新生豚のリンパ節の腸リンパトランクやコレクションの長期カテーテル法

Introduction

リンパ系は、生理の​​understudied領域です。リンパカテーテル法の前臨床モデルは、異なる動物種^1-8で発生し、脂質^8-12および薬物代謝^13-15、実験的治療¹⁷と癌転移¹⁶に関与するメカニズムを調査するために製薬産業や研究機関によって使用され、免疫機能^{18 -26。}この研究は、リポタンパク質代謝の成分を測定するために、国内のブタモデルにおける腸管リンパトランクカテーテルの使用を探ります。リポタンパク質代謝を産生および分泌カイロミクロンの、ならびに関連する脂質および総蛋白質の変化に関与しています。一般的に使用される齧歯類モデルと人間の間のような脂質代謝の主要な違いがあるように、これらは私を、脂質を研究するためのより多くの比較可能な情報を提供することができる腸のリンパ節を収集するために豚のモデルを採用し、重要な考慮すべき事項であります人々 ^27-31でtabolism。

いくつかの外科技術は、大規模な動物種における腸管リンパを収集するために使用されている：頭蓋肩のアプローチ（ すなわち、胸管カテーテル法^）5、横上部脇腹のアプローチ^32-34、および腹側正中線またはparamedianアプローチ^22,35。このビデオでは、具体的に腸のリンパトランクのカテーテル挿入のための腹側正中外科的アプローチを使用して、ブタにおいて外科的手順を説明します。慎重な手術法は、長期間にわたって大リンパの量とその成分を収集するためにリンパカテーテル法のこの方法が可能になります。

この技術は、様々な生理学的機能を調べる多くの分野への応用の無数を開きます。アプリケーションが含まれる可能性があり、これらに限定されないが、全身リポタンパク質と脂質代謝、免疫学、腫瘍の起源及び転移、腸機能、およびdevelopm耳鼻咽喉科や腸の炎症性疾患の進行。

Protocol

ビデオと原稿の両方で説明した実験動物でのすべての手順は、制度的動物実験委員会によって承認され、動物ケアのカナダ人評議会によって設定されたガイドラインに従いました。

1.外科麻酔や新生児ブタの外科的準備

1. アザペロン（0.3ミリグラム/キログラム）、塩酸ケタミン（10mg / kgの）、デクスメデトミジン（15μgの/キログラム）：分離控室では、25キロの含有筋肉内鎮静麻酔薬カクテルと首の付け根の近くに豚をpremedicate。
   注：強化された術中疼痛管理のためのプレ麻酔薬カクテルにブプレノルフィン（0.005から0.02ミリグラム/キログラム）を追加します。
2. フェイスマスクを使用して（500ミリリットル、千ミリリットル/分のO ₂で四から五パーセントイソフルラン）吸入イソフルラン吸入ガスと豚を麻酔。獣医の喉頭スコープ（17〜25センチメートル長いストレート刃）を使用して、声帯を視覚化し、ボーカルへの局所10％のリドカインの去勢を適用コー​​ド。リドカインスプレーは声帯の痙攣および気道閉塞の可能性を低減するために、挿管に30-60秒前に声帯に連絡することを許可します。
3. 声帯の間（5.0〜7.0ミリメートル内径（ID））カフ付き気管内チューブを渡すことで豚を挿管し、イソフルランガスで麻酔を維持（1,000〜2,000 mlの0.5から2.0パーセントイソフルラン/分O _2）が閉じを使用して、手術全体の麻酔システムを再呼吸回路。顎トーンによって麻酔のレベル、およびペダルと眼瞼反射応答の両方を評価します。期限切れの麻酔ガスを掃気し、手術室の外に排出されます。
4. 70％イソプロピルアルコールリンスに続いて2.0％クロルヘキシジン手術用スクラブ溶液で耳の外面を清掃してください。手術中に、20 G静脈カテーテルを用いて、静脈内輸液（5〜10ミリリットル/ kg /時間乳酸リンゲル液）を提供するために、耳静脈をカテーテルを挿入。メッドの舌の粘膜表面にパルスオキシメータを確保iCalのテープは、心拍数および末梢血酸素飽和度（SpO _2）を監視します。
5. 背臥位で麻酔をかけた豚を置き、恥骨の腹側面に半ば胸部尾側から腹側腹部を剃ります。 2交互に2.0％クロルヘキシジン手術用スクラブし、滅菌水洗浄でこのエリアを清掃してください。
6. 手術室に麻酔豚を移し、70％イソプロピルアルコールリンスの最終的な手術用スクラブを適用し、それを乾燥させ、その後、動物を羽織ります。
7. 体温を監視するために、直腸内に、直腸温度プローブ約2〜4センチ挿入します。外科手術中に正常な体温（38-40°C）を維持するために、水の循環加熱パッド上豚を置きます。
8. 腹部の周りの上層象限パターンに配置された4タオルのカーテンで豚を羽織ります。約5℃、腹部の外側面に沿って第2のドレープ、剣状突起全体で最初のドレープを配置腹部正中線にメートルの横。骨盤の回腸稜と第四ドレープ全体で三ドレープを配置し、（反対側が）二ドレープのように、腹部の外側面腹部正中線に横約5cmに沿って配置されています。
9. 根底にあるタオルドレープの上に、手術部位へのアクセスを可能にするスリット開口と、大きなテーブルのドレープを置き、豚、全体の手術台をカバーしています。最終的なドレープは、大きなテーブルのドレープの上に配置された使い捨てsteriドレープです。

腸リンパ本幹の2腹部手術やカテーテル

1. 根本的な腹筋を公開するために手術用メスの刃で20センチの皮膚切開を行います。壁側腹膜を露出させるためにモノポーラ電気メス（20ワットの設定）で腹部の筋肉層を切開。腹部内臓やリンパ管にアクセスするためにMetzenbaumのはさみで頭頂腹膜20cmの直線セグメントを開きます。
2. 全体の外科的処置のための暖かい（37°C）滅菌生理食塩水ですべての組織を湿ら。静かに腹腔から結腸、盲腸、回腸および空腸を含む小腸の大部分を持ち上げ、上腹部、肝臓やリンパ管にアクセスするには、豚の左脇腹にそれを体外に出します。優しく腸をサポートするためにスリングを形成するために追加のタオルドレープとの位置に体外に腸を固定します。
3. リンパ管の位置を確認し、それが約4センチメートル右腎静脈、6センチメートル尾-medial-大静脈職長の腹側および膵臓^22,36,37の近くに右肝葉の内臓の側面の下の頭蓋-内側を産みます。門脈^36,37の右腹側セグメントに並置された半透明の構造としてリンパ管を識別します。
4. リンパヴェスを切り離しエル優しくQチップアプリケーターで付着した組織を離れてからかうことにより、周囲の筋膜から。容器の外側の側面は、周囲の組織から分離されると、微鈍鉗子をひっくり返して容器の下の「トンネル」の開口部を作成します。
5. 細かいピンセットでリンパ管の下に3 2-0絹縫合糸を渡します。 、閉塞拡張とリンパで容器を埋めるために最初に最も尾側の縫合糸を結紮。意図的にリンパ管にカテーテルを固定する（4センチ）比較的長いこの縫合糸の端を残します。他の二つの縫合糸を配置し、互いから1.0センチメートルを分離し、保護された尾縫合糸に頭蓋約1.0〜1.5センチメートルです。血管内にカテーテルを速く確保を可能にするために '一緩い結紮ネクタイ'でこれら2本の縫合糸を残します。
   注：（2頭蓋縫合の）ほとんどの尾側結紮縫合糸と中間縫合糸の間に位置するリンパ管のセグメントは、カテーテル挿入のためのサイトです。 suコマンドについて必要に応じて、トゥーレ材料は、2-0ポリグラクチン縫合糸は、2-0絹縫合糸の代わりにすることができます。
6. アイリスハサミで容器に小さな穴をカットし、微鈍鉗子で血管を拡張。容器内に傾斜した端部に特殊なカテーテルチューブ（4.06外径（OD）X 2.31ミリメートルのID）の約1.0〜1.5センチメートルを挿入し、所定の位置にカテーテルを固定するための2つの頭蓋縫合糸を結びます。容器にカテーテルを固定するために尾縫合糸の長い縫合糸の端を使用してください。
7. 温かい生理食塩水のおびただしい量の体外に腸を洗浄し、静かに腸の正しい解剖学的な位置決めを確実に腹腔に戻します。
8. 左ミッド脇腹（腹側paralumbar窩5〜10センチメートル）でカテーテルを体外に出します。メスで皮膚切開を行い、カテーテルの具象化するための開口部を作成するために、皮膚表面に腹腔からトロカールを通過します。腹部CAVからカテーテルを体外に出すために、大きなケリー鉗子を使用しますトロカールの貫通開口性。
9. ラウンド（テーパー）針で2-0ポリグラクチン縫合糸の単純連続縫合パターンで壁側腹膜を閉じます。ラウンド針に2-0ポリグラクチン縫合糸でシンプルな結節縫合パターンで腹部の筋肉層を閉じます。
10. 切断針に2-0ポリグラクチン縫合糸で表皮下のパターンで皮膚を閉じます。巾着縫合パターンおよび切断針上の2-0ナイロン縫合糸で皮膚に体外カテーテルを固定します。
11. まだその配置を容易にし、リカバリ時に豚のストレスを軽減するために麻酔しながら、豚に特化したジャケットを置きます。

3.手術後の回復とリンパコレクション

1. 前吸入麻酔の中止へ約10分で、即時術後の鎮痛を提供するために、筋肉内にbupenorphine（0.1ミリグラム/キログラム）を管理。 bupenorphineを続行（0.1ミリグラム/キログラム）24〜48時間を維持するために12時間ごとに術後の鎮痛。
2. 手術後の合併症のために7日間の期間ごとに8-12時間を豚を監視します。
3. エチレンジアミン四酢酸（EDTA）でコーティングし、抗生物質を補充した500 mlのポリプロピレン製の洗瓶でリンパ液を集めます。ペニシリン（6000 IU）、ストレプトマイシン（6 mg）をアムホテリシンB（3 mg）を7日間ごとに12時間。

リポタンパク質ApoB48、トリグリセリド、コレステロールと総タンパクの4定量リンパから収集

1. 4℃で5分間、1800×gでリンパサンプルを遠心します。上清を収集し、トリグリセリド、コレステロールおよび総タンパク質の定量化のためにそれを使用しています。
2. 希釈していないサンプル、サンプル希釈1：20蒸留水と1希釈した最終サンプル：蒸留水で100 3サンプルに上清を分割します。
3. 市販のキットを用いて、コレステロールレベルを測定するために希釈されていない上澄みを使用してください。
4. 1時20分と午前1時10分を使用します0は、それぞれ、市販のキットおよびビシンコニン酸総タンパク質アッセイを用いてトリグリセリドおよび総タンパク質レベルを測定するため、サンプルを希釈しました。

リンパ³⁸から収集したリポタンパク質ApoB48 5.定量化、

1. 適応免疫ウエスタンブロッティング法³⁸でリポタンパクApoB48の濃度を決定します。 3〜8％トリス - 酢酸塩、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で区切り、総リンパ。
2. ポリフッ化ビニリデン膜（0.45μmの）に分離したタンパク質を移し、アポB（1：4000）にヤギポリクローナル抗体でそれらをインキュベートし、その後、抗ヤギ二次抗体とそれをバインドします。
3. 精製されたげっ歯類ApoB48タンパク質標準との線形濃度測定の比較を用い​​て、化学発光とリポ蛋白ApoB48を定量化します。

Representative Results

新生児の豚の腸リンパ本幹のリンパカテーテル法は、7日間にわたって中央リンパの約1 L / 24時間の収集を可能にします。この実験で収集さリンパは、脂質代謝、すなわち総リンパタンパク質、ApoB48リポタンパク質、トリグリセリド、総タンパク質、およびコレステロールの成分を含有していました。表1のハイライト3匹のブタのプールされたリンパサンプルからこれらの脂質成分の代表的な量。特に、リンパの流れと脂質成分は、インライン腸リンパ管のカテーテル法以下の他の研究者によって報告された中央のリンパの値を持つ（リンパ節は570±158から979±284ミリリットル/ 24時間^{25、360±120} MLL / 24時間に流れています1080 720ミリリットル/ 24時間^26±;トリグリセリド687±110ミリグラム/ dLの^9;コレステロール63.1±5.6ミリグラム/ dLの^9）。リンパ血管内カテーテルの適切な配置を示します。

1 ">：" =キープtogether.within-ページFO」ontent
図2.新生児の豚の腸リンパ中のカイロミクロン調製物の純度を証明する高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）プロファイル 。 1.006グラム/ mlの密度勾配超遠心分離プロトコールを用いて分離された3匹のブタから​​収集リンパ。プロファイルは、（A）コレステロールやリンパのサンプル中の（B）トリグリセリドのための単一のピークを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1.新生児の豚の腸リンパ中ApoB48とアポB100リポタンパク質の寄与を実証する代表的なウエスタンブロット分析。リンパ節が3から収集ブタは、1.006グラム/ mlの密度勾配超遠心分離プロトコールを用いて分離されます。図は、アポB100血漿由来の約15％の混入の少量を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

	リンパ特性
ApoB48（mg / mlで）	3022.4±440.4
トリグリセリド（ミリグラム/ dL未満）	607±203.6
コレステロール（ミリグラム/ dL未満）	58.5±9.6
結果は平均±SDとして表される（n = 3）で

手術後7日目の新生児ブタから採取した腸リンパの 表1. コンポーネント。結果は、MEAを繰り返していますリンパのsuresとして発現さ（n = 3）は平均±SD

Discussion

腸リンパを収集する様々な実験動物モデルにおいて、脂質^8-12に関与する機構と薬物^13-15代謝、癌転移^16,17、細胞輸送及び免疫機能^18-26を調査するための優れた方法です。実際に、長期間にわたって、末梢（求心性）と中央（遠心性と大きなトランク船）リンパを大量に収穫する能力は、免疫調節剤を^18-22と課題以下の細胞集団で発生する時間的な変化を理解するために特に重要でした^、25,26。同様に、中央のリンパのコレクションは、リポタンパク質代謝^8-12に関連するプロセスの輪郭を描くのに役立つてきました。リンパコレクションのユーティリティは、カテーテル処置の成功とリンパ血管内カテーテルの開通性に依存しています。

に関与する主要なリンパ管のカテーテル法大型動物における腸管リンパドレナージは、一般に、3つの外科的アプローチのいずれかを使用しています。第一の技術は、一般的な頸静脈（牛胸管^）5を覆う胸管を入力するために頭蓋肩のアプローチを使用しています。第二は、右腎^32,33の中間外側面の上に、上部脇腹のアプローチを使用しています。このビデオで説明したように第3の技術は、膵臓の近くに腸リンパ本幹を露出するように腹側正中線またはparamedian ^22,35開腹術のいずれかを採用し、門脈^22,36,37の右腹側面に並置されました。上部脇腹や腹側正中外科的技術の両方が、腸リンパ本幹のカテーテル挿入を可能にするが、我々は腹側正中アプローチが血管を処理し、操作する上腹部内に十分なスペースを持つ容器のよりよい露出を可能にすると信じています。

重要なことは、任意の実験的手術のようパルティある手順がありますcularly実験手順の成功した結果のために重要。腸リンパ管にアクセスするには、腹側正中アプローチを使用して細心の注意を必要とする4つの主要分野があります。腸への長期の妥協循環が虚血性腸粘膜壊死、手術の失敗を誘発するように、まず、体外腸に優れた血液供給は、必要とされます。この手順では「タオルスリングは、「優れた組織灌流を確保腸の重量を支えることにより、腸間膜血管の張力を低減します。第二に、などの容器を慎重に操作：周囲の筋膜および脂肪組織からの血管のリリースでは、挿入してしっかりと長期のリンパ収集のために血管内にカテーテルを固定することは成功したカテーテル挿入のために重要です。確かに、それは新生児のブタにおける血管の構造的完全性は、成熟した動物のように、そのようなほど堅牢ではないことが示唆された簡単^39,40を引き裂くことができます41における非腸管リンパの長期リンパコレクションと、カテーテルから血餅を除去することは極めて困難です。したがって、これは非常に成功し、長期の実験（未発表データ）のためにカテーテルを挿入した動物の数を（約40％）減少させます。リンパの流れが遅くなるか、手順の間に中止した場合従って、リンパ管カテーテルは、頭側の初期カテーテルサイト0.5〜1センチメートルを再挿入する必要があります。

科学的問題を調査するために使用されるすべてのモデルはinherant制限がありますし、腸リンパ本幹のカテーテル法も例外ではありません。手続きのための最も顕著な制限が効果的に、隔離リンパ管をカテーテルを挿入し、血管内にカテーテルを安定化することができないことです。このように、この手順は、優れた技術や外科的なスキルを持つ人々を必要とします秒。もう一つの重要な制限は、腹部の大手術中に長時間の外科手術時間はリスクと手術後の罹患率と死亡率を増加させることです。注目すべきは、しかし、我々の実験のブタは手術から急速に回復し、そのような感染、腸イレウス、過度の組織損傷、またはプロシージャを次の食欲不振などの合併症はなかったです。最も確かに、豚はambulating、通常は24時間後に手術を食べて、明るい応答することが観察され、これは、7日のリンパ収集期間にわたって継続しました。血清化学的性質または完全な血球数は、7日の実験後のこれらのブタで評価されていなかったが、注目すべきは、羊⁴¹の長期的なリンパコレクション内の研究者による以前の研究は、カテーテルを挿入羊は、電解質の不均衡やと、リンパ球減少、白血球減少症hypoproteinemicことはありませんでしたことを実証しました臨床的に貧しい人々の健康（未発表データ）を描きました。上述のように重要なことと、この観察はcatheteriする相関しますZED豚はまた、良好な健康状態の臨床的特徴を表示します。

興味深いことに、研究者らは、リンパ流の体積の変化を指摘しました。流れは豚が供給し、この時に発生する毎日収集したリンパの約70％を有する活性された日中最大でした。リンパの流れの残りの30％は休息と睡眠中の夕方に発生します。

リンパサンプルのさらなる特徴付けは、 図1、図2及び表1に示す。 図1は、血漿の約15％の汚染の少量を示すアポB100由来。腸リンパ内のプラズマリポタンパク質の存在は、多くの場合、豚⁴²で発生する観察です。哺乳豚では、リポタンパク質の大部分は肝臓で産生され、血漿中に放出しました。プラズマから、アポB100は、おそらくリンパ血管網を介して、その後lacteals ⁴²とを集めるに浸透します腸リンパ本幹に排出されます。クロマトグラフィーの様々な方法を収集リンパサンプル^42-45中のコレステロール、トリグリセリドおよび他のリン脂質のコンテンツを評価するために使用されます。 図2の単一のピークは明らかにコレステロールとトリグリセリドは、カイロミクロン画分に存在している示しています。この方法は、プロファイリングリンパリポタンパク質の簡便かつ正確な技術であり、腸のリンパ⁴⁵からカイロミクロンサンプルの純度を評価する際に考慮すべきです。最後に、表1は、新生児のブタ7日、手術後から収集し、腸リンパの生化学的なコンポーネントを提供します。

結論として、腸リンパトランクの長期カテーテル法は、若いブタで成功しています。この技術では、リンパ管カテーテルは、脂質代謝の成分を収集して調べるために使用することができます。リンパ液の純度、製造リンパ液の量と脂質代謝の成分の量他の実験^9,25,26,42で豚中央リンパ液中に存在する量と類似しています。結果は慎重な組織切開し、血管が若いブタにおいて腸リンパ本幹にカテーテルを挿入するために処理すると腹側正中外科的アプローチを採用すると、中央のリンパを大量に収集するための優れた方法であることを示しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Miller laryngoscope blade	Welch Allyn	68044	182 mm length
Surgivet advisor: Vital signs monitor	Surgivet	V9203
Rectal temperature probe	Surgivet	V3417
Mono-polar electrosurgery generator	Valley Lab
Metzenbaum scissors	Fine Science	14518-18
Tuffier retractor	Stevens	162-11-676
Mosquito forceps	Stevens	162-7-10
Kelly forceps-curved (14cm)	Stevens	162-7-38
Allis tissue forceps	Stevens	162-7-38
Forceps dressing-eye (10.2cm)	Stevens	162-18-780
Forceps dressing-Adison (12.1cm)	Stevens	162-17-2510
Needle Drivers	Stevens	162-V98-42
Iris scissors	Fine science	14058-11
Circulating water pump	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip applicators	Fisher Scientific	22-037-960
Catheterization  tubing (4.06 OD X 2.31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Micro-Renethane implantation tubing
2-0 silk suture	Ethicon	LA556
2-0 polyglactin suture	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Large animal jacket	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Polypropylene wash bottles	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Amphotericin B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Animal Health		Stresnil
Dexmedetomidine hydrochloride	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurane	Abbott Animal  Health	05260-5	IsoFlo
Ketamine hydrochloride	Zoetis	2626	Ketaset
Bupenorphine hydrochloride	Champion Alstoe Animal Health		DIN:02347510
6 mm Endotracheal tube	Jorvet	J-165d
10% Lidocaine spray	AstraZeneca		DIN:02003767
4 % Chlorhexidine surgical scrub	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluted: 2.0% solution
3M Surgical steri- drape	3M Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8 % tris acetate
Polyvinylidene fluoride membrane	Millipore	IPVH00010	0.45 μm pore size
ApoB antibody	EMD Millipore	AB742	1:4000 dilution
Donkey anti-goat IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting Reagent	GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Triglyceride Kit	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Total Cholesterol Kit	Wako Pure Chemicals	439-17501
Total Protein	Pierce	23225	Bicinchoninic Acid Assay