Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

צנתור לטווח ארוך של טרונק לימפה במעי וגביית הלימפה חזירים ילודים

Published: March 5, 2016 doi: 10.3791/53457
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta

Introduction

מערכת הלימפה היא שטח אלתר של פיזיולוגיה. במודלים פרה של צנתור הלימפה להתרחש מיני בעלי חיים שונה 1-8 ומשמשים והפרמצבטיקה ומכוני מחקר לחקור מנגנוני המעורבים שומנים 8-12 סמים מטבוליזם 13-15, גרורות סרטן 16 עם טיפול ניסיוני 17, ו -18 תפקוד מערכת החיסון -26. מחקר זה בוחן את שימוש צנתור מטען לימפה במעי במודל חזיר בית למדוד רכיבים של מטבוליזם שומנים בדם. מטבוליזם Lipoprotein מעורב בייצור הפרשת chylomicrons, כמו גם משינויים בשיעורי שומנים הקשורים חלבון כולל. אלה הם שיקולים חשובים כמו שיש הבדלים גדולים במטבוליזם שומנים בין במודלים של מכרסמים נפוצים ובני אדם וככזה, במודלי חזירים לאסוף לימפה במעי יכולים לספק מידע דומה יותר ללימוד שומנים ליtabolism באנשים 27-31.

מספר טכניקות כירורגיות משמשות כדי לאסוף את לימפה במעי במינים של בעלי חיים גדולים: גישת כתף גולגולתי (כלומר, צנתור צינור חזה) 5, גישת אגף העליון לרוחב 32-34, וכן קו אמצע גחון או גישת paramedian 22,35. וידאו זה מתאר בפירוט את ההליך הניתוח חזירים בגישה כירורגית קו אמצע גחון עבור הצנתור של המטען לימפה במעי. היתרי טכניקה כירורגית זהירות שיטה זו של צנתור הלימפה לאסוף כמויות גדולות של הלימפה מרכיביו לאורך תקופות ממושכות של זמן.

טכניקה זו פותחת מספר עצום של יישומים לתחומים רבים לבחון פונקציות פיסיולוגיות שונות. יישומים יכולים לכלול, אך אינם מוגבלים, ליפופרוטאין גוף וחילוף חומרי שומנים, immunosurveillance, בראשית גידול וגרור, תפקוד מעיים, ואת developmאף אוזן גרון והתקדמות של מחלה דלקתית של המעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים על חיות ניסוי המתוארות הוא סרטון ואת כתב היד אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש ועקב אחר ההנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית של טיפול בבעלי החיים.

1. הרדמה כירורגית והכנת כירורגים של החזירים הילודים

  1. בחדר כניסה נפרדת, premedicate 25 חזירים ק"ג סמוך לבסיס של הצוואר עם קוקטייל תרופות הרגעה-הרדמה תוך שרירית המכיל: azaperone (0.3 מ"ג / ק"ג), קטמין הידרוכלוריד (10 מ"ג / ק"ג), dexmedetomidine (15 מיקרוגרם / ק"ג).
    הערה: הוסף עצירות (0.005-.02 מ"ג / ק"ג) של קוקטייל התרופות מראש הרדמה לשיכוך כאבים התוך אופרטיבית משופרת.
  2. להרדים את חזירים בגז משאיפת isoflurane בשאיפה (isoflurane 4-5% ב 500 מ"ל-1000 מ"ל / דקה O 2) באמצעות מסיכת פנים. דמיינו את מיתרי הקול באמצעות היקף בגרון וטרינרי (ארוך להב ישר 17-25 ס"מ), ולהחיל עיקור לידוקאין 10% אקטואלי אל ווקאליתמייתרים. אפשר ספריי לידוקאין לפנות מיתרי הקול 30-60 שניות לפני אינטובציה כדי לצמצם את האפשרות של התכווצות מיתרי הקול ואת חסימה בדרכי הנשימה.
  3. לצנרר החזירים על ידי העברת הטובוס אזוקים (5.0-7.0 מ"מ קוטר פנימי (ID)) בין מיתרי הקול ולשמור על הרדמה בגז isoflurane (isoflurane 0.5-2.0% ב 1,000-2,000 מ"ל / דקה O 2) באמצעות ארגז סגור מעגל rebreathing מערכת הרדמה במהלך הניתוח. להעריך את רמת הרדמה מטון לסת, ושניהם תגובות רפלקס דוושת palpebral. גז הרדמה פג תוקף הוא יישחט פרק מחוץ לחדרי הניתוח.
  4. נקה את המשטח החיצוני של האוזן עם פתרון לקרצף כירורגית 2.0% chlorhexidine ואחריו שטיפת אלכוהול איזופרופיל 70%. עם קטטר 20 G תוך ורידי, קטטר וריד האוזן לספק עירוי נוזלים (פתרון Ringer Lactated; 5-10 מ"ל / ק"ג / שעה) במהלך הניתוח. Secure דופק oximeter אל פני השטח הרירי של הלשון עם medקלטת iCal כדי לפקח על קצב לב ואת הרוויה של חמצון דם היקפי (SpO 2).
  5. הנח את החזיר הרדים בעמדת גב שכיבתה לגלח את בטן הגחון מאמצע חזה caudally להיבט הגחון של החיק. נקו בתחום זה עם שני לסירוגין כלורהקסידין 2.0% סקראבס כירורגית ושוטף במים סטרילית.
  6. מעביר את החזיר המורדם כדי לחדרי הניתוח ולהחיל את לקרצף כירורגית הסופית של שטיפת אלכוהול איזופרופיל 70%, לאפשר לו להתייבש, ולאחר מכן לעטוף את החיה.
  7. הכנס בדיקת טמפרטורת רקטלית כ ​​סנטימטר 2-4 לתוך פי הטבעת כדי לפקח על טמפרטורת גוף. מניחים החזירים על כרית חימום הסירקולציה המחודשת מים כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית (C ° 38-40) במהלך ההליך הכירורגי.
  8. לכרוך את החזיר עם וילונות ארבעה מגבות להציב דפוס ברבע שמעליה ברחבי הבטן. מניח את הווילון הראשון ברחבי xiphisternum, הווילון השני לאורך בצד הלטרלי של הבטן כ 5 גמ 'לרוחב קו אמצע הבטן. מניח את הווילון השלישי ברחבי ציצת ​​ileal של האגן ואת הווילון הרביעי, כמו הווילון השני (אם כי בצד הנגדי), מושם לאורך בצד הלטרלי של הבטן כ 5 סנטימטרים לרוחב קו אמצע הבטן.
  9. מניחים וילון שולחן גדול, עם פתיחת חריץ המאפשר גישה לאתר כירורגית, על וילונות מגבת שבבסיס ולכסות את חזיר ושולחן הכירורגי כולו. הווילון הסופי הוא וילון Steri-הפנויה מונח על וילון השולחן הגדול.

