma amostra não diluída, uma amostra diluída 1:20 água destilada e uma amostra final foi diluído 1: 100 com água destilada.
- Utilizar o sobrenadante não diluído para medir os níveis de colesterol, com um kit disponível comercialmente.
- Use a 1:20 e 1:100 amostras diluídas para medir triglicérido e os níveis totais de proteína com um kit comercialmente disponível e o ensaio de proteína total de ácido bicinconínico respectivamente.
5. Quantificação de Lipoproteína apoB48, coletados a partir de linfa 38
- Determinar a concentração de lipoproteína de apoB48 com um método imunológico Ocidental adaptado Blotting 38. linfa total de separada, com 3-8% de dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida Tris-etilo-(SDS-PAGE).
- Transferir as proteínas separadas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (0,45 um) e incube-as com um anticorpo policlonal de cabra para a ApoB (1: 4000), então ligá-lo com um anticorpo secundário anti-cabra.
- Quantificar a lipoproteína apoB48 com quimiluminescência usando uma comparação densitométrica linear com padrão de proteína apoB48 purificado roedor.
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Representative Results
cateterismo linfática do tronco linfático intestinal de suínos neonatal permite a coleta de cerca de 1 L / 24 hr da linfa centro durante um período de 7 dias. A linfa recolhida neste experiências continha componentes do metabolismo de lípidos, proteínas ou seja total de linfa, apoB48 lipoproteína, triglicéridos, proteína total, e colesterol. Tabela 1 destaca valores representativos destes componentes lipídicos de amostras linfáticos agrupados de três porcos. Notavelmente, o fluxo de linfa e componentes lipídicos estão em linha com os valores de linfa centro relatados por outros investigadores seguintes cateterismo dos vasos linfáticos intestinais (linfa flui 570 ± 158 para 979 ± 284 ml / 24 h 25, 360 ± 120 MLL / 24 horas para 1080 ± 720 ml / 24 h 26; triglicérides 687 ± 110 mg / dL 9; colesterol 63,1 ± 5,6 mg / dL 9); que indica a colocação correcta do cateter no interior do vaso linfático.
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Figura 2. Um perfil de Proteínas Rápida cromatografia líquida (FPLC) que demonstra a pureza da preparação de quilomicron no porco neonatal linfático intestinal. Linfáticos coletadas de três porcos é separada usando uma 1,006 g / ml protocolo de gradiente de densidade de ultracentrifugação. O perfil mostra um único pico de (A) colesterol e (B) de triglicéridos na amostra de linfa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1. A análise de Western blot representante demonstrando a contribuição de apoB48 e ApoB100 lipoproteínas no porco neonatal linfático intestinal. A linfa coletadas de trêssuínos é separado utilizando um 1,006 g / ml protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade. A figura demonstra uma pequena quantidade de contaminação com aproximadamente 15% do derivado do plasma ApoB100. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Características linfáticos | |
| ApoB48 (mg / ml) | 3022,4 ± 440,4 |
| Triglicéridos (mg / dl) | 607 ± 203,6 |
| O colesterol (mg / dl) | 58,5 ± 9,6 |
| Os resultados são expressos como média ± SD (n = 3) | |
Tabela 1. Componentes de linfa intestinal recolhidos de porcos neonatais 7 dias pós-cirurgia. Os resultados são repetidos measures de linfa e expressos em média SD (n = 3)
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Discussion
Coleta de linfa intestinal é um excelente método para investigar mecanismos envolvidos na lipídico 8-12 e 13-15 de drogas metabolismo, a metástase do câncer 16,17, o tráfico de celular e função imunológica 18-26, em vários modelos animais experimentais. Com efeito, a capacidade de colher grandes quantidades de um ou outro periférico (aferente) e central (eferente e grandes vasos do tronco) linfa durante um período prolongado tem sido particularmente importante para compreender alterações temporais que ocorrem nas populações de células seguintes desafios com agentes moduladores imunes 18-22 , 25,26. De igual modo, a recolha de linfa central tem sido úteis para delinear os processos envolvidos no metabolismo de lipoproteínas de 12/08. O utilitário de recolha de linfa é dependente do sucesso do procedimento de cateterização e a permeabilidade do cateter no interior do vaso linfático.
