在新生儿猪淋巴的肠淋巴躯干和收集的长期导尿

Introduction

淋巴系统是生理学的充分研究领域。淋巴导管的临床前模型发生在不同的动物物种^1-8和由制药工业和研究机构用于研究参与脂质^8-12和药物代谢^13-15，与实验治疗¹⁷癌转移¹⁶的机制，及免疫功能^{18 -26。}本研究旨在探讨在国内猪模型采用肠淋巴导管干线来衡量脂蛋白代谢的成分。脂蛋白代谢参与乳糜微粒的产生和分泌，以及在相关的脂质和总蛋白的变化。这些都是重要的考虑因素，因为有常用的啮齿动物模型与人类之间，因此脂质代谢的主要区别，采用猪模型，收集肠淋巴能为研究脂类我提供更多的可比信息代谢障碍，在人^27-31。

若干外科技术用于收集在大动物种属的肠道淋巴：颅骨肩方法（ 即，胸导管导尿^）5，横向上侧翼的方法^32-34，和腹中线或正中的方法^22,35。详细这段视频描述了使用的肠淋巴树干导管下腹正中手术方法在猪的外科手术。细心的手术技术许可淋巴导管的这种方法来收集大量淋巴结及其成员在一段时间过长。

该技术将打开的应用程序，许多学科研究的各种生理功能万千。应用可包括，但不限于，全身脂蛋白和脂质代谢，免疫监视，肿瘤发生和转移，肠道功能，并且developm耳鼻喉科和肠道炎症疾病的进展。

Protocol

在视频稿件和描述都实验动物的所有程序被机构动物护理和使用委员会批准，其次是动物保健的加拿大理事会确定的指导方针。

1.手术麻醉及新生儿猪手术准备

1. 在一个分离的前厅，premedicate颈部与含有肌内镇静麻醉药鸡尾酒底部附近25千克猪：二甲苯胺噻嗪（0.3毫克/千克），盐酸氯胺酮（10毫克/千克），右美托咪（15微克/千克）。
   注：在麻醉前药物鸡尾酒增强术中疼痛控制添加丁丙诺啡（0.005-0.02毫克/千克）。
2. 麻醉与吸入异氟烷吸入气体的猪（4-5％异氟醚在500毫升千毫升/分钟O _2）使用面罩。使用兽医喉范围（17-25厘米长的直叶片）可视化的声带，并应用外用10％的利多卡因绝育的声音线。允许利多卡因喷30-60秒前联系声带气管插管，以减少声带痉挛及气道阻塞的可能性。
3. 由声带之间传递铐气管插管（5.0-7.0毫米内径（ID））插管猪并保持与异氟醚气体麻醉（0.5-2.0％异氟醚在1000-2000毫升/分钟O _2）使用关闭电路在整个手术麻醉重复吸入系统。评估麻醉由颚音调水平，并且两个踏板和眼睑反射响应。过期麻醉气体被清理和手术套件之外排出。
4. 清洁用2.0％氯己定外科擦洗液耳后跟一个70％异丙醇冲洗的外表面。用20G的静脉导管，导尿耳静脉，以提供静脉注射液（乳酸林格氏液; 5-10毫升/千克/小时）的手术过程中。安全脉搏血氧仪与MED舌粘膜表面的iCal胶带监测心脏速率和外周血氧合的饱和度（ _血氧饱和度）。
5. 放置在一个背卧位麻醉猪和剃从中间胸部尾端腹侧腹部到耻骨的腹侧。有两个交替的2.0％洗必泰外科擦洗和消毒水洗清洁这个区域。
6. 转移猪麻醉到手术套件和应用70％异丙醇冲洗的最终手术擦洗，晾干，然后再披动物。
7. 插入直肠温度探头大约2-4厘米到直肠监测体温。放置在一个循环水加热垫猪保持在手术过程正常体温（38-40℃）。
8. 悬垂性与放置在腹部周围的上覆象限模式4毛巾窗帘猪。放置第一个悬垂横跨剑突，第二悬垂沿腹部约5的c外侧面米外侧腹部中线。放置第三悬垂横跨骨盆的回肠波峰和第四悬垂性，像第二悬垂（尽管在相反侧），沿着腹部约5cm外侧到腹部中线的外侧面放置。
9. 放置一个大表的悬垂性，具有狭缝开口允许进入手术部位，在底层的毛巾窗帘并覆盖猪和整个手术表。最终的褶皱是一次性免缝悬垂放置在大桌子悬垂性。

2.腹部手术和导管肠淋巴干的

1. 使20cm的皮肤切口，用手术刀刀片以暴露下面的腹部肌肉。切割与单极电灼（20瓦设置）腹部肌肉层以暴露壁层腹膜。打开壁层腹膜的20cm的线段与梅岑鲍姆剪刀进入腹腔脏器和淋巴管。
2. 滋润所有组织用温水（37℃）的无菌盐水整个手术过程。轻轻抬起一大段小肠包括从腹腔结肠，盲肠，回肠和空肠和它exteriorize到猪的左翼访问上腹部，肝和淋巴管。在固定位置上的外置肠道额外的毛巾窗帘形成吊带轻轻支持肠。
3. 找到淋巴管，它奠定了约4厘米右肾静脉，腔静脉工头6厘米尾，中间-腹和胰腺^22,36,37附近肝右叶内脏方面下的颅内侧。识别淋巴管作为并列门静脉^36,37的右侧腹段的半透明结构。
4. 分离淋巴VESSEL从周围筋膜轻轻挑逗废除棉签涂抹附加的组织。一旦船只的横向方面从周围组织分离，创建容器下方的“隧道”口用细钝尖镊子。
5. 通过三项2-0丝线缝合用细镊子淋巴管下方。首先结扎最尾缝合闭塞，扩张和淋巴填充容器。目的地离开这个缝合相对长（4厘米）的端部到导管固定到淋巴管。放置另外两个缝线彼此隔开1.0厘米和大约1.0-1.5厘米颅到锁定尾缝合。离开这两个缝线具有“单一松散结扎领带”，以允许在导管的更快固定到容器。
   注意：位于最尾端结扎缝线和中间缝合（两个颅缝的）之间的淋巴管的段为导尿站点。关于苏TURE材料，如果需要2-0聚乳糖缝线可替代2-0丝线缝合。
6. 切一小口与虹膜剪船和扩张细钝钳的容器。用斜切端插入该容器插入约1.0-1.5厘米专门的导管（4.06外径（OD）×2.31毫米ID），和扎两个颅缝以固定导管就位。使用尾缝线的长缝合线端部的导管固定到容器中。
7. 用大量温生理盐水冲洗外置肠，轻轻将其返回到腹腔，确保肠道正确的解剖定位。
8. （从paralumbar窝腹侧5-10厘米）Exteriorize导管在左侧中间侧翼。使用手术刀切开皮肤，并从腹腔到皮肤表面传递套针来创建导管的外化的开口。使用大凯利钳从腹部CAV exteriorize导管穿过套管针开放性。
9. 用2-0聚乳糖缝合圆（锥形）针一个简单的连续缝合模式关闭壁层腹膜。用一个简单的间断缝合模式以2-0聚乳糖缝合关闭上圆针腹部肌肉层。
10. 用2-0缝合聚乳糖合皮肤的表皮下图案切割针。固定形象化导管与荷包缝合模式皮肤上切割针2-0尼龙缝合。
11. 将一个专门的夹克猪，同时仍麻醉以减轻其位置，并减少恢复期间猪的压力。

3.手术后的恢复和淋巴收集

1. 吸入麻醉停产前约10分钟，辖bupenorphine（0.1毫克/千克）肌注提供即时的术后镇痛。继续bupenorphine（0.1毫克/千克），每12小时24〜48小时，以保持手术后镇痛。
2. 监控猪的手术后并发症7天期每8-12小时。
3. 收集在500毫升聚丙烯洗瓶淋巴液，涂有乙二胺四乙酸（EDTA）和补充有抗生素;青霉素（6000 IU），链霉素（6毫克）和两性霉素B（3毫克）为7天期间，每12小时。

4.脂蛋白ApoB48，甘油三酯，胆固醇和总蛋白定量从淋巴收集

1. 离心淋巴样品在1800 XG在4℃下5分钟。收集上清液，并将其用于甘油三酯，胆固醇和总蛋白的定量。
2. 划分上清液分成三个样品：未稀释的样品，将样品以1:20稀释蒸馏水稀释1的最终样品：100用蒸馏水。
3. 使用未稀释的上清液来测量胆固醇水平，与市售的试剂盒。
4. 使用1:20和1:100稀释的样品以测量甘油三酯和总蛋白水平与市售的试剂盒和二辛可宁酸总蛋白分别测定。

5.定量脂蛋白ApoB48，从淋巴收集³⁸

1. 确定脂蛋白ApoB48的浓度与适于免疫Western印迹方法^38。用3-8％三 - 酯 - 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总淋巴。
2. 转移分离的蛋白质，以聚偏二氟乙烯膜（0.45微米），用山羊多克隆抗体的ApoB（1：4000）孵育它们，然后将其绑定与抗山羊次级抗体。
3. 采用量化与啮齿类动物纯化蛋白质ApoB48标准的线性光密度比较脂蛋白ApoB48化学发光。

Representative Results

仔猪肠淋巴干的淋巴导管允许大约1升的中央淋巴/ 24小时收集了7天的时间。在这个实验中收集的淋巴含有脂质代谢，即总淋巴蛋白，ApoB48脂蛋白，甘油三酯，总蛋白，和胆固醇的组分。表1列出代表数量从三头猪汇集淋巴结样品这些脂质成分的。值得注意的是，淋巴流和脂质成分是在符合由下列肠淋巴管的导管等研究者报告中央淋巴的值（淋巴流570±158 979±284毫升/ 24小时²⁵ 360±120 MLL / 24小时至1080±720毫升/ 24小时²⁶甘油三酯687±110毫克/分升⁹胆固醇63.1±5.6毫克/分升^9）;指示所述淋巴管内的导管的适当的位置。

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图2.快速蛋白液相色谱（FPLC）的资料表明在新生仔猪肠淋巴乳糜微粒制剂的纯度 。从三头猪使用1.006克/ ml的密度梯度离心协议是分开收集淋巴液。该曲线显示了（A）胆固醇和淋巴样品（B）中甘油三酯的单峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1.代表Western blot分析表明ApoB48和载脂蛋白B100脂蛋白的新生仔猪肠淋巴的贡献。淋巴从三个收集猪是使用1.006克/ ml的密度梯度超速离心协议分离。该图显示的衍生载脂蛋白B100等离子的约15％，少量的污染。 请点击此处查看该图的放大版本。

	淋巴特点
ApoB48（毫克/毫升）	3022.4±440.4
甘油三酯（毫克/分升）	607±203.6
胆固醇（毫克/ dL）的	58.5±9.6
结果表示为平均值±标准差（n = 3）

从仔猪7天手术后，结果重复MEA 收集肠淋巴表 1. 组件淋巴结祖雷斯贝尔，并表示为平均标准差（n = 3）

Discussion

收集肠淋巴是调查参与脂质^8-12和^13-15的药物代谢，癌症转移^16,17，贩卖细胞和免疫功能^18-26机制，在各种实验动物模型的好方法。事实上，收获大量任一外围设备（传入）和中央（传出和大型行李箱血管）淋巴的较长时间内的能力一直是特别重要的理解发生在以下与免疫调节剂^18-22挑战细胞群随时间的变化^，25,26。同样，中央淋巴结收集已划定参与脂蛋白代谢过程^8-12有用。淋巴集合的效用取决于导管手术的成功和导管的淋巴管内的通畅。

涉及的主要淋巴管导尿在大型动物的肠道淋巴引流一般采用的三种手术方法之一。第一种技术采用了颅肩方法进入胸导管覆盖普通颈静脉（牛胸导管^）5。第二个使用过右肾^32,33的中间-侧部纵横的上部侧面的方法。在这个视频中描述的第三种技术采用两种下腹正中或正中^22,35剖腹手术暴露胰腺附近的肠淋巴干和并列门静脉^22,36,37的右腹方面。虽然上侧面和腹侧中线手术技术使肠淋巴干的导管，我们相信腹侧中线方法允许用于与上腹部内有足够的空间来处理和操纵容器更好曝光容器。

重要的是，如在任何实验手术有步骤是杂色cularly对实验过程的成功结果的关键。有需要使用腹正中入路进入肠道淋巴管小心注意四个关键领域。首先，优良的血液供应形象化肠是必需的，因为延长损害循环于肠诱导缺血性肠粘膜坏死和手术失败。在此过程中一个“毛巾吊带”通过支持肠子确保了出色的组织灌注的重量减少了肠系膜血管的张力。其次，该容器包括仔细操作：在容器的周围的筋膜和脂肪组织，插入并牢固固定在容器用于长期淋巴集合中的导管的释放是成功导尿至关重要。事实上，有人建议，在新生仔猪的血管的结构完整性是不够健壮在成熟动物，因此可以很容易地撕开^39,40 41的长期淋巴集合，它是非常困难的从导管移除凝块作为凝块在导管内开发和是根深蒂固的淋巴管内。因此，这将大大降低（约40％）的动物成功地插入导管的长期试验（未公布的数据）的数字。因此，如果淋巴循环减慢，或在操作过程中已经停产了，淋巴导管，应重新插入颅从最初的导尿网站0.5-1厘米。

用于研究的科学问题所有型号都有inherant局限性和肠淋巴干插管也不例外。对于该过程的最显着的限制是不能有效地隔离，导尿的淋巴管，并在容器内稳定导管。因此，这个过程需要与出色的技术和手术技巧的人秒。另一个显著限制是，大型腹部手术期间延长手术时间增加了风险和手术后的发病率和死亡率。值得注意的是，然而，在我们的实验猪迅速从手术恢复，并没有并发症如感染，肠道肠梗阻，过度的组织损伤，或食欲不振以下的步骤。最肯定的，观察猪是光明的，反应灵敏，走动和进食正常后24小时手术，这持续了7天淋巴收集期。值得注意的是，尽管血清化学或全血计数在以下7天的实验，这些猪没有评估，由绵羊⁴¹在长期淋巴收集调查先前的工作表明，插管羊从未白细胞减少，淋巴细胞减少，低蛋白血症与电解质失衡或临床上塑造健康状况不佳（未公布数据）。重要的是与如上所述，这一观察关联到catheteriZED猪也显示出良好的健康的临床特点。

有趣的是，研究人员注意到，淋巴流动的量的变化。流动是白天最大时猪饲养活性与此时发生的日常收集淋巴的约70％。淋巴流动的剩余30％的休息和睡眠过程中发生的晚上。

在图1，图2和设置淋巴样品进一步表征表1中 。 图1显示污染的少量的衍生载脂蛋白B100等离子体的约15％。肠淋巴结内血浆脂蛋白的存在是经常出现在猪⁴²的观察。在乳猪，大部分脂蛋白是由肝脏产生的，并在等离子体释放。从等离子体，载脂蛋白B100可能渗入收集乳糜^42，然后通过淋巴血管网排入肠道淋巴干。层析的各种方法来评估采集淋巴液样品^42-45中胆固醇，甘油三酯和其它磷脂含量。 图2中的单峰清楚地表明了胆固醇和甘油三酯存在于乳糜微粒分数。这种方法是分析淋巴脂蛋白的方便和准确的技术和从肠淋巴⁴⁵评估乳糜微粒样品的纯度时，应考虑。最后，表1提供了从仔猪7天手术后收集的肠淋巴的生化成分。

总之，肠淋巴躯干的长期导尿是成功的幼猪。利用这种技术，淋巴导管可用于收集和调查脂质代谢的组分。淋巴，产生淋巴的量的纯度和脂质代谢的成分的量类似于目前在猪淋巴结中央在其他实验^9,25,26,42金额。结果表明，采用通过精心组织解剖及血管处理，以导尿肠淋巴干仔猪下腹正中手术方法是收集大量的中央淋巴结的好方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay