Introduction
الجهاز الليمفاوي هو مجال الكافي في علم وظائف الأعضاء. تحدث النماذج قبل السريرية قسطرة اللمفاوية في الأنواع الحيوانية المختلفة 1-8 وتستخدم من قبل الصناعات الدوائية والمؤسسات البحثية للتحقيق في الآليات التي تشارك في الدهون 8-12 و13-15 استقلاب الدواء، وسرطان خبيث 16 مع العلاج التجريبي 17، والوظيفة المناعية 18 -26. وتستكشف هذه الدراسة استخدام المعوية قسطرة جذع الليمفاوية في نموذج خنزير المحلي لقياس مكونات استقلاب البروتين الدهني. ويشارك البروتين الدهني الأيض في إنتاج وإفراز كيلومكرونات، فضلا عن التغيرات في الدهون المرتبطة والبروتين الكلي. هذه هي الاعتبارات الهامة كما أن هناك اختلافات كبيرة في التمثيل الغذائي للدهون بين نماذج القوارض التي يشيع استخدامها والبشر وعلى هذا النحو، وتوظيف نماذج الخنازير لجمع الليمفاوية المعوية يمكن أن توفر معلومات أكثر قابلية للمقارنة لدراسة الدهون ليtabolism في الناس 27-31.
وتستخدم العديد من التقنيات الجراحية لجمع الليمفاوية المعوية في الأنواع الحيوانية الكبيرة: نهج الكتف الجمجمة (أي الصدرية قناة قسطرة) 5، ونهج الجانبي الجناح العلوي 32-34، وخط الوسط بطني أو نهج ناصف 22،35. هذا الفيديو يصف بالتفصيل العملية الجراحية في الخنازير باستخدام نهج الجراحية خط الوسط بطني لقسطرة من الجذع الليمفاوية المعوية. دقيق تصاريح تقنية جراحية هذا الأسلوب من القسطرة اللمفاوية لجمع كميات كبيرة من الليمفاوية ومكوناته على مدى فترات طويلة من الوقت.
هذه التقنية تفتح عدد لا يحصى من التطبيقات في العديد من التخصصات دراسة مختلف الوظائف الفسيولوجية. ويمكن أن تشمل التطبيقات، ولكن لا تقتصر على، البروتين الدهني الجسم كله والتمثيل الغذائي للدهون، الترصد المناعي، نشأة الورم والانبثاث، وظيفة الأمعاء، وdevelopmوالأنف والحنجرة وتطور مرض التهاب الأمعاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات على حيوانات التجارب وصفها في كل من الفيديو والمخطوطة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها مجلس الكندي للرعاية الحيوان.
1. التخدير الجراحي والتحضير الجراحي للالخنازير حديثي الولادة
- في غرفة جلوس منفصلة، يمهد للتخدير 25 الخنازير كغ بالقرب من قاعدة العنق مع كوكتيل مهدئ مخدر المخدرات العضلي تحتوي azaperone (0.3 ملغ / كلغ)، هيدروكلوريد الكيتامين (10 ملغ / كلغ)، ديكسميديتوميدين (15 ميكروغرام / كغ).
ملاحظة: إضافة البوبرينورفين (0،005-0،02 ملغ / كلغ) في كوكتيل المخدرات قبل مخدر لتعزيز السيطرة على الألم داخل المنطوق. - تخدير الخنازير مع استنشاق الغاز استنشاق الأيزوفلورين (4-5٪ الأيزوفلورين في 500 مل 1000 مل / دقيقة O 2) باستخدام قناع الوجه. تصور الحبال الصوتية باستخدام نطاق الحنجرة البيطري (شفرة 17-25 سم طويلة على التوالي)، وتطبيق موضعي 10٪ ليدوكائين التعقيم لصخباالحبال. السماح للرذاذ يدوكائين للاتصال الحبال الصوتية قبل 30-60 ثانية لالتنبيب للحد من إمكانية تشنج الحبال الصوتية وانسداد مجرى الهواء.
- أنبوبا الخنازير عن طريق تمرير أنبوب القصبة الهوائية مكبلة (5،0-7،0 مم القطر الداخلي (ID)) بين الحبال الصوتية والحفاظ على التخدير بغاز الأيزوفلورين (0،5-2،0٪ الأيزوفلورين في 1،000-2،000 مل / دقيقة O 2) باستخدام مغلقة الدائرة إعادة التنفس نظام مخدر طوال الجراحة. تقييم مستوى التخدير من لهجة الفك، وكلا دواسة وجفني ردود الفعل المنعكس. وبكسح الغاز المخدر منتهية الصلاحية وتنفيس خارج جناح الجراحة.
- تنظيف السطح الخارجي من الأذن مع 2.0٪ بالكلورهيكسيدين حل فرك الجراحية تليها 70٪ الآيزوبروبيل الكحول شطف. مع القسطرة الوريدية 20 G، يقثطر الوريد الأذن لتوفير السوائل عن طريق الوريد (الحل أفرز اللبن قارع الأجراس؛ و5-10 مل / كغ / ساعة) خلال عملية جراحية. تأمين نبض مقياس التأكسج إلى سطح الغشاء المخاطي للسان مع ميدالشريط كال لمراقبة معدل ضربات القلب وتشبع الأوكسجين في الدم المحيطي (مكتب التخطيط الاستراتيجي 2).
- وضع خنزير تخدير في وضعية الاستلقاء الظهري وحلق البطن بطني من منتصف الصدر caudally إلى الجانب البطني من العانة. تنظيف هذا المجال مع اثنين بالتناوب 2.0٪ بالكلورهيكسيدين الدعك الجراحية ويغسل ماء معقم.
- نقل الخنازير مخدرة إلى جناح الجراحة وتطبيق فرك الجراحية النهائي من 70٪ ايزوبروبيل شطف، اتركه حتى يجف، ثم ثنى الحيوان.
- إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم حوالي 2-4 سم في المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم. ضع الخنازير على وسادة التدفئة إعادة تدوير المياه للحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية (38-40 درجة مئوية) أثناء إجراء العمليات الجراحية.
- ثنى الخنزير مع أربعة المناشف الستائر وضعت في نمط الربع المغطي حول البطن. وضع الستارة الأولى عبر xiphisternum، وثنى الثانية على طول الجانب الوحشي من البطن ما يقرب من 5 جم الأفقي إلى خط الوسط في البطن. وضع الستارة الثالثة عبر قمة اللفائفية من الحوض وثنى الرابعة، مثل ثنى الثانية (وإن كان ذلك على الجانب المعاكس)، يتم وضعها على طول الجانب الوحشي من البطن حوالي 5 سم الوحشي على خط الوسط في البطن.
- وضع الستارة طاولة كبيرة، مع فتحة افتتاح السماح بالوصول إلى موقع الجراحية، على الستائر منشفة الكامنة وتغطية الخنازير وطاولة الجراحة بأكمله. وثنى النهائية هو المتاح ستيري-ثنى وضعت على الطاولة ثنى كبيرة.
2. جراحة البطن وقسطرة للالمعوية اللمفاوي جذع
- جعل 20 سم شق الجلد بشفرة مشرط لفضح عضلات البطن الأساسية. شق طبقات عضلات البطن مع كهربي أحادية القطبية (20 إعداد واتس) لفضح الصفاق الجداري. فتح شريحة خطي 20 سم من الصفاق الجداري مع مقص Metzenbaum للوصول إلى أحشاء البطن والأوعية اللمفاوية.
- بلل كل الأنسجة مع الحارة (37 درجة مئوية) ملحي معقم لإجراء العمليات الجراحية بأكمله. رفع بلطف شريحة كبيرة من الأمعاء بما في ذلك القولون والأعور، الدقاق والصائم من تجويف البطن والداخل للظاهر على الجهة اليسرى من الخنزير للوصول إلى الجزء العلوي من البطن والكبد والأوعية اللمفاوية. تأمين الأمعاء exteriorized في موقف مع الستائر منشفة إضافية لتشكيل حبال لدعم بلطف الأمعاء.
- تحديد موقع السفينة اللمفاوية، فإنه يضع حوالي 4 سم الجمجمة-وسطي من الوريد الكلوي الأيمن، 6 سم بطني الذيلية-medial- من الملاحظين الأجوف وتحت الجانب الحشوي الصحيح الفص الكبد بالقرب من البنكرياس 22،36،37. التعرف على سفينة اللمفاوية كهيكل شفافة جنبا إلى جنب إلى الجزء البطني الأيمن من الوريد البابي 36،37.
- فصل VESS اللمفاويةايل من اللفافة المحيطة إغاظة بلطف بعيدا الأنسجة المرفقة مع تطبيقها Q-طرف. مرة واحدة يتم فصل النواحي الجانبية لسفينة من الأنسجة المحيطة بها، وإنشاء "النفق" فتح تحت السفينة مع صريحا غرامة يميل ملقط.
- تمرير ثلاثة 2-0 خيوط الحرير تحت السفينة اللمفاوية مع ملقط غرامة. Ligate خياطة الأكثر الذيلية أول من حبس، وتمدد وملء وعاء مع الليمفاوية. ترك عمدا الغايات المنشودة في هذا الخيط طويلة نسبيا (4 سم) لتأمين القسطرة إلى الأوعية اللمفاوية. وضع اثنين من خيوط أخرى فصلت 1.0 سم من بعضها البعض، وما يقرب من 1،0-1،5 سم في الجمجمة لخياطة الذيلية المضمونة. ترك هذه الغرز اثنين مع "واحد التعادل رباط فضفاضة" للسماح لتأمين أسرع من القسطرة في الإناء.
ملاحظة: جزء من السفينة اللمفاوية تقع بين خياطة ligating الأكثر الذيلية وخياطة المتوسطة (اثنين من الغرز في الجمجمة) هو موقع لالقسطرة. وفيما يتعلق سوالمواد تلح، يمكن 2-0 polyglactin خياطة بديلا عن 2-0 خيوط الحرير إذا لزم الأمر. - قطع ثقب صغير في الإناء مع مقص القزحية وتمدد الأوعية بالملقط حادة الجميلة. إدراج حوالي 1.0-1.5 سم من أنابيب القسطرة المتخصصة (4.06 القطر الخارجي (OD) X 2.31 ملم ID) مع نهاية مشطوف في الإناء وربطة عنق اثنين من الغرز في الجمجمة لتأمين القسطرة في مكانها. استخدام نهايات خياطة طويلة من الخيط الذيلية لتأمين القسطرة في وعاء.
- غسل الأمعاء exteriorized مع كميات وفيرة من المياه المالحة الدافئة والعودة برفق إلى تجويف البطن ضمان تحديد المواقع التشريحية الصحيح للامعاء.
- من الداخل للظاهر القسطرة في منتصف الجهة اليسرى (5-10 سم من الناحية البطنية من الحفرة paralumbar). جعل شق الجلد مع مشرط وتمرير مبزل من تجويف البطن إلى سطح الجلد لخلق فرصة للظاهرية القسطرة. استخدام ملقط كيلي كبيرة إلى الداخل للظاهر القسطرة من الخيالة البطنإيتي من خلال فتح مبزل.
- إغلاق الصفاق الجداري مع نمط خياطة المستمر بسيط من 2-0 polyglactin خياطة مع الجولة (مدبب) إبرة. إغلاق طبقات العضلات في البطن مع وجود نمط خياطة توقف بسيط مع خياطة 2-0 polyglactin على إبرة الجولة.
- إغلاق الجلد في نمط تحت البشرة مع 2-0 polyglactin خياطة على إبرة القطع. تأمين القسطرة exteriorized على الجلد مع وجود نمط خياطة صارة وخياطة 2-0 النايلون على إبرة القطع.
- وضع سترة المتخصصة على الخنازير في حين لا يزال تخدير لتخفيف موقعها ويقلل من الإجهاد الخنزير أثناء الانتعاش.
استعادة 3. مرحلة ما بعد العمليات الجراحية والليمفاوية مجموعة
- ما يقرب من 10 دقيقة قبل وقف التخدير استنشاق، إدارة bupenorphine (0.1 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي لتوفير فوري التسكين بعد الجراحة. تواصل bupenorphine (0.1 ملغم / كغم) كل 12 ساعة لمدة 24-48 ساعة للحفاظ علىما بعد الجراحة للوعي.
- رصد الخنازير لمضاعفات بعد الجراحة كل 8-12 ساعة لمدة 7 أيام.
- جمع الليمفاوية في 500 مل الزجاجات غسل البولي بروبلين، المغلفة مع الإيثيلين حمض tetraacetic (EDTA)، وتستكمل مع المضادات الحيوية. البنسلين (6000 وحدة دولية)، الستربتومايسين (6 ملغ) والأمفوتريسين B (3 ملغ) كل 12 ساعة لمدة 7 أيام.
4. الكمي من البروتين الدهني ApoB48، الدهون الثلاثية، الكولسترول والبروتين الكلي التي تم جمعها من الليمفاوية
- أجهزة الطرد المركزي لعينة الليمفاوية في 1800 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. جمع طاف واستخدامها لتقدير حجم الدهون الثلاثية والكولسترول والبروتين الكلي.
- تقسيم طاف في ثلاث عينات: عينة مخفف، عينة مخففة 1:20 الماء المقطر والعينة النهائية المخفف 1: 100 مع الماء المقطر.
- استخدام طاف مخفف لقياس مستويات الكوليسترول في الدم، مع مجموعة المتاحة تجاريا.
- استخدام 1:20 و01:100 عينات المخفف لقياس الدهون الثلاثية ومجموع مستويات البروتين مع مجموعة المتاحة تجاريا وحمض إجمالي bicinchoninic البروتين فحص على التوالي.
5. الكمي من البروتين الدهني ApoB48، التي تم جمعها من الليمفاوية 38
- تحديد تركيز البروتين الدهني ApoB48 مع المناعي طريقة الغرب النشاف تكييفها 38. الليمفاوية إجمالي منفصل مع 3-8٪-تريس acetate- الصوديوم دوديسيل هلام كبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE).
- نقل البروتينات فصلها لغشاء فلوريد البولي (0.45 ميكرون)، واحتضان لهم الأجسام المضادة الماعز بولكلونل إلى ApoB (1: 4000)، ثم ربط ذلك مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماعز.
- قياس البروتين الدهني ApoB48 مع لمعان كيميائي باستخدام مقارنة الكثافات الخطية مع القوارض تنقية مستوى البروتين ApoB48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قسطرة اللمفاوية من الجذع اللمفاوي المعوي من الخنازير حديثي الولادة تسمح جمع ما يقرب من 1 لتر / 24 ساعة من الليمفاوية المركزي على مدى 7 أيام. الليمفاوية التي تم جمعها في هذه التجارب يتضمن عناصر التمثيل الغذائي للدهون، وهو البروتين الكلي الليمفاوية، ApoB48 البروتين الدهني، الدهون الثلاثية، البروتين الكلي، والكولسترول. ويبين الجدول 1 مبالغ تمثيلية هذه المكونات الدهنية من عينات الليمفاوية المجمعة من ثلاثة خنازير. والجدير بالذكر أن تدفق الليمفاوية ومكونات الدهون وتماشيا مع قيم الليمفاوية المركزي أفاد باحثون آخرون التالية قسطرة الأوعية الليمفاوية المعوية (الليمفاوية تدفق 570 ± 158-979 ± 284 مل / 24 ساعة 25 ± 120 360 MLL / 24 ساعة ل 1080 ± 720 مل / 24 ساعة 26؛ الدهون الثلاثية 687 ± 110 ملغ / ديسيلتر 9؛ الكولسترول 63.1 ± 5.6 ملغ / ديسيلتر 9)؛ مشيرا إلى التنسيب المناسب من القسطرة داخل السفينة اللمفاوية.
ontent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الشكل 2. السائل الشخصي البروتين سريع اللوني (FPLC) مما يدل على نقاء إعداد الكيلومكرونات في الخنازير حديثي الولادة الليمفاوية المعوية. الليمفاوية التي تم جمعها من يتم فصل باستخدام 1.006 غرام / مل بروتوكول كثافة التدرج تنبيذ فائق ثلاثة خنازير. الملف الشخصى يظهر ذروة واحدة ل(A) الكولسترول و (ب) الدهون الثلاثية في العينة الليمفاوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 1. ممثل تحليل لطخة غربية مما يدل على مساهمة ApoB48 وApoB100 البروتينات الدهنية في الخنازير حديثي الولادة الليمفاوية المعوية. الليمفاوية التي تم جمعها من ثلاثةيتم فصل الخنازير باستخدام 1.006 غرام / مل بروتوكول كثافة التدرج تنبيذ فائق. يوضح الشكل كمية صغيرة من التلوث مع ما يقرب من 15٪ من البلازما المستمدة ApoB100. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خصائص الليمفاوية | |
| ApoB48 (ملغ / مل) | 3022.4 ± 440.4 |
| الدهون الثلاثية (ملغم / دل) | 607 ± 203.6 |
| الكوليسترول (ملغ / دل) | 58.5 ± 9.6 |
| يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SD (ن = 3) | |
الجدول 1. مكونات الليمفاوية المعوية التي تم جمعها من الخنازير حديثي الولادة 7 أيام تتكرر بعد الجراحة. نتائج شركة طيران الشرق الأوسطسورس الليمفاوية ويعبر عنه يعني SD (ن = 3)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جمع الليمفاوية المعوية هو وسيلة ممتازة لتحقيق الآليات التي تشارك في الدهون 8-12 و13-15 المخدرات الأيض والسرطان ورم خبيث 16،17، والاتجار الخلية وظيفة المناعة 18-26، في مختلف النماذج الحيوانية التجريبية. والواقع أن القدرة على جني كميات كبيرة من إما المحيطي (وارد) ووسط (صادر والأوعية جذع كبيرة) الليمفاوية على مدى فترة طويلة أهمية خاصة لفهم التغيرات الزمنية التي تحدث في السكان الخلية التالية التحديات مع وكلاء تحوير المناعة 18-22 ، 25،26. وبالمثل، كانت مجموعة من الليمفاوية المركزي مفيدة في العمليات التي تدخل في البروتين الدهني الأيض 8-12 ترسيم. الأداة المساعدة لجمع الليمفاوية تعتمد على نجاح عملية قسطرة والمباح من القسطرة داخل السفينة اللمفاوية.
قسطرة الأوعية اللمفاوية الرئيسية المشاركة فيالتصريف اللمفاوي المعوي في الحيوانات الكبيرة يستخدم عموما واحدا من ثلاثة نهج الجراحية. تستخدم هذه التقنية الأولى نهجا الكتف الجمجمة لدخول القناة الصدرية التي تغمر حبل الوريد المشترك (البقرة القناة الصدرية) 5. تستخدم الثانية نهج الجناح العلوي على الجانب منتصف الجانبية من الكلية اليمنى 32،33. الأسلوب الثالث كما هو موضح في هذا الفيديو يعمل إما خط الوسط بطني أو ناصف 22،35 البطن لفضح جذع اللمفاوي الأمعاء بالقرب من البنكرياس وجنبا إلى جنب على الجانب البطني الأيمن من الوريد البابي 22،36،37. على الرغم من أن كلا العليا الجناح وخط الوسط بطني التقنيات الجراحية تتيح القسطرة من الجذع اللمفاوي المعوي، فإننا نعتقد أن النهج خط الوسط بطني يسمح للتعرض أفضل من السفينة مع مساحة كافية في الجزء العلوي من البطن في التعامل معها والتعامل مع السفينة.
الأهم من ذلك، كما هو الحال في أي عملية جراحية التجريبية هناك خطوات التي هي حزبcularly حاسمة لنجاح هذا الإجراء التجريبي. هناك أربعة مجالات رئيسية تتطلب عناية فائقة باستخدام نهج خط الوسط البطني للوصول إلى سفينة اللمفاوية المعوية. أولا، لا بد ممتاز إمدادات الدم إلى الأمعاء exteriorized، كما لفترات طويلة تداول المكسور إلى الأمعاء يدفع نقص تروية الأمعاء نخر الغشاء المخاطي وفشل العمليات الجراحية. في هذا الإجراء على "حبال منشفة" يقلل من التوتر على الأوعية الدموية المساريقي من خلال دعم وزن الأمعاء ضمان نضح الأنسجة ممتازة. ثانيا، التلاعب دقيقة من السفينة بما في ذلك: الإفراج عن السفينة من المحيط اللفافة والأنسجة الدهنية، وإدراج وتأمين بحزم القسطرة داخل السفينة لجمع الليمفاوية طويل الأجل هو أمر حاسم لقسطرة ناجحة. في الواقع، يقترح أن السلامة الهيكلية للسفن في الخنازير حديثي الولادة ليست قوية كما في الحيوانات الناضجة وعلى هذا النحو يمكن أن تمزق بسهولة 39،40 41، فإنه من الصعب جدا لإزالة جلطة من القسطرة مع تطور جلطة داخل القسطرة وهو داخل سفينة اللمفاوية عميقة الجذور. ونتيجة لذلك، وهذا سوف يقلل إلى حد كبير (حوالي 40٪) من أعداد الحيوانات مقسطر بنجاح لإجراء التجارب على المدى الطويل (بيانات غير منشورة). لذلك، إذا تباطأ تدفق الليمفاوية أو وقفها خلال هذا الإجراء، يجب إعادة إدخال القسطرة اللمفاوية cranially 0.5-1 سم من موقع قسطرة الأولي.
جميع النماذج المستخدمة لتحقيق المسائل العلمية لها قيود inherant والقسطرة من الجذع اللمفاوي الأمعاء ليست استثناء. التحديد الأكثر وضوحا لهذا الإجراء هو عدم القدرة على عزل فعال، يقثطر السفينة اللمفاوية، وتحقيق الاستقرار القسطرة داخل السفينة. على هذا النحو، وهذا الإجراء يتطلب ذوي المهارات التقنية والجراحية ممتازةالصورة. الحد مهم آخر هو أن الأوقات الجراحية لفترات طويلة أثناء عملية جراحية في البطن الكبرى يزيد من المخاطر ومعدلات الاعتلال والوفيات بعد الجراحة. والجدير بالذكر، ومع ذلك، استعادت الخنازير في تجربتنا بسرعة من الجراحة، وكانت هناك أي مضاعفات مثل الالتهابات، والعلوص المعوي، إصابات الأنسجة الزائدة، أو فقدان الشهية باتباع الإجراء. بالتأكيد، لوحظت الخنازير ليكون مشرقا، استجابة والتجول وتناول الطعام عادة 24 ساعة بعد الجراحة، واستمر هذا خلال فترة جمع الليمفاوية 7 أيام. والجدير بالذكر، على الرغم من كيمياء المصل أو دم كاملة لم يتم تقييم في هذه الخنازير بعد تجربة 7 أيام، أظهرت الأعمال السابقة من قبل المحققين في جمع الليمفاوية على المدى الطويل في الأغنام 41 أن الأغنام مقسطر لم تكن أبدا قلة الكريات البيض، lymphopenic، hypoproteinemic مع الاختلالات المنحل بالكهرباء أو تصوير سريريا صحية سيئة (بيانات غير منشورة). الأهم وكما ذكر أعلاه، هذه الملاحظة يرتبط إلى catheteriيعرض الخنازير زيد أيضا الخصائص السريرية للصحة الجيدة.
ومن المثير للاهتمام، لاحظ الباحثون تغيرات في حجم تدفق الليمفاوية. وكان تدفق أكبر خلال النهار عندما كانت الخنازير تتغذى ونشطة مع ما يقرب من 70٪ من الليمفاوية التي تم جمعها اليومية التي تحدث في هذا الوقت. 30٪ المتبقية من تدفق الليمفاوية يحدث في المساء أثناء الراحة والنوم.
يتم توفير مزيد من توصيف عينات الليمفاوية في أرقام 1 و 2 و الجدول 1. الشكل 1 يوضح كمية صغيرة من التلوث مع ما يقرب من 15٪ من البلازما المستمدة ApoB100. وجود البروتين الدهني البلازما داخل الليمفاوية المعوية هو الملاحظة التي غالبا ما يحدث في الخنازير 42. في الخنازير الرضيعة، ويتم إنتاج معظم البروتين الدهني في الكبد وأفرج عنه في البلازما. من البلازما، ApoB100 الأرجح يتسرب إلى جمع المرابض 42 ومن ثم عن طريق شبكة الأوعية الدموية اللمفاويةيصب في جذع اللمفاوي المعوي. وتستخدم أساليب مختلفة لاللوني لتقييم الكولسترول والدهون الثلاثية ومحتويات فوسفورية أخرى في العينات التي تم جمعها الليمفاوية 42-45. في ذروة واحدة في الشكل 2 يوضح بشكل واضح الكولسترول والدهون الثلاثية موجودة في جزء الكيلومكرونات. هذا الأسلوب هو أسلوب مريحة ودقيقة من التنميط البروتينات الدهنية الليمفاوية ويجب أخذها في الاعتبار عند تقييم نقاء العينات الكيلومكرونات من الليمفاوية المعوية 45. وأخيرا، يقدم الجدول 1 المكونات البيوكيميائية الليمفاوية المعوية التي تم جمعها من الخنازير حديثي الولادة 7 أيام بعد الجراحة.
في الختام، القسطرة على المدى الطويل من الجذع الليمفاوية المعوية ناجحة في الخنازير الشباب. مع هذه التقنية، قسطرة اللمفاوية يمكن استخدامها لجمع وتحقيق عناصر التمثيل الغذائي للدهون. نقاء الليمفاوية، وكمية من اللمفاوية المنتجة وكميات من مقومات التمثيل الغذائي للدهونتشبه كميات الموجودة في الخنزير الليمفاوية المركزي في تجارب أخرى 9،25،26،42. وتشير النتائج إلى أن توظيف نهج خط الوسط البطني الجراحي مع تشريح الأنسجة دقيق وسفينة مناولة ليقثطر جذع اللمفاوي المعوي في الخنازير الشباب هو وسيلة ممتازة لجمع كميات كبيرة من الليمفاوية المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miller laryngoscope blade | Welch Allyn | 68044 | 182 mm length |
| Surgivet advisor: Vital signs monitor | Surgivet | V9203 | |
| Rectal temperature probe | Surgivet | V3417 | |
| Mono-polar electrosurgery generator | Valley Lab | ||
| Metzenbaum scissors | Fine Science | 14518-18 | |
| Tuffier retractor | Stevens | 162-11-676 | |
| Mosquito forceps | Stevens | 162-7-10 | |
| Kelly forceps-curved (14cm) | Stevens | 162-7-38 | |
| Allis tissue forceps | Stevens | 162-7-38 | |
| Forceps dressing-eye (10.2cm) | Stevens | 162-18-780 | |
| Forceps dressing-Adison (12.1cm) | Stevens | 162-17-2510 | |
| Needle Drivers | Stevens | 162-V98-42 | |
| Iris scissors | Fine science | 14058-11 | |
| Circulating water pump | Jorvet | J-783X | |
| Maxitherm-Vinyl blanket | Jorvet | J-784C | |
| Q tip applicators | Fisher Scientific | 22-037-960 | |
| Catheterization tubing (4.06 OD X 2.31 ID) | Braintree Scientific Inc. | MRE-160 | Micro-Renethane implantation tubing |
| 2-0 silk suture | Ethicon | LA556 | |
| 2-0 polyglactin suture | Ethicon | J443H | 2-0 vicryl |
| Large animal jacket | Lomir Biomedical Inc. | SSJ2YC | |
| Polypropylene wash bottles | Fisher Scientific | 03-409-22C | 500 ml |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | D4333 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 60-00-4 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Azaperone | Elanco Animal Health | Stresnil | |
| Dexmedetomidine hydrochloride | Zoetis | 6295 | Dexdomitor |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | 05260-5 | IsoFlo |
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | 2626 | Ketaset |
| Bupenorphine hydrochloride | Champion Alstoe Animal Health | DIN:02347510 | |
| 6 mm Endotracheal tube | Jorvet | J-165d | |
| 10% Lidocaine spray | AstraZeneca | DIN:02003767 | |
| 4 % Chlorhexidine surgical scrub | Partnar Animal Health | PCH-011 | Diluted: 2.0% solution |
| 3M Surgical steri- drape | 3M Health Care | 1040 | |
| SDS page gel | Invitrogen | EA0375BOX | 3-8 % tris acetate |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Millipore | IPVH00010 | 0.45 μm pore size |
| ApoB antibody | EMD Millipore | AB742 | 1:4000 dilution |
| Donkey anti-goat IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2304 | |
| ECL Prime Western Blotting Reagent | GE Healthcare LifeSciences | RPN2232 | |
| Triglyceride Kit | Wako Pure Chemicals | 998-40391/994-40491 | |
| Total Cholesterol Kit | Wako Pure Chemicals | 439-17501 | |
| Total Protein | Pierce | 23225 | Bicinchoninic Acid Assay |
References
- Lindsay, F. E. F. The cisterna chyli as a source of lymph samples in the cat and dog. Res. Vet. Sci. 17, 256-258 (1974).
- Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr. Protoc. Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
- Wang, X. D., et al. Intestinal uptake and lymphatic absorption of beta-carotene in ferrets: a model for human beta-carotene metabolism. Am. J. Physiol. 263 (4 Pt 1), G480-G486 (1992).
- Hein, W. R., Barber, T., Cole, S. A., Morrison, L., Pernthaner, A. Long-term collection and characterization of afferent lymph from the ovine small intestine. J.Immunol. Methods. 293 (1-2), 153-168 (2004).
- Hartmann, P. E., Lascelles, A. K. The flow and lipid composition of thoracic duct lymph in the grazing cow. J. Physiol. 184 (1), 193-202 (1966).
- Redgrave, T. G., Dunne, K. B. Chylomicron formation and composition in unanaesthetised rabbits. Atherosclerosis. 22 (3), 389-400 (1975).
- Binns, R. M., Hall, J. G. The paucity of lymphocytes in the lymph of unanaesthetised pigs. Br. J. Exp. Pathol. 47 (3), 275-280 (1966).
- Ohlsson, L., Kohan, A. B., Tso, P., Ahren, B. GLP-1 released to the mesenteric lymph duct in mice: Effects of glucose and fat. Regul. Pept. 189, 40-45 (2014).
- Ho, H. T., Kim, D. N., Lee, K. T. Intestinal apolipoprotein B-48 synthesis and lymphatic cholesterol transport are lower in swine fed high fat, high cholesterol diet with soy protein than with casein. Atherosclerosis. 77 (1), 15-23 (1989).
- Arnold, M., Dai, Y., Tso, P., Langhans, W. Meal-contingent intestinal lymph sampling from awake, unrestrained rats. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol. 302 (12), R1365-R1371 (2012).
- Nguyen, T. M., Sawyer, J. K., Kelley, K. L., Davis, M. A., Kent, C. R., Rudel, L. L. ACAT2 and ABCG5/G8 are both required for efficient cholesterol absorption in mice: evidence from thoracic lymph duct cannulation. J. Lipid Res. 53 (8), 1598-1609 (2012).
- Sato, M., Kawata, Y., Erami, K., Ikeda, I., Imaizumi, K. LXR agonist increases the lymph HDL transport in rats by promoting reciprocally intestinal ABCA1 and apo A-I mRNA levels. Lipids. 43 (2), 125-131 (2008).
- Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49 (2), 115-120 (2004).
- Sugawara, T., et al. Intestinal absorption of dietary maize glucosylceramide in lymphatic duct cannulated rats. J. Lipid Res. 51 (7), 1761-1769 (2010).
- Shackleford, D. M., et al. Contribution of lymphatically transported testosterone undecanoate to the systemic exposure of testosterone after oral administration of two andriol formulations in conscious lymph duct-cannulated dogs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306 (3), 925-933 (2003).
- Lespine, A., et al. Contribution of lymphatic transport to the systemic exposure of orally administered moxidectin in conscious lymph duct-cannulated dogs. Eur. J. Pharm. Sci. 27 (1), 37-43 (2006).
- Carr, J., Carr, I., Dreher, B., Betts, K. Lymphatic metastasis: invasion of lymphatic vessels and efflux of tumour cells in the afferent popliteal lymph as seen in the Walker rat carcinoma. J. Pathol. 132 (4), 287-305 (1980).
- Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. I. Lymphocyte circulation in gut-associated lymphoid tissue. Immunology. 42 (3), 469-474 (1981).
- Knight, J. S., Baird, D. B., Hein, W. R., Pernthaner, A. The gastrointestinal nematode Trichostrongylus colubriformis down-regulates immune gene expression in migratory cells in afferent lymph. BMC Immunol. 11, 51 (2010).
- Milling, S. W., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nat. Protoc. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Pernthaner, A., Cole, S. A., Gatehouse, T., Hein, W. R. Phenotypic diversity of antigen-presenting cells in ovine-afferent intestinal lymph. Arch. Med. Res. 33 (4), 405-412 (2002).
- Thielke, K. H., Pabst, R., Rothkotter, H. J. Quantification of proliferating lymphocyte subsets appearing in the intestinal lymph and the blood. Clin. Exp. Immunol. 117 (2), 277-284 (1999).
- Mayrhofer, G., Fisher, R. IgA-containing plasma cells in the lamina propria of the gut: failure of a thoracic duct fistula to deplete the numbers in rat small intestine. Eur. J. Immunol. 9 (1), 85-91 (1979).
- Beh, K. J. The origin of IgA-containing cells in intestinal lymph of sheep. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 55 (3), 263-274 (1977).
- Bennell, M. A., Husband, A. J. Route of lymphocyte migration in pigs. II. Migration to the intestinal lamina propria of antigen-specific cells generated in response to intestinal immunization in the pig. Immunology. 42 (3), 475-479 (1981).
- Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin. Exp. Immunol. 92 (2), 317-322 (1993).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and thrombosis: insights from large animal models. J. Biomed. Biotechnol. 1, (2011).
- Getz, G. S., Reardon, C. A.
- Skold, B. H., Getty, R., Ramsey, F. K. Spontaneous atherosclerosis in the arterial system of aging swine. Am. J. Vet. Res. 27 (116), 257-273 (1966).
- Reiser, R., Sorrels, M. F., Williams, M. C. Influence of high levels of dietary fats and cholesterol on atherosclerosis and lipid distribution in swine. Circ. Res. 7, 833-846 (1959).
- Casani, L., Sanchez-Gomez, S., Vilahur, G., Badimon, L. Pravastatin reduces thrombogenicity by mechanisms beyond plasma cholesterol lowering. Thromb. Haemost. 94 (5), 1035-1041 (2005).
- Romosos, D. R., McGilliard, A. D. Preparation of thoracic and intestinal lymph duct shunts in calves. J. Dairy Sci. 53 (9), 1275-1278 (1970).
- Shannon, A. D., Lascelles, A. K. The intestinal and hepatic contributions to the flow and composition of thoracic duct lymph in young milk-fed calves. Q.J. Exp. Physiol. Cogn. Med. Sci. 5 (2), 194-205 (1968).
- Aliev, A. A. Intestinal lymph of ruminants. I. Operative techniques for collecting intestinal lymph from ruminants. Acta Vet.Hung. 38 (1-2), 105-120 (1990).
- Butterfield, A. B., Lumb, W. V., Litwak, P. Surgical preparation of miniature swine for atherosclerosis research. Am. J. Vet. Res. 37 (12), 1519-1523 (1976).
- Saar, L. I., Getty, R. Lymphatic system. Sisson and Grossman's: The anatomy of domestic animals. 2, W. B. Saunders Company. Philadelphia PA. 1343-1358 (1975).
- Zanchet, D. J., de Souza Montero, E. F. Pig liver sectorization and segmentation and virtual reality depiction. Acta. Cirurgica. Basilera. 17 (6), 382-387 (2002).
- Vine, D. F., Takechi, R., Russell, J. C., Proctor, S. D. Impaired postprandial apolipoprotein-B48 metabolism in the obese, insulin-resistant JCR:LA-cp rat: increased atherogenicity for the metabolic syndrome. Atherosclerosis. 190 (2), 282-290 (2007).
- Li, W. C., et al. Biomechanical properties of ascending aorta and pulmonary trunk in pigs and humans. Xenotransplantation. 15 (6), 384-389 (2008).
- Arkill, K. P., Moger, J., Winlove, C. P. The structure and mechanical properties of collecting lymphatic vessels: an investigation using multimodal nonlinear microscopy. J. Anat. 216 (5), 547-555 (2010).
- Uwiera, R. R. E., et al. Plasmid DNA induces increased lymphocyte trafficking: a specific role for CpG motifs. Cell. Immunol. 214 (2), 155-164 (2001).
- Black, D. D., Davidson, N. O. Intestinal apolipoprotein synthesis and secretion in the suckling pig. J. Lipid Res. 30 (2), 207-218 (1989).
- Heider, J. G., Pickens, C. E., Lawrence, K. A. Role