Cateterismo dos principais vasos linfáticos envolvidos nadrenagem linfática intestinal em animais de grande porte geralmente usa uma das três abordagens cirúrgicas. A primeira técnica utiliza uma abordagem cranial ombro para entrar no ducto torácico sobrepondo-se a veia jugular comum (vaca ducto torácico) 5. A segunda utiliza uma abordagem flanco superior sobre o aspecto médio-lateral do rim direito 32,33. A terceira técnica, tal como descrito neste vídeo emprega quer uma linha média ventral ou paramediana 22,35 laparotomia para expor o tronco linfático intestinal perto do pâncreas e justaposta à face ventral direito da veia portal 22,36,37. Embora tanto o flanco superior e da linha média ventral técnicas cirúrgicas permitem cateterismo do tronco linfático intestinal, nós acreditamos que a abordagem ventral permite uma melhor exposição do navio com espaço adequado dentro do abdômen superior de manusear e manipular o navio.
Importante, como em qualquer cirurgia experimental existem passos que são particularmente crucial para o êxito do procedimento experimental. Há quatro áreas-chave que exigem atenção cuidadosa utilizando a abordagem ventral para acessar o vaso linfático intestinal. Em primeiro lugar, excelente fornecimento de sangue ao intestino exteriorizado é necessário, com o seu prolongamento circulação comprometida para o intestino induz necrose da mucosa intestinal isquémica e falha cirúrgica. Neste procedimento uma 'funda toalha' reduz a tensão sobre os vasos sanguíneos mesentéricos por suportar o peso dos intestinos que asseguram excelente perfusão tecidual. Em segundo lugar, as manipulações cuidadosas do vaso, incluindo: a libertação do recipiente a partir circundante fáscia e do tecido adiposo, a inserção e a firmemente fixar o cateter no interior do vaso para a recolha de linfa de longo prazo é crítica para cateterismo bem sucedida. Com efeito, sugeriu-se que a integridade estrutural dos vasos em porcos recém-nascidos não é tão robusto como em animais maduros e, como tal, pode facilmente rasgar 39,40 41, é muito difícil de remover do coágulo a partir do cateter que o coágulo desenvolve no interior do cateter e é profunda no interior do vaso linfático. Consequentemente, isso irá reduzir significativamente (aproximadamente 40%) o número de animais sondados com sucesso a longo prazo de experimentação (dados não publicados). Portanto, se o fluxo de linfa é retardado ou foi descontinuado durante o procedimento, o cateter linfático deve ser reinserido cranialmente 0,5-1 cm do local inicial cateterismo.
Todos os modelos utilizados para investigar questões científicas têm limitações inherant e cateterismo do tronco linfático intestinal não é excepção. A limitação mais pronunciado para o processo é a incapacidade de isolar de forma eficaz, cateterização do vaso linfático, e estabilizar o cateter no interior do vaso. Como tal, este procedimento requer pessoas com excelente habilidade técnica e cirúrgicos. Outra limitação importante é que os tempos cirúrgicos prolongados durante grande cirurgia abdominal aumenta o risco e morbidade e mortalidade pós-cirúrgica. Notavelmente, entretanto, os suínos em nosso experimento recuperou rapidamente da cirurgia e não houve complicações como infecções, íleo intestinal, lesão tecidual excessiva, ou inapetência após o procedimento. Certamente, os porcos foram observados para ser brilhante, ágil, deambulação e comer normalmente 24 horas após a cirurgia e isso continuou durante o período de coleta de linfa de 7 dias. Notavelmente, embora químicas do soro ou hemogramas completos não foram avaliados nestes porcos após o experimento de 7 dias, o trabalho anterior pelos pesquisadores na coleta de linfa de longo prazo em ovinos 41 demonstraram que as ovelhas sondados nunca foi leucopênica, linfopênicos, hypoproteinemic com desequilíbrio eletrolítico ou clinicamente retratando má saúde (dados não publicados). Importante e, como já foi referido, esta observação se correlaciona com catheteriporcos zed também exibindo características clínicas de boa saúde.
Curiosamente, os investigadores observaram variações no volume do fluxo da linfa. O fluxo foi maior durante o dia quando os porcos foram alimentação e activa com cerca de 70% da linfa recolhidas diariamente ocorrendo neste momento. Os restantes 30% do fluxo da linfa acontece à noite durante o repouso e sono.
A caracterização adicional de amostras linfáticos são fornecidos nas Figuras 1, 2 e Tabela 1. A Figura 1 demonstra uma pequena quantidade de contaminação com aproximadamente 15% de derivado de plasma ApoB100. A presença de lipoproteína de plasma dentro da linfa intestinal é uma observação que muitas vezes ocorre em suínos 42. Em leitões, a maioria da lipoproteína é produzida pelo fígado e libertados no plasma. A partir do plasma, ApoB100 provável infiltra lacteals recolha 42 e então através da rede vascular linfáticodrena para o tronco linfático intestinal. Vários métodos de cromatografia são usados para avaliar o colesterol, triglicéridos e outros conteúdos de fosfolípidos em amostras linfáticos recolhidas 42-45. O único pico na Figura 2 demonstra claramente o colesterol e triglicéridos estão presentes na fracção de quilomicra. Este método é uma técnica conveniente e preciso do perfil de lipoproteínas linfáticos e deve ser considerado na avaliação da pureza das amostras de quilomícrons da linfa intestinal 45. Finalmente, a Tabela 1 fornece os componentes bioquímicos de linfa intestinal colhidas em suínos neonatais 7 dias pós-cirurgia.
Em conclusão, a cateterização a longo prazo do tronco linfático intestinal é bem sucedido em porcos jovens. Com esta técnica, a cateterização linfático pode ser utilizado para recolher e componentes de investigar o metabolismo dos lípidos. A pureza da linfa, a quantidade de linfa produzido e as quantidades dos componentes do metabolismo lipídicosão semelhantes aos valores presentes no porco linfático central em outros experimentos 9,25,26,42. Os resultados indicam que o emprego de uma linha média abordagem cirúrgica ventral com dissecção dos tecidos cuidadoso e vaso manusear a cateterização do tronco linfático intestinal em leitões é um excelente método para coletar grandes quantidades de linfa central.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miller laryngoscope blade | Welch Allyn | 68044 | 182 mm length |
| Surgivet advisor: Vital signs monitor | Surgivet | V9203 | |
| Rectal temperature probe | Surgivet | V3417 | |
| Mono-polar electrosurgery generator | Valley Lab | ||
| Metzenbaum scissors | Fine Science | 14518-18 | |
| Tuffier retractor | Stevens | 162-11-676 | |
| Mosquito forceps | Stevens | 162-7-10 | |
| Kelly forceps-curved (14cm) | Stevens | 162-7-38 | |
| Allis tissue forceps | Stevens | 162-7-38 | |
| Forceps dressing-eye (10.2cm) | Stevens | 162-18-780 | |
| Forceps dressing-Adison (12.1cm) | Stevens | 162-17-2510 | |
| Needle Drivers | Stevens | 162-V98-42 | |
| Iris scissors | Fine science | 14058-11 | |
| Circulating water pump | Jorvet | J-783X | |
| Maxitherm-Vinyl blanket | Jorvet | J-784C | |
| Q tip applicators | Fisher Scientific | 22-037-960 | |
| Catheterization tubing (4.06 OD X 2.31 ID) | Braintree Scientific Inc. | MRE-160 | Micro-Renethane implantation tubing |
| 2-0 silk suture | Ethicon | LA556 | |
| 2-0 polyglactin suture | Ethicon | J443H | 2-0 vicryl |
| Large animal jacket | Lomir Biomedical Inc. | SSJ2YC | |
| Polypropylene wash bottles | Fisher Scientific | 03-409-22C | 500 ml |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | D4333 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 60-00-4 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Azaperone | Elanco Animal Health | Stresnil | |
| Dexmedetomidine hydrochloride | Zoetis | 6295 | Dexdomitor |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | 05260-5 | IsoFlo |
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | 2626 | Ketaset |
| Bupenorphine hydrochloride | Champion Alstoe Animal Health | DIN:02347510 | |
| 6 mm Endotracheal tube | Jorvet | J-165d | |
| 10% Lidocaine spray | AstraZeneca | DIN:02003767 | |
| 4 % Chlorhexidine surgical scrub | Partnar Animal Health | PCH-011 | Diluted: 2.0% solution |
| 3M Surgical steri- drape | 3M Health Care | 1040 | |
| SDS page gel | Invitrogen | EA0375BOX | 3-8 % tris acetate |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | 0.45 μm pore size |
| ApoB antibody | EMD Millipore | AB742 | 1:4000 dilution |
| Donkey anti-goat IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2304 | |
| ECL Prime Western Blotting Reagent | GE Healthcare LifeSciences | RPN2232 | |
| Triglyceride Kit | Wako Pure Chemicals | 998-40391/994-40491 | |
| Total Cholesterol Kit | Wako Pure Chemicals | 439-17501 | |
| Total Protein | Pierce | 23225 | Bicinchoninic Acid Assay |
References
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