2. ניתוח בטן צנתור של טרונק הלימפה המעיים

  1. לעשות חתך בעור 20 ס"מ עם להב סכין המנתחים כדי לחשוף את שרירי הבטן הבסיסית. לחתוך את שכבות שרירי הבטן עם electrocautery מונו-קוטבית (20 הגדרה ואט) לחשוף את הצפק הקודקודית. פתח קטע ליניארי 20 ס"מ של הצפק הקודקודית במספריים מצנבאום לגשת הקרביים בטן וכלי הלימפה.
  2. להרטיב את כל הרקמות עם חם (37 מעלות צלזיוס) תמיסת מלח סטרילית עבור ההליך הכירורגי כולו. הרם בעדינות פלח גדול של המעי כולל המעי הגס, cecum, מעי והמעי הריק יתכן שרמת מחלל הבטן exteriorize אותו בכנף שמאל של חזיר כדי לגשת בבטן העליונה, כבד וכלי הלימפה. אבטח את המעי exteriorized בעמדה עם וילונות מגבת נוספת לגבש קלע לתמוך המעי בעדינות.
  3. אתר את כלי הלימפה, היא מטילה כ 4 סנטימטרים גולגולתי המדיאלי של הווריד התקין כליות, 6 סנטימטרים זנב-medial- גחון של מנהלי עבודת caval ומתחת ההיבט הקרבי של האונה הכבדה ממש ליד הלבלב 22,36,37. זהה את כלי הלימפה כמבנה שקוף חופף למגזר הגחון הימני של וריד שער 36,37.
  4. הפרד את הלימפה Vessאל מן fascia שמסביב ידי מנסים לשחזר את הרקמה המצורפת בעדינות עם אפליקטורים Q-Tip. לאחר ההיבטים לרוחב של כלי מופרדים מן הרקמה הסובבת, ליצור פתח "מנהרה" מתחת לכלי השייט עם בוטה קנס שקצהו מלקחיים.
  5. לעבור שלושה 2-0 תפרי משי מתחת לכלי השייט הלימפה עם מלקחיים בסדר. ולקשור את תפר הזנב ביותר הראשון כדי לחסום, להתרחב ולמלא את הכלי עם הלימפה. Purposefully לעזוב את הקצוות של תפר זה ארוך יחסית (4 ס"מ) כדי לאבטח את הקטטר אל כלי הלימפה. מניח שני תפרים אחרים מופרדים 1.0 סנטימטר אחד מהשני והם כ 1.0-1.5 סנטימטר גולגולתי אל תפר הזנב המאובטח. להשאיר את שני התפרים הללו עם "עניבה ליגטורה רופפת יחידה 'כדי לאפשר לאבטחה מהירה יותר של קטטר לתוך הכלי.
    הערה: הקטע של כלי הלימפה ממוקם בין תפר ligating הזנב ביותר התפר באמצע (של שני תפרי הגולגולת) הוא האתר עבור צנתור. לגבי suחומר ture, 2-0 תפר polyglactin יכול להוות תחליף 2-0 תפרי משי במידת צורך.
  6. חותכי חור קטן לתוך הכלי עם מספרי איריס להרחיב את הכלי עם מלקחיים בוטים בסדר. הכנס כ 1.0-1.5 סנטימטר של צינורות קטטר מיוחדים (4.06 קוטר חיצוני (OD) X 2.31 מזהים מ"מ) עם קצה משופע לתוך הכלי ולקשור שני תפרי הגולגולת כדי לאבטח את הקטטר במקום. השתמש קצות התפר הארוכים של תפר הזנב כדי לאבטח את הקטטר אל כלי השיט.
  7. שטוף את מעי exteriorized עם כמויות של מלח חם ובעדינות להחזירו חלל הבטן להבטיח מיצוב אנטומי נכון של המעיים.
  8. Exteriorize הקטטר את פרוותו אמצע שמאל (5-10 ס"מ ventrally מן fossa paralumbar). לעשות חתך בעור עם אזמל להעביר נקז מחלל הבטן אל פני העור כדי ליצור פתח עבור ההחצנה של הקטטר. השתמש מלקחיים גדולים קלי exteriorize הקטטר מן CAV בטןity דרך פתח הנקז.
  9. סגור את הצפק הקודקודית עם דפוס תפר מתמשך פשוט של תפר 2-0 polyglactin עם מחט עגול (קונים). סגור את שכבות שרירי הבטן עם דפוס תפר קטע פשוט עם תפר 2-0 polyglactin על מחט עגול.
  10. סגור את העור בדפוס subcuticular עם 2-0 תפר polyglactin על מחט חיתוך. Secure את הקטטר exteriorized על העור עם דפוס תפר ארנק חוט תפר ניילון 2-0 על מחט חיתוך.
  11. מניח מעייל מיוחד על החזיר ועדיין מורדם להקל מיקומה ולהפחית את הלחץ של החזיר במהלך התאוששות.

שחזור 3. פוסט-כירורגית אוסף לימפה

  1. כ -10 דקות לפני הפסקת הרדמה משאיפת, לנהל bupenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) לשריר כדי לספק שיכוך כאבים שלאחר ניתוח מיידי. המשך bupenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 12 שעות במשך 24-48 שעות כדי לשמור עלשיכוך כאבים שלאחר ניתוח.
  2. צג החזירים לסיבוכים ניתוחים דואר בכל שעות 8-12 לתקופה של 7 ימים.
  3. אסוף את הלימפה 500 מ"ל בקבוקים לשטוף פוליפרופילן, מצופה חומצה ethylenediamine tetraacetic (EDTA), שיושלם עם אנטיביוטיקה; פניצילין (6,000 IU), סטרפטומיצין (6 מ"ג) ו- B amphotericin (3 מ"ג) כל 12 שעות למשך 7 ימים.

4. כימות ApoB48 ליפופרוטאין, טריגליצריד, כולסטרול וחלבון הסכום שנגבה מן לימפה

  1. צנטריפוגה מדגם הלימפה 1,800 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. איסוף supernatant ולהשתמש בו עבור כימות של טריגליצרידים, כולסטרול וחלבון כולל.
  2. מחלק את supernatant לשלוש דוגמאות: מדגם חי, מים מזוקקים מדולל מדגם 1:20 מדגם סופי המדולל 1: 100 עם מים מזוקקים.
  3. השתמש supernatant חי כדי למדוד את רמות כולסטרול, עם ערכה זמינה מסחרי.
  4. השתמש 1:20 01:100 דגימות בדילול למדוד טריגליצרידים ורמות חלבון הכולל עם ערכה זמינה מסחרי ואת assay חלבון bicinchoninic סך-חומצת בהתאמה.

5. כימות של ליפופרוטאין ApoB48, שנאספו לימפה 38

  1. קבע את הריכוז של ליפופרוטאין ApoB48 עם שיטה מערבית סופגת מותאמת חיסון 38. הלימפה הכולל הפרד (SDS-PAGE) ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן טריס-acetate- 3-8%.
  2. מעבירים את החלבונים מופרדים אל קרום פלואוריד polyvinylidene (0.45 מיקרומטר) דגירה אותם עם נוגדן polyclonal עז אל apoB (1: 4,000), ולאחר מכן לאגד את זה עם נוגדנים משני אנטי-עז.
  3. לכמת את ליפופרוטאין ApoB48 עם chemiluminescence באמצעות השוואה ליניארי densitometric עם תקן חלבון ApoB48 מכרסם מטוהרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צנתור הלימפה של המטען הלימפה מעיים של חזיר בילוד מאפשר איסוף של כ 1 L / 24 שעות של הלימפה מרכזית על תקופה של 7 ימים. הלימפה שנאסף בניסויים זה הכיל רכיבים של מטבוליזם שומנים בדם, כלומר חלבון הלימפה הכולל, ליפופרוטאין ApoB48, טריגליצרידים, חלבון כולל, וכולסטרול. טבלת 1 מדגיש כמויות נציג והמרכיבים השומניים אלה מדגימים הלימפה משולבת של שלושה חזירים. יש לציין, זרימת הלימפה המרכיבים השומנים נמצאים-בקנה אחד עם הערכים של הלימפה המרכזי שדווח על ידי חוקרים אחרים הבאים צנתור של כלי הלימפה מעיים (הלימפה לזרום 570 ± 158 ל 979 ± 284 מ"ל / 24 hr 25, 360 ± 120 MLL / 24 hr כדי 1080 ± 720 מ"ל / 24 hr 26; טריגליצרידים 687 ± 110 מ"ג / ד"ל 9; כולסטרול 63.1 ± 5.6 מ"ג / ד"ל 9); המציין מיקום נכון של הקטטר בתוך כלי הלימפה.

ontent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 2
איור 2. כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) פרופיל הוכחת טוהר הכנה chylomicron ב לימפה במעי החזיר בילוד. הלימפה שנאסף שלושה חזירים מופרדים באמצעות פרוטוקול ultracentrifugation שיפוע צפיפות 1.006 גרם / מיליליטר. הפרופיל מציג שיא יחיד (א) כולסטרול (B) הטריגליצרידים במדגם הלימפה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 1. ניתוח כתם מערבי נציג הוכחת התרומה ליפופרוטאינים ApoB48 ו ApoB100 ב לימפה במעי החזיר בילוד. לימפה שנאספה שלושחזירים מופרדים באמצעות פרוטוקול ultracentrifugation שיפוע צפיפות 1.006 גרם / מיליליטר. הנתון מוכיח כמות קטנה של זיהום עם כ 15% של פלזמה נגזרת ApoB100. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מאפיינים לימפה
ApoB48 (מ"ג / מ"ל) 3022.4 ± 440.4
הטריגליצרידים (מ"ג / ד"ל) 607 ± 203.6
כולסטרול (מ"ג / ד"ל) 58.5 ± 9.6
תוצאות מבוטאות ממוצע ± סטיית תקן (n = 3)

טבלת 1. רכיבים של לימפה במעי שנאספו חזירים בילוד 7 ימים שלאחר ניתוח. תוצאות חוזרות measures של הלימפה מבוטא מתכוון SD (n = 3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

איסוף לימפה במעי הוא שיטה מצוינת לחקור מנגנוני המעורבים שומנים 8-12 ו מטבוליזם התרופה 13-15, סרטן גרורות 16,17, סחר תא ותפקוד מערכת חיסון 18-26, במודלים של בעלי חיים שונים הניסיונות. ואכן, את היכולת לקצור כמויות גדולות של מי היקפי (מביא) ומרכז (efferent וכלי גזע גדולים) הלימפה פני תקופה ממושכת לא הייתה חשובה במיוחד להבנת שינויים זמניים המתרחשים אוכלוסיות תאים הבאים אתגרים עם סוכני ויסות חיסוניים 18-22 , 25,26. באופן דומה, אוסף של הלימפה המרכזי כבר מועיל המגדירה התהליכים המעורבים במטבוליזם ליפופרוטאין 8-12. השירות של אוסף הלימפה תלוי ההצלחה של הליך הצנתור ואת patency של הקטטר בתוך כלי הלימפה.

צנתור של כלי הלימפה הגדול מעורבניקוז הלימפה מעיים בחיות גדולות בדרך כלל משתמש באחת משלוש גישות כירורגיות. הטכניקה הראשונה משתמשת בגישת כתף גולגולתי להיכנס צינור החזה שמעל וריד הצוואר המשותף (צינור החזי פרה) 5. השני משתמש בגישת אגף עליונה על ההיבט באמצע לרוחב של הכליה התקינה 32,33. השיטה השלישית כמתוארת בסרט הזה מעסיק אחת מעמד קו אמצע גחון או paramedian 22,35 laparotomy לחשוף את תא מטען הלימפה המעיים ליד הלבלב חופף להיבט התקין הגחון של וריד השער 22,36,37. למרות שגם קו אמצע האגף ועל הגחון העליונים טכניקות כירורגיות לאפשר צנתור של מטען הלימפה המעיים, אנו מאמינים כי גישת קו אמצע הגחון מאפשרת חשיפה טובה יותר של הכלי עם מרחב מספיק בתוך הבטן העליונה להתמודד ולטפל הספינה.

חשוב לציין, כמו בכל ניתוח הניסיון ישנם צעדים אשר Particularly חיוני התוצאה המוצלחת של ההליך הניסיון. ישנם ארבעה תחומים עיקריים הדורשים תשומת לב קפדנית בגישת קו אמצע הגחון כדי לגשת כלי הלימפה מעיים. ראשית, אספקת דם מצוינת מעי exteriorized נדרשה, כמו במחזור נפגע ממושכת המעי גורם נימק רירית וכישלון כירורגית מעיים איסכמית. בהליך זה 'קלע מגבת' מפחית את המתח על כלי דם mesenteric ידי תמיכת המשקל של המעיים להבטיח זלוף רקמות מעולה. שנית, מניפולציות זהירות של כלי השיט כולל: שחרור כלי השיט מן הסובבים fascia ורקמת שומן, החדרה ובתקיפות הבטחת קטטר בתוך הכלי לאיסוף הלימפה לטווח ארוך הן קריטיות עבור צנתור מוצלח. ואכן, הוא הציע את השלמות המבנית של כלי בחזירים בילוד הוא לא יציב כמו אצל בעלי חיים בוגרים וככזה יכול לקרוע בקלות 39,40 41, זה מאוד קשה כדי להסיר את הקריש מן קטטר כמו קריש מפתחת בתוך קטטר והוא מושרש בתוך כלי הלימפה. כתוצאה מכך, זה יהיה לצמצם במידה ניכרת (כ -40%) את המספרים של חיות צינתור בהצלחה לניסויים לטווח ארוך (נתונים שלא פורסמו). לכן, אם זרימת הלימפה מואטת או פסיקה לשווק במהלך ההליך, הקטטר הלימפה יש לרחם cranially 0.5-1 סנטימטר מאתר הצנתור הראשוני.

כל הדגמים לשמש כדי לחקור שאלות מדעיות יש מגבלות inherant צנתור של המטען הלימפה מעיים הוא לא יוצא מן הכלל. המגבלה הבולטת ביותר עבור ההליך היא חוסר היכולת לבודד ביעילות, לצנתר הספינה הלימפה, ולייצב את הקטטר בתוך הכלי. ככזה, הליך זה דורש אנשים עם מיומנות טכנית וכירורגים מעוליםים. מגבלה משמעותית נוספת היא כי פעמים כירורגית ממושכות במהלך ניתוח בטן גדול מגדילות את הסיכון לאחר ניתוח תחלואה ותמותה. יש לציין, עם זאת, החזירים בניסוי שלנו התאוששו במהירות מניתוח ולא היו סיבוכים כמו זיהומים, ileus מעיים, פגיעה ברקמות מוגזמת, או inappetence ביצוע ההליך. בהחלט, חזירים נצפו להיות בהיר, קשוב, ambulating ואכילה בדרך כלל 24 שעות לאחר ניתוח וזה נמשך כל תקופת אוסף 7 יום הלימפה. יש לציין, כי כימיות בסרום או ספירת דם מלאה לא הוערכו חזירים אלה בעקבות הניסוי 7 יום, עבודה קודמת של החוקרים באוסף הלימפה לטווח ארוך בכבשים 41 הוכיחו כי כבשים צינתור היו מעולם leukopenic, lymphopenic, hypoproteinemic עם חוסר איזון אלקטרוליטי או קליני מגלם בריאות לקויה (נתונים שלא פורסמו). חשוב לציין וכאמור לעיל, תצפית זו וקושרת catheteriחזירי Zed גם מוצג מאפיינים קליניים של בריאות טובה.

מעניין, חוקרים ציינו וריאציות בהיקף זרימת הלימפה. התזרים היה גדול ביותר במהלך היום כאשר חזירים היו מפרנסים פעילים עם כ 70% של הלימפה היומי שנאסף המתרחשים בשלב זה. 30% הנותרים של זרימת הלימפה קורה בערב במהלך מנוחה ושינה.

אפיון נוסף של דגימות הלימפה ניתן איורים 1, 2 ו טבלת 1. איור 1 מדגים כמות קטנה של זיהום עם כ 15% של פלזמה נגזרים ApoB100. הנוכחות של ליפופרוטאין פלזמה בתוך לימפה במעי תצפית כי לעיתים קרובות מתרחשת בחזירים 42. חזירים יונקים, הרוב של ליפופרוטאין המיוצר על-ידי הכבד ושוחרר בפלזמה. מן הפלזמה, ApoB100 מחלחל סביר לתוך איסוף lacteals 42 ולאחר מכן דרך רשת כלי הדם הלימפהמנקז לתוך תא מטען הלימפה המעיים. שיטות שונות של כרומטוגרפיה משמשים כדי להעריך כולסטרול, טריגליצרידים ותכנים פוספוליפידים אחרים בדגימות שנאספו הלימפה 42-45. השיא היחיד באיור 2 מדגים בבירור כולסטרול וטריגליצרידים נוכחים בשבריר chylomicron. שיטה זו היא טכניקה נוחה ומדויקת של ליפופרוטאינים הלימפה פרופיל וצריכה יובאה בחשבון לצורך הערכה טוהר דגימות chylomicron מ לימפה במעי 45. לבסוף, טבלה 1 מספקת רכיבי ביוכימיים של לימפה במעי שנאספו חזירים בילוד 7 ימים שלאחר הניתוח.

לסיכום, צנתור ארוך טווח של הגזע לימפה במעי מצליח חזירים צעירים. בעזרת טכניקה זו, ניתן להשתמש צנתור הלימפה לאסוף ולחקור מרכיבי מטבוליזם השומנים. טוהר הלימפה, כמות הלימפה המופקת לכמויות של מרכיבים של מטבוליזם שומניםהם דומים לסכומים נוכחים הלימפה מרכזי חזיר בניסויים אחרים 9,25,26,42. תוצאות המחקר מראים כי העסקת גישה ניתוחית קו אמצע גחון עם דיסקציה רקמות זהירה כלי טיפול לצנתר המטען הלימפה במעי חזירים צעירים היא שיטה מצוינת לאסוף כמויות גדולות של הלימפה מרכזי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Miller laryngoscope blade Welch Allyn 68044 182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor Surgivet V9203
Rectal temperature probe Surgivet V3417
Mono-polar electrosurgery generator Valley Lab
Metzenbaum scissors Fine Science 14518-18
Tuffier retractor Stevens 162-11-676
Mosquito forceps Stevens 162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm) Stevens 162-7-38
Allis tissue forceps Stevens 162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm) Stevens 162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm) Stevens 162-17-2510
Needle Drivers Stevens 162-V98-42
Iris scissors Fine science 14058-11
Circulating water pump Jorvet J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket Jorvet J-784C
Q tip applicators Fisher Scientific 22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID) Braintree Scientific Inc. MRE-160 Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture Ethicon LA556
2-0 polyglactin suture Ethicon J443H 2-0 vicryl
Large animal jacket Lomir Biomedical Inc. SSJ2YC
Polypropylene wash bottles Fisher Scientific 03-409-22C 500 ml
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich D4333
EDTA Sigma Aldrich 60-00-4
Amphotericin B Sigma Aldrich A2411
Azaperone Elanco Animal Health Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride Zoetis 6295 Dexdomitor
Isoflurane Abbott Animal  Health 05260-5 IsoFlo
Ketamine hydrochloride Zoetis 2626 Ketaset
Bupenorphine hydrochloride Champion Alstoe Animal Health DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube Jorvet J-165d
10% Lidocaine spray AstraZeneca DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub Partnar Animal Health PCH-011 Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape 3M Health Care 1040
SDS page gel Invitrogen EA0375BOX 3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane Millipore IPVH00010 0.45 μm pore size
ApoB antibody  EMD Millipore AB742 1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent GE Healthcare LifeSciences RPN2232   
Triglyceride Kit Wako Pure Chemicals 998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit Wako Pure Chemicals 439-17501
Total Protein  Pierce  23225 Bicinchoninic Acid Assay

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindsay, F. E. F. The cisterna chyli as a source of lymph samples in the cat and dog. Res. Vet. Sci. 17, 256-258 (1974).
  2. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr. Protoc. Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  3. Wang, X. D., et al. Intestinal uptake and lymphatic absorption of beta-carotene in ferrets: a model for human beta-carotene metabolism. Am. J. Physiol. 263 (4 Pt 1), G480-G486 (1992).
  4. Hein, W. R., Barber, T., Cole, S. A., Morrison, L., Pernthaner, A. Long-term collection and characterization of afferent lymph from the ovine small intestine. J.Immunol. Methods. 293 (1-2), 153-168 (2004).
  5. Hartmann, P. E., Lascelles, A. K. The flow and lipid composition of thoracic duct lymph in the grazing cow. J. Physiol. 184 (1), 193-202 (1966).
  6. Redgrave, T. G., Dunne, K. B. Chylomicron formation and composition in unanaesthetised rabbits. Atherosclerosis. 22 (3), 389-400 (1975).
  7. Binns, R. M., Hall, J. G. The paucity of lymphocytes in the lymph of unanaesthetised pigs. Br. J. Exp. Pathol. 47 (3), 275-280 (1966).
  8. Ohlsson, L., Kohan, A. B., Tso, P., Ahren, B. GLP-1 released to the mesenteric lymph duct in mice: Effects of glucose and fat. Regul. Pept. 189, 40-45 (2014).
  9. Ho, H. T., Kim, D. N., Lee, K. T. Intestinal apolipoprotein B-48 synthesis and lymphatic cholesterol transport are lower in swine fed high fat, high cholesterol diet with soy protein than with casein. Atherosclerosis. 77 (1), 15-23 (1989).
  10. Arnold, M., Dai, Y., Tso, P., Langhans, W. Meal-contingent intestinal lymph sampling from awake, unrestrained rats. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. 302 (12), R1365-R1371 (2012).
  11. Nguyen, T. M., Sawyer, J. K., Kelley, K. L., Davis, M. A., Kent, C. R., Rudel, L. L. ACAT2 and ABCG5/G8 are both required for efficient cholesterol absorption in mice: evidence from thoracic lymph duct cannulation. J. Lipid Res. 53 (8), 1598-1609 (2012).
  12. Sato, M., Kawata, Y., Erami, K., Ikeda, I., Imaizumi, K. LXR agonist increases the lymph HDL transport in rats by promoting reciprocally intestinal ABCA1 and apo A-I mRNA levels. Lipids. 43 (2), 125-131 (2008).
  13. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
  14. Sugawara, T., et al. Intestinal absorption of dietary maize glucosylceramide in lymphatic duct cannulated rats. J. Lipid Res. 51 (7), 1761-1769 (2010).
  15. Shackleford, D. M., et al. Contribution of lymphatically transported testosterone undecanoate to the systemic exposure of testosterone after oral administration of two andriol formulations in conscious lymph duct-cannulated dogs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306 (3), 925-933 (2003).
  16. Lespine, A., et al. Contribution of lymphatic transport to the systemic exposure of orally administered moxidectin in conscious lymph duct-cannulated dogs. Eur. J. Pharm. Sci. 27 (1), 37-43 (2006).
  17. Carr, J., Carr, I., Dreher, B., Betts, K. Lymphatic metastasis: invasion of lymphatic vessels and efflux of tumour cells in the afferent popliteal lymph as seen in the Walker rat carcinoma. J. Pathol. 132 (4), 287-305 (1980).
  18. Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. I. Lymphocyte circulation in gut-associated lymphoid tissue. Immunology. 42 (3), 469-474 (1981).
  19. Knight, J. S., Baird, D. B., Hein, W. R., Pernthaner, A. The gastrointestinal nematode Trichostrongylus colubriformis down-regulates immune gene expression in migratory cells in afferent lymph. BMC Immunol. 11, 51 (2010).
  20. Milling, S. W., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nat. Protoc. 1 (5), 2263-2270 (2006).
  21. Pernthaner, A., Cole, S. A., Gatehouse, T., Hein, W. R. Phenotypic diversity of antigen-presenting cells in ovine-afferent intestinal lymph. Arch. Med. Res. 33 (4), 405-412 (2002).
  22. Thielke, K. H., Pabst, R., Rothkotter, H. J. Quantification of proliferating lymphocyte subsets appearing in the intestinal lymph and the blood. Clin. Exp. Immunol. 117 (2), 277-284 (1999).
  23. Mayrhofer, G., Fisher, R. IgA-containing plasma cells in the lamina propria of the gut: failure of a thoracic duct fistula to deplete the numbers in rat small intestine. Eur. J. Immunol. 9 (1), 85-91 (1979).
  24. Beh, K. J. The origin of IgA-containing cells in intestinal lymph of sheep. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 55 (3), 263-274 (1977).
  25. Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. II. Migration to the intestinal lamina propria of antigen-specific cells generated in response to intestinal immunization in the pig. Immunology. 42 (3), 475-479 (1981).
  26. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin. Exp. Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
  27. Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and thrombosis: insights from large animal models. J. Biomed. Biotechnol. 1, (2011).
  28. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  29. Skold, B. H., Getty, R., Ramsey, F. K. Spontaneous atherosclerosis in the arterial system of aging swine. Am. J. Vet. Res. 27 (116), 257-273 (1966).
  30. Reiser, R., Sorrels, M. F., Williams, M. C. Influence of high levels of dietary fats and cholesterol on atherosclerosis and lipid distribution in swine. Circ. Res. 7, 833-846 (1959).
  31. Casani, L., Sanchez-Gomez, S., Vilahur, G., Badimon, L. Pravastatin reduces thrombogenicity by mechanisms beyond plasma cholesterol lowering. Thromb. Haemost. 94 (5), 1035-1041 (2005).
  32. Romosos, D. R., McGilliard, A. D. Preparation of thoracic and intestinal lymph duct shunts in calves. J. Dairy Sci. 53 (9), 1275-1278 (1970).
  33. Shannon, A. D., Lascelles, A. K. The intestinal and hepatic contributions to the flow and composition of thoracic duct lymph in young milk-fed calves. Q.J. Exp. Physiol. Cogn. Med. Sci. 5 (2), 194-205 (1968).
  34. Aliev, A. A. Intestinal lymph of ruminants. I. Operative techniques for collecting intestinal lymph from ruminants. Acta Vet.Hung. 38 (1-2), 105-120 (1990).
  35. Butterfield, A. B., Lumb, W. V., Litwak, P. Surgical preparation of miniature swine for atherosclerosis research. Am. J. Vet. Res. 37 (12), 1519-1523 (1976).
  36. Saar, L. I., Getty, R. Lymphatic system. Sisson and Grossman's: The anatomy of domestic animals. 2, W. B. Saunders Company. Philadelphia PA. 1343-1358 (1975).
  37. Zanchet, D. J., de Souza Montero, E. F. Pig liver sectorization and segmentation and virtual reality depiction. Acta. Cirurgica. Basilera. 17 (6), 382-387 (2002).
  38. Vine, D. F., Takechi, R., Russell, J. C., Proctor, S. D. Impaired postprandial apolipoprotein-B48 metabolism in the obese, insulin-resistant JCR:LA-cp rat: increased atherogenicity for the metabolic syndrome. Atherosclerosis. 190 (2), 282-290 (2007).
  39. Li, W. C., et al. Biomechanical properties of ascending aorta and pulmonary trunk in pigs and humans. Xenotransplantation. 15 (6), 384-389 (2008).
  40. Arkill, K. P., Moger, J., Winlove, C. P. The structure and mechanical properties of collecting lymphatic vessels: an investigation using multimodal nonlinear microscopy. J. Anat. 216 (5), 547-555 (2010).
  41. Uwiera, R. R. E., et al. Plasmid DNA induces increased lymphocyte trafficking: a specific role for CpG motifs. Cell. Immunol. 214 (2), 155-164 (2001).
  42. Black, D. D., Davidson, N. O. Intestinal apolipoprotein synthesis and secretion in the suckling pig. J. Lipid Res. 30 (2), 207-218 (1989).
  43. Heider, J. G., Pickens, C. E., Lawrence, K. A. Role of acyl CoA:cholesterol acyltransferase in cholesterol absorption and its inhibition by 57-118 in the rabbit. J. Lipid Res. 24, 1127-1134 (1983).
  44. Noh, S. K., Koo, S. I. Milk sphingomyelin is more effective than egg sphingomyelin in inhibiting intestinal absorption of cholesterol and fat in rats. J. Nutr. 134, 2611-2616 (2004).
  45. Brunham, L. R., et al. Intestinal ABCA1 directly contributes to HDL biogenesis in vivo. J. Clin. Invest. 116 (4), 1052-1062 (2006).

Tags

רפואה גיליון 109 תא המטען לימפה במעי ניתוח לימפה efferent לטווח ארוך חזירים בילוד ליפופרוטאין ApoB48 מטבוליזם ליפופרוטאין צנתור
צנתור לטווח ארוך של טרונק לימפה במעי וגביית הלימפה חזירים ילודים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Uwiera, R. R., Mangat, R., Kelly,… More

Uwiera, R. R., Mangat, R., Kelly, S., Uwiera, T. C., Proctor, S. D. Long-Term Catheterization of the Intestinal Lymph Trunk and Collection of Lymph in Neonatal Pigs. J. Vis. Exp. (109), e53457, doi:10.3791/53457 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter