Introduction
Das lymphatische System ist ein wenig erforschten Gebiet der Physiologie. Präklinische Modelle von Lymph - Katheterisierung treten bei verschiedenen Tierarten 1-8 und werden von der pharmazeutischen Industrie und Forschungseinrichtungen verwendet , um Mechanismen der Lipid beteiligt untersuchen 8-12 und Arzneimittelmetabolismus 13-15, Krebsmetastasen 16 mit experimentellen Behandlung 17 und Immunfunktion 18 -26. Diese Studie untersucht die Verwendung von Darmlymphe Stamm Katheterisierung in einem Hausschwein Modellkomponenten von Lipoproteinstoffwechsel zu messen. Lipoprotein-Metabolismus in der Produktion und Sekretion von Chylomikronen, sowie Änderungen in assoziierten Lipiden und Gesamtprotein beteiligt. Dies sind wichtige Überlegungen gibt es große Unterschiede in den Lipidstoffwechsel zwischen häufig verwendeten Tiermodellen und Menschen und als solche Schweinemodelle unter Verwendung von Darmlymphe sammeln konnten vergleichbare Informationen zur Verfügung stellen für die Untersuchung Lipid michwechsel in Menschen 27-31.
Einen Schädelschulteransatz (dh Ductus Katheterisierung) 5, einen seitlichen oberen Flanke Ansatz 32-34 und einen ventralen Mittellinie oder para Ansatz 22,35: Mehrere chirurgische Techniken , um die Darmlymphe in großen Tierarten zu sammeln verwendet. Dieses Video beschreibt ausführlich den chirurgischen Eingriff bei Schweinen einen ventralen Mittellinie chirurgischen Ansatz für die Katheterisierung der Darmlymphe-Trunk. Sorgfältige chirurgische Technik ermöglicht diese Methode der lymphatischen Katheterisierung große Mengen von Lymphe und seiner Bestandteile über längere Zeiträume zu sammeln.
Diese Technik eröffnet eine Vielzahl von Anwendungen auf vielen Disziplinen verschiedene physiologische Funktionen untersuchen. Mögliche Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den ganzen Körper Lipoprotein und den Fettstoffwechsel, Immunüberwachung, Tumorentstehung und Metastasierung, Darmfunktion und die Entw begrenztent und Progression von Darmentzündungserkrankungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Verfahren an Versuchstieren in beschrieben sowohl die Video- und Manuskripts wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und anschließend die von der Canadian Council of Animal Care Richtlinien.
1. Chirurgische Anästhesie und OP-Vorbereitung der Neugeborenen-Schweine
- In einem separaten Vorraum, premedicate 25 kg Schweine in der Nähe der Basis des Halses mit einer intramuskulären Beruhigungsmittel-Anästhetika Cocktail mit: Azaperon (0,3 mg / kg), Ketamin-Hydrochlorid (10 mg / kg), Dexmedetomidin (15 ug / kg).
Hinweis: In Buprenorphin (0,005 bis 0,02 mg / kg) in der Pre-Anästhetika Cocktail für eine verbesserte intraoperative Schmerzkontrolle. - Anesthetize die Schweine mit inhalativen Isofluran Inhalationsgas (4-5% Isofluran in 500 ml-1000 ml / min O 2) eine Gesichtsmaske. Visualisieren Sie die Stimmbänder ein veterinär laryngeal Umfang mit (17-25 cm langen, geraden Klinge) und gelten topische 10% Lidocain Spay zum StimmSchnüre. Lassen Sie den Lidocain-Spray die Stimmbänder 30-60 sec vor der Intubation zu kontaktieren die Möglichkeit der Stimmbandkrampf und Obstruktion der Atemwege zu reduzieren.
- Intubate die Schweine durch einen Endotrachealtubus mit Manschette vorbei (5,0-7,0 mm Innendurchmesser (ID)) zwischen den Stimmbändern und Aufrechterhaltung der Narkose mit Isofluran - Gas (0,5-2,0% Isofluran bei 1.000-2.000 ml / min O 2) mit einem geschlossenen Schaltung Rückatmungsnarkosesystem in der gesamten Operation. Beurteilen Sie das Niveau der Anästhesie durch Kiefer Ton, und beide Pedal und der Augenlidreflexantworten. Abgelaufene Narkosegas wird ausgespült und außerhalb des Operationssaals entlüftet.
- Reinigen der Außenfläche des Ohres mit 2,0% Chlorhexidin chirurgischen Scheuerlösung durch eine 70% Isopropylalkohol gespült. Mit einem 20 G intravenösen Katheter, katheterisieren eine Ohrvene intravenöse Flüssigkeiten zu liefern (Ringer-Laktat-Lösung; 5-10 ml / kg / h) während der Operation. Sicherung ein Pulsoximeter an die Schleimhautoberfläche der Zunge mit medische Bandherzfrequenz und die Sättigung des peripheren Blutsauerstoffsättigung (SpO 2) zu überwachen.
- Setzen Sie den narkotisierten Schwein in einer dorsalen liegenden Position und rasieren die ventrale Abdomen ab Mitte der Thorax kaudal ventral des Schambeins. Reinigen Sie diesen Bereich mit zwei 2,0% Chlorhexidin OP-Bekleidungen und steriles Wasser wäscht abwechseln.
- Übertragen Sie die narkotisierten Schwein auf den OP-Bereich und wenden Sie die letzte chirurgische scheuern von 70% Isopropylalkohol spülen, trocknen lassen und dann drapieren das Tier.
- Legen Sie eine rektale Temperatursonde ca. 2-4 cm in das Rektum Körpertemperatur zu überwachen. Legen Sie die Schweine auf einem Wasserkreislauf Heizkissen auf normale Körpertemperatur (38-40 ° C) während eines chirurgischen Verfahrens aufrechtzuerhalten.
- Drapieren Sie das Schwein mit vier Handtücher drapiert in einer darüber liegenden Quadranten Muster um den Bauch gelegt. Legen Sie die erste drapieren über xiphisternum, die zweite drapieren entlang lateralen Seite des Bauches etwa 5 cm lateral der Bauchmittellinie. Platzieren des dritten Abdecktuch über das Ileum crest des Beckens und der vierten Abdecktuch, wie der zweite Abdecktuch (obwohl auf der gegenüberliegenden Seite) entlang der lateralen Seite des Abdomens angeordnet ist, etwa 5 cm an der Bauchmittellinie lateral.
- Platzieren Sie einen großen Tisch drapieren, mit einem Schlitz-Öffnung für den Zugang zu der Operationsstelle, über die zugrunde liegenden Handtuch drapiert und decken das Schwein und das gesamte OP-Tisch. Der letzte Vorhang ist ein Einweg-Steri-Drape über den großen Tisch drapieren gelegt.
2. Bauchchirurgie und Katheterisierung der intestinalen lymphatischen Trunk
- Machen Sie eine 20 cm Hautschnitt mit einem Skalpell die zugrunde liegenden Bauchmuskeln zu belichten. Inzision der Bauchmuskelschichten mit monopolar Elektrokoagulation (20 Watt Einstellung), um das Peritoneum parietale zu belichten. Öffnen Sie ein 20 cm lineares Segment Peritoneum parietale mit Metzenbaum Schere, um die Bauchorgane und Lymphgefäße zuzugreifen.
- Benetzen alle Gewebe mit warmem (37 ° C) sterile Kochsalzlösung für das gesamte chirurgische Verfahren. Heben Sie vorsichtig ein großes Segment des Darms einschließlich des Dickdarms, Blinddarm, Ileum und Jejunum aus der Bauchhöhle und exteriorisieren es an der linken Flanke des Schweins den Oberbauch, Leber und Lymphgefäße zuzugreifen. Sichern Sie den exteriorisiert Darm in Position mit zusätzlichen Handtuch drapiert eine Schlinge zu bilden, vorsichtig den Darm zu unterstützen.
- Suchen Sie das Lymphgefäßsystem, legt es etwa 4 cm kranial-medial des rechten Nierenvene, 6 cm kaudal-medial- ventralen der Kava - Vorarbeiter und unterhalb des viszeralen Aspekt der rechten Leberlappen in der Nähe der Bauchspeicheldrüse 22,36,37. Identifizieren Sie die Lymphgefäße als durchscheinend Struktur nebeneinander auf der rechten ventralen Segment der Pfortader 36,37.
- Trennen Sie das lymphatische vessel aus den umliegenden Faszie durch sanft das beiliegende Gewebe mit Q-Tip Applikatoren Hänselei weg. Sobald die seitlichen Aspekte des Schiffes aus dem umgebenden Gewebe getrennt sind, erstellen Sie einen "Tunnel" Öffnung unterhalb des Behälters mit feinen stumpfen Pinzette gekippt.
- Pass drei 2-0 Seidenfäden unterhalb der Lymphgefäße mit einer feinen Pinzette. Ligieren der kaudalste Naht zuerst zu verschließen, aufzuweiten und das Gefäß mit Lymphe füllen. verlassen gezielt die Enden dieses Fadens relativ lange (4 cm), um den Katheter an dem Lymphgefäß zu sichern. Platzieren beiden anderen Fäden 1,0 cm voneinander getrennt und sind ungefähr 1,0-1,5 cm kranial der gesicherten caudal Naht. Lassen Sie diese zwei Nähte mit einem "einzigen lose Ligatur tie" für eine schnellere Sicherung des Katheters in das Gefäß zu ermöglichen.
Hinweis: Das Segment des Lymphgefäß die sich zwischen der am weitesten kaudal Ligieren Naht und Mittelnaht (der beiden Schädelnähte) die Stelle zur Katheterisierung ist. In Bezug suture Material kann 2-0 Polyglactin Naht für 2-0 Seidenfäden ersetzen, falls erforderlich. - Schneiden Sie ein kleines Loch in das Gefäß mit Iris Schere und das Gefäß mit feinen stumpfen Pinzette aufzuweiten. Legen Sie ca. 1,0-1,5 cm spezieller Katheterschlauch (4,06 Außendurchmesser (OD) X 2,31 mm ID) mit einem abgeschrägten Ende in das Gefäß und binden die beiden Schädelnähte, den Katheter an Ort und Stelle zu sichern. Verwenden Sie die langen Fadenenden der Schwanz Naht um den Katheter in das Gefäß zu sichern.
- Waschen Sie die exteriorisiert Darm mit reichlich warmen Kochsalzlösung und vorsichtig in die Bauchhöhle zurückkehren korrekte anatomische Positionierung des Darms zu gewährleisten.
- Exteriorize den Katheter an der linken Mitte Flanke (5-10 cm ventral von der Hungergrube). Machen Sie einen Hautschnitt mit einem Skalpell und passieren einen Trokar aus der Bauchhöhle an der Hautoberfläche eine Öffnung für den Exteriorisation des Katheters zu schaffen. Verwenden Sie eine große Kelly Zange den Katheter aus der Bauch cav zu exteriorisierenkeit durch den Trokar Öffnung.
- Schließen Sie das Peritoneum parietale mit einem einfachen fortlaufenden Naht Muster von 2-0 Polyglactin Naht mit einem runden (verjüngte) Nadel. Schließen Sie die Bauchmuskelschichten mit einem einfachen Knopfnaht Muster mit einer 2-0 Polyglactin Naht auf einer runden Nadel.
- Schließen Sie die Haut in einem subkutikuläre Muster mit 2-0 Polyglactin Naht auf einem Schneide Nadel. Sichern Sie den exteriorisierten Katheter an der Haut mit einer Tabaksbeutelnaht Muster und einer 2-0 Nylonnaht auf einem Schneide Nadel.
- Legen Sie eine spezielle Jacke auf dem Schwein, während immer noch betäubt seine Platzierung zu erleichtern und zur Verringerung der Belastung des Schweins während der Genesung.
3. Post-chirurgische Wiederherstellung und Lymph-Sammlung
- Etwa 10 Minuten vor der Beendigung der Inhalationsanästhesie, verabreichen bupenorphine (0,1 mg / kg) intramuskulär sofort nach der Operation Analgesie zu liefern. Weiterhin bupenorphine (0,1 mg / kg) alle 12 h für 24-48 Stunden zu haltenpostoperative Analgesie.
- Überwachen Sie die Schweine, die für postoperative Komplikationen alle 8-12 Stunden für einen Zeitraum von 7 Tagen.
- Sammeln Sie die Lymphe in 500 ml-Polypropylen-Waschflaschen, beschichtet mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), und mit Antibiotika ergänzt; Penicillin (6.000 IE), Streptomycin (6 mg) und Amphotericin B (3 mg) alle 12 Stunden für einen Zeitraum von 7 Tagen.
4. Quantifizierung von Lipoprotein ApoB48, Triglyceride, Cholesterin und Gesamtprotein aus Lymph Gesammelte
- Zentrifugieren Sie die Lymphe Probe bei 1800 × g für 5 Minuten bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und es für die Quantifizierung von Triglycerid, Cholesterin und Gesamtprotein.
- Teilen Sie den Überstand in drei Proben: eine unverdünnte Probe, eine Probe 1:20 verdünnt destilliertem Wasser und eine letzte Probe 1: 100 verdünnt mit destilliertem Wasser.
- Verwenden Sie den unverdünnten Überstand Cholesterinspiegel zu messen, mit einem im Handel erhältlichen Kits.
- Verwenden Sie den 01.20 und 01.100 verdünnten Proben jeweils Triglycerid- und Gesamtproteinspiegel mit einem handelsüblichen Kit und dem Bicinchoninsäure-Gesamtprotein-Assay zu messen.
5. Quantifizierung von Lipoprotein ApoB48, Collected von Lymph 38
- Bestimmen Sie die Konzentration von Lipoprotein ApoB48 mit einer angepassten Immun Western Blotting Verfahren 38. Separate Gesamt Lymphe mit 3-8% Tris-Acetat- Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).
- Übertragung der aufgetrennten Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (0,45 um) und inkubieren sie mit einem polyklonalen Ziegen-Antikörper gegen ApoB (1: 4000), dann binden sie mit einem anti-Ziege sekundärem Antikörper.
- Quantifizieren der Lipoprotein ApoB48 mit Chemilumineszenz einen linearen densitometrische Vergleich mit gereinigtem Nagetier ApoB48 Protein-Standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymphatische Katheterisierung der intestinalen lymphatischen Stamm der Neugeborenen-Schweine ermöglicht Sammlung von etwa 1 l / 24 h zentrale Lymphe über einen Zeitraum von 7 Tagen. Die Lymphe in diesen Experimenten gesammelt enthaltenen Komponenten des Fettstoffwechsels, nämlich Gesamt Lymphe Protein, Lipoprotein ApoB48, Triglyceride, Gesamtprotein und Cholesterin. Tabelle 1 Highlights repräsentative Mengen dieser Lipidkomponenten aus gepoolten Lymphe Proben von drei Schweinen. Bemerkenswerterweise sind Fluss Lymphe und Lipidbestandteile in-line mit Werten von zentraler von anderen Forschern berichtet Lymphe folgenden Katheterisierung der intestinalen Lymphgefäßen (Lymphe 25 570 ± 158 bis 979 ± 284 ml / 24 h fließen, 360 ± 120 MLL / 24 h bis 1080 ± 720 ml / 24 h 26; Triglycerid 687 ± 110 mg / dL 9; Cholesterin 63,1 ± 5,6 mg / dL 9); angibt, die richtige Platzierung des Katheters in der Lymphgefäße.
ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Abbildung 2 A Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Profil , die Reinheit des chylomicron Zubereitung in neonatalen Schweins Darmlymphe zeigt. Lymphe gesammelt von drei Schweinen wird abgetrennt unter Verwendung eines 1,006 g / ml Dichte-Ultrazentrifugation Protokoll. Das Profil zeigt einen einzelnen Peak für (A) Cholesterin und (B) Triglycerid in der Lymphe Probe. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 1. Eine repräsentative Western - Blot - Analyse des Beitrags von ApoB48 und ApoB100 Lipoproteine bei neugeborenen Schwein Darmlymphe demonstriert. Lymph gesammelt von dreiSchweinen unter Verwendung einer 1,006 g / ml Dichte-Ultrazentrifugation Protokoll getrennt. Die Abbildung zeigt eine geringe Menge an Verunreinigung mit etwa 15% der Plasma abgeleiteten ApoB100. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Lymph Merkmale | |
| ApoB48 (mg / ml) | 3022,4 ± 440,4 |
| Triglycerid (mg / dl) | 607 ± 203,6 |
| Cholesterol (mg / dl) | 58,5 ± 9,6 |
| Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± SD (n = 3) | |
Tabelle 1. Bestandteile der Darmlymphe gesammelt von Neugeborenen Schweine 7 Tage nach der Operation. Ergebnisse mea wiederholt werdenmen der Lymphe und als Mittelwert SD (n = 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Darmlymphe Sammeln ist eine ausgezeichnete Methode Mechanismen der Lipid beteiligt zu untersuchen , 8-12 und 13-15 Droge Stoffwechsel, Krebsmetastasen 16,17, Zellhandel und Immunfunktion 18-26, in verschiedenen experimentellen Tiermodellen. Tatsächlich hat die Fähigkeit , große Mengen zu ernten entweder peripher (zuführenden) und Zentral (abführenden und großen Kofferraum Gefäße) Lymphe über einen längeren Zeitraum war besonders wichtig für zeitliche Veränderungen zu verstehen , die von 18 bis 22 in Zellpopulationen folgenden Herausforderungen mit immunmodulierenden Mitteln auftreten , 25,26. Ebenso hat Sammlung von zentralen Lymphe hilfreich bei der Abgrenzung in Lipoproteinstoffwechsel beteiligten Prozesse 8-12. Die Nützlichkeit der Lymphe Sammlung ist abhängig vom Erfolg der Katheterisierung Verfahrens und die Durchgängigkeit des Katheters innerhalb des Lymphgefäß.
Katheterisierung der großen Lymphgefäße beteiligtDarm-Lymphdrainage bei großen Tieren verwendet in der Regel eine von drei chirurgische Ansätze. Die erste Technik verwendet einen Schädel Schulter Ansatz der Ductus die gemeinsame Halsvene (Kuh Ductus) , die über 5 einzugeben. Die zweite verwendet eine obere Flanke Ansatz über die Mitte der lateralen Seite der rechten Niere 32,33. Die dritte Technik , wie in diesem Video beschrieben beschäftigt entweder eine ventralen Mittellinie oder para 22,35 Laparotomie die Darm-lymphatischen Stamm in der Nähe der Bauchspeicheldrüse zu entlarven und nebeneinander angeordnet auf der rechten Bauchseite der Pfortader 22,36,37. Obwohl sowohl die obere Flanke und ventralen Mittellinie chirurgische Techniken Katheterisierung der Darm-lymphatischen Stamm ermöglichen, glauben wir, die ventralen Mittellinie Ansatz für eine bessere Belichtung des Schiffes mit ausreichend Platz im Oberbauch, das Schiff zu handhaben und zu manipulieren.
Wichtig ist, wie in jeder experimentellen Chirurgie gibt es Schritte, die parti sindsonders entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis des experimentellen Verfahrens. Es gibt vier wichtige Bereiche, die Aufmerksamkeit mit dem ventralen Mittellinie Ansatz erfordern die intestinale Lymphgefäss zuzugreifen. Zuerst ausgezeichnete Blutversorgung des exteriorisierten Darm erforderlich ist, da eine längere kompromittiert Zirkulation in den Darm Nekrose und chirurgische Versagen ischämischen intestinalen Schleimhaut induziert. In diesem Verfahren reduziert eine "Handtuch Schlinge 'die Spannung an den mesenterialen Blutgefäße durch das Gewicht des Darmes Stütz ausgezeichnete Gewebeperfusion zu gewährleisten. Zweitens vorsichtig Manipulationen des Schiffes, einschließlich: die Freigabe des Schiffes aus Faszie umgibt und Fettgewebe, Einfügen und fest den Katheter in das Gefäß für die Langzeit Lymphe Sammlung Sicherung ist von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Katheterisierung. Tatsächlich wird vorgeschlagen , dass die strukturelle Integrität der Gefäße bei neugeborenen Schweinen ist nicht so robust wie in ausgewachsenen Tieren und als solche leicht 39,40 reißen 41, ist es sehr schwierig , das Gerinnsel aus dem Katheter zu entfernen , da das Gerinnsel in dem Katheter entwickelt und befindet sich in der Lymphgefäß tief verwurzelte. Folglich wird diese erheblich reduzieren (ca. 40%), die Zahl der Tiere erfolgreich für Experimente langfristige katheterisierte (nicht veröffentlichte Daten). Deshalb, wenn Lymphfluss verlangsamt wird oder während des Verfahrens abgebrochen, des lymphatischen Katheter sollte kranial 0,5-1 cm von der anfänglichen Katheterisierung Stelle wieder eingesetzt werden.
Alle Modelle verwendet wissenschaftliche Fragestellungen zu untersuchen, haben inherant Einschränkungen und Katheterisierung der intestinalen lymphatischen Stamm ist keine Ausnahme. Der deutlichste Einschränkung für das Verfahren ist die Unfähigkeit, das Lymphgefäßsystem, um effektiv zu isolieren, Katheterisierung und den Katheter in das Gefäß zu stabilisieren. Als solches erfordert dieses Verfahren Menschen mit hervorragenden technischen und chirurgische Geschicklichkeits. Eine andere wesentliche Einschränkung ist, dass eine längere Operationszeiten bei großen abdominalen Chirurgie und erhöht das Risiko postoperativer Morbidität und Mortalität. Bemerkenswert ist, jedoch erholten sich die Schweine in unserem Experiment schnell von der Operation, und es gab keine Komplikationen wie Infektionen, Darm-Ileus, übermäßige Gewebeschäden oder Inappetence nach dem Eingriff. Sicherlich wurden Schweine beobachtet hell, die auf sein, ambulating und in der Regel 24 Stunden nach der Operation zu essen und diese weiter über der 7-tägigen Lymphe Erfassungszeitraum. Bemerkenswert ist , obwohl Serumanalysen oder ein komplettes Blutbild wurden in diesen Schweinen nach dem 7 Tage Versuch nicht bewertet, frühere Arbeiten von den Ermittlern in langfristigen Lymphe Sammlung bei Schafen 41 gezeigt , dass katheterisierte Schafe waren nie Leukopenie, lymphopenischen, hypoproteinämische mit Elektrolytstörungen oder klinisch porträtiert schlechte Gesundheit (nicht veröffentlichte Daten). Wichtig ist und wie oben erwähnt, korreliert diese Beobachtung zu catheterized Schweine Anzeige auch klinische Merkmale von guter Gesundheit.
Interessanterweise ist festgestellt Ermittler Variationen in dem Volumen der Lymphe. Der Fluss war im Laufe des Tages am größten, wenn Schweine fraßen und aktiv mit etwa 70% der täglichen Lymphe gesammelter zu dieser Zeit auftritt. Die restlichen 30% der Lymphfluss geschieht am Abend während der Ruhe und Schlaf.
Weitere Charakterisierung der Lymphe Proben sind in den Figuren bereitgestellt 1, 2 und Tabelle 1. 1 zeigt , eine geringe Menge an Verunreinigung mit etwa 15% des Plasma - abgeleiteten ApoB100. Das Vorhandensein von Plasma - Lipoprotein innerhalb Darmlymphe ist eine Beobachtung , die 42 bei Schweinen häufig auftritt. In Ferkel wird die Mehrheit des Lipoproteins durch die Leber und Freigabe in Plasma erzeugt. Aus dem Plasma, sickert ApoB100 wahrscheinlich in Chylusgefässe 42 und dann durch das lymphatische Gefäßnetz SammelAbflüsse in den Darm lymphatischen Stamm. Verschiedene Verfahren der Chromatographie verwendet werden , um Cholesterin, Triglyceride und andere Phospholipid Inhalte in den gesammelten Proben Lymphe 42-45 beurteilen. Die einzelnen Peak in Figur 2 zeigt deutlich , Cholesterin und Triglyceride sind in der Chylomikronen Fraktion. Diese Methode ist eine bequeme und genaue Technik der Profilierungs Lymphe Lipoproteine und sollte in Betracht gezogen werden , wenn die Reinheit von chylomicron Proben aus Darmlymphe 45 zu beurteilen. Schließlich Tabelle 1 zeigt die biochemischen Komponenten der intestinalen von neonatalen Schweinen gesammelt Lymphe 7 Tage nach der Operation.
Abschließend ist eine langfristige Katheterisierung der Darmlymphe Stamm erfolgreich bei jungen Schweinen. Mit dieser Technik können lymphatische Katheterisierung verwendet werden, um Komponenten des Lipidmetabolismus zu sammeln und zu untersuchen. Die Reinheit der Lymphe, Menge der Lymphe hergestellt und die Mengen der Bestandteile des Lipidstoffwechselssind ähnlich 9,25,26,42 in Schweine zentrale Lymphe in anderen Experimenten zu Mengen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine ventralen Mittellinie chirurgischen Ansatz mit einer sorgfältigen Gewebe Dissektion und Gefäß unter Verwendung der Handhabung des Darm-lymphatischen Stamm in jungen Schweinen zu katheterisieren ist eine ausgezeichnete Methode große Mengen an zentralen Lymphe zu sammeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miller laryngoscope blade | Welch Allyn | 68044 | 182 mm length |
| Surgivet advisor: Vital signs monitor | Surgivet | V9203 | |
| Rectal temperature probe | Surgivet | V3417 | |
| Mono-polar electrosurgery generator | Valley Lab | ||
| Metzenbaum scissors | Fine Science | 14518-18 | |
| Tuffier retractor | Stevens | 162-11-676 | |
| Mosquito forceps | Stevens | 162-7-10 | |
| Kelly forceps-curved (14cm) | Stevens | 162-7-38 | |
| Allis tissue forceps | Stevens | 162-7-38 | |
| Forceps dressing-eye (10.2cm) | Stevens | 162-18-780 | |
| Forceps dressing-Adison (12.1cm) | Stevens | 162-17-2510 | |
| Needle Drivers | Stevens | 162-V98-42 | |
| Iris scissors | Fine science | 14058-11 | |
| Circulating water pump | Jorvet | J-783X | |
| Maxitherm-Vinyl blanket | Jorvet | J-784C | |
| Q tip applicators | Fisher Scientific | 22-037-960 | |
| Catheterization tubing (4.06 OD X 2.31 ID) | Braintree Scientific Inc. | MRE-160 | Micro-Renethane implantation tubing |
| 2-0 silk suture | Ethicon | LA556 | |
| 2-0 polyglactin suture | Ethicon | J443H | 2-0 vicryl |
| Large animal jacket | Lomir Biomedical Inc. | SSJ2YC | |
| Polypropylene wash bottles | Fisher Scientific | 03-409-22C | 500 ml |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | D4333 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 60-00-4 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Azaperone | Elanco Animal Health | Stresnil | |
| Dexmedetomidine hydrochloride | Zoetis | 6295 | Dexdomitor |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | 05260-5 | IsoFlo |
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | 2626 | Ketaset |
| Bupenorphine hydrochloride | Champion Alstoe Animal Health | DIN:02347510 | |
| 6 mm Endotracheal tube | Jorvet | J-165d | |
| 10% Lidocaine spray | AstraZeneca | DIN:02003767 | |
| 4 % Chlorhexidine surgical scrub | Partnar Animal Health | PCH-011 | Diluted: 2.0% solution |
| 3M Surgical steri- drape | 3M Health Care | 1040 | |
| SDS page gel | Invitrogen | EA0375BOX | 3-8 % tris acetate |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | 0.45 μm pore size |
| ApoB antibody | EMD Millipore | AB742 | 1:4000 dilution |
| Donkey anti-goat IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2304 | |
| ECL Prime Western Blotting Reagent | GE Healthcare LifeSciences | RPN2232 | |
| Triglyceride Kit | Wako Pure Chemicals | 998-40391/994-40491 | |
| Total Cholesterol Kit | Wako Pure Chemicals | 439-17501 | |
| Total Protein | Pierce | 23225 | Bicinchoninic Acid Assay |
References
- Lindsay, F. E. F. The cisterna chyli as a source of lymph samples in the cat and dog. Res. Vet. Sci. 17, 256-258 (1974).
- Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr. Protoc. Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
- Wang, X. D., et al. Intestinal uptake and lymphatic absorption of beta-carotene in ferrets: a model for human beta-carotene metabolism. Am. J. Physiol. 263 (4 Pt 1), G480-G486 (1992).
- Hein, W. R., Barber, T., Cole, S. A., Morrison, L., Pernthaner, A. Long-term collection and characterization of afferent lymph from the ovine small intestine. J.Immunol. Methods. 293 (1-2), 153-168 (2004).
- Hartmann, P. E., Lascelles, A. K. The flow and lipid composition of thoracic duct lymph in the grazing cow. J. Physiol. 184 (1), 193-202 (1966).
- Redgrave, T. G., Dunne, K. B. Chylomicron formation and composition in unanaesthetised rabbits. Atherosclerosis. 22 (3), 389-400 (1975).
- Binns, R. M., Hall, J. G. The paucity of lymphocytes in the lymph of unanaesthetised pigs. Br. J. Exp. Pathol. 47 (3), 275-280 (1966).
- Ohlsson, L., Kohan, A. B., Tso, P., Ahren, B. GLP-1 released to the mesenteric lymph duct in mice: Effects of glucose and fat. Regul. Pept. 189, 40-45 (2014).
- Ho, H. T., Kim, D. N., Lee, K. T. Intestinal apolipoprotein B-48 synthesis and lymphatic cholesterol transport are lower in swine fed high fat, high cholesterol diet with soy protein than with casein. Atherosclerosis. 77 (1), 15-23 (1989).
- Arnold, M., Dai, Y., Tso, P., Langhans, W. Meal-contingent intestinal lymph sampling from awake, unrestrained rats. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. 302 (12), R1365-R1371 (2012).
- Nguyen, T. M., Sawyer, J. K., Kelley, K. L., Davis, M. A., Kent, C. R., Rudel, L. L. ACAT2 and ABCG5/G8 are both required for efficient cholesterol absorption in mice: evidence from thoracic lymph duct cannulation. J. Lipid Res. 53 (8), 1598-1609 (2012).
- Sato, M., Kawata, Y., Erami, K., Ikeda, I., Imaizumi, K. LXR agonist increases the lymph HDL transport in rats by promoting reciprocally intestinal ABCA1 and apo A-I mRNA levels. Lipids. 43 (2), 125-131 (2008).
- Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
- Sugawara, T., et al. Intestinal absorption of dietary maize glucosylceramide in lymphatic duct cannulated rats. J. Lipid Res. 51 (7), 1761-1769 (2010).
- Shackleford, D. M., et al. Contribution of lymphatically transported testosterone undecanoate to the systemic exposure of testosterone after oral administration of two andriol formulations in conscious lymph duct-cannulated dogs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306 (3), 925-933 (2003).
- Lespine, A., et al. Contribution of lymphatic transport to the systemic exposure of orally administered moxidectin in conscious lymph duct-cannulated dogs. Eur. J. Pharm. Sci. 27 (1), 37-43 (2006).
- Carr, J., Carr, I., Dreher, B., Betts, K. Lymphatic metastasis: invasion of lymphatic vessels and efflux of tumour cells in the afferent popliteal lymph as seen in the Walker rat carcinoma. J. Pathol. 132 (4), 287-305 (1980).
- Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. I. Lymphocyte circulation in gut-associated lymphoid tissue. Immunology. 42 (3), 469-474 (1981).
- Knight, J. S., Baird, D. B., Hein, W. R., Pernthaner, A. The gastrointestinal nematode Trichostrongylus colubriformis down-regulates immune gene expression in migratory cells in afferent lymph. BMC Immunol. 11, 51 (2010).
- Milling, S. W., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nat. Protoc. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Pernthaner, A., Cole, S. A., Gatehouse, T., Hein, W. R. Phenotypic diversity of antigen-presenting cells in ovine-afferent intestinal lymph. Arch. Med. Res. 33 (4), 405-412 (2002).
- Thielke, K. H., Pabst, R., Rothkotter, H. J. Quantification of proliferating lymphocyte subsets appearing in the intestinal lymph and the blood. Clin. Exp. Immunol. 117 (2), 277-284 (1999).
- Mayrhofer, G., Fisher, R. IgA-containing plasma cells in the lamina propria of the gut: failure of a thoracic duct fistula to deplete the numbers in rat small intestine. Eur. J. Immunol. 9 (1), 85-91 (1979).
- Beh, K. J. The origin of IgA-containing cells in intestinal lymph of sheep. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 55 (3), 263-274 (1977).
- Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. II. Migration to the intestinal lamina propria of antigen-specific cells generated in response to intestinal immunization in the pig. Immunology. 42 (3), 475-479 (1981).
- Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin. Exp. Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and thrombosis: insights from large animal models. J. Biomed. Biotechnol. 1, (2011).
- Getz, G. S., Reardon, C. A.
- Skold, B. H., Getty, R., Ramsey, F. K. Spontaneous atherosclerosis in the arterial system of aging swine. Am. J. Vet. Res. 27 (116), 257-273 (1966).
- Reiser, R., Sorrels, M. F., Williams, M. C. Influence of high levels of dietary fats and cholesterol on atherosclerosis and lipid distribution in swine. Circ. Res. 7, 833-846 (1959).
- Casani, L., Sanchez-Gomez, S., Vilahur, G., Badimon, L. Pravastatin reduces thrombogenicity by mechanisms beyond plasma cholesterol lowering. Thromb. Haemost. 94 (5), 1035-1041 (2005).
- Romosos, D. R., McGilliard, A. D. Preparation of thoracic and intestinal lymph duct shunts in calves. J. Dairy Sci. 53 (9), 1275-1278 (1970).
- Shannon, A. D., Lascelles, A. K. The intestinal and hepatic contributions to the flow and composition of thoracic duct lymph in young milk-fed calves. Q.J. Exp. Physiol. Cogn. Med. Sci. 5 (2), 194-205 (1968).
- Aliev, A. A. Intestinal lymph of ruminants. I. Operative techniques for collecting intestinal lymph from ruminants. Acta Vet.Hung. 38 (1-2), 105-120 (1990).
- Butterfield, A. B., Lumb, W. V., Litwak, P. Surgical preparation of miniature swine for atherosclerosis research. Am. J. Vet. Res. 37 (12), 1519-1523 (1976).
- Saar, L. I., Getty, R. Lymphatic system. Sisson and Grossman's: The anatomy of domestic animals. 2, W. B. Saunders Company. Philadelphia PA. 1343-1358 (1975).
- Zanchet, D. J., de Souza Montero, E. F. Pig liver sectorization and segmentation and virtual reality depiction. Acta. Cirurgica. Basilera. 17 (6), 382-387 (2002).
- Vine, D. F., Takechi, R., Russell, J. C., Proctor, S. D. Impaired postprandial apolipoprotein-B48 metabolism in the obese, insulin-resistant JCR:LA-cp rat: increased atherogenicity for the metabolic syndrome. Atherosclerosis. 190 (2), 282-290 (2007).
- Li, W. C., et al. Biomechanical properties of ascending aorta and pulmonary trunk in pigs and humans. Xenotransplantation. 15 (6), 384-389 (2008).
- Arkill, K. P., Moger, J., Winlove, C. P. The structure and mechanical properties of collecting lymphatic vessels: an investigation using multimodal nonlinear microscopy. J. Anat. 216 (5), 547-555 (2010).
- Uwiera, R. R. E., et al. Plasmid DNA induces increased lymphocyte trafficking: a specific role for CpG motifs. Cell. Immunol. 214 (2), 155-164 (2001).
- Black, D. D., Davidson, N. O. Intestinal apolipoprotein synthesis and secretion in the suckling pig. J. Lipid Res. 30 (2), 207-218 (1989).
- Heider, J. G., Pickens, C. E., Lawrence, K. A. Role of acyl CoA:cholesterol acyltransferase in cholesterol absorption and its inhibition by 57-118 in the rabbit. J. Lipid Res. 24, 1127-1134 (1983).
- Noh, S. K., Koo, S. I. Milk sphingomyelin is more effective than egg sphingomyelin in inhibiting intestinal absorption of cholesterol and fat in rats. J. Nutr. 134, 2611-2616 (2004).
- Brunham, L. R., et al. Intestinal ABCA1 directly contributes to HDL biogenesis in vivo. J. Clin. Invest. 116 (4), 1052-1062 (2006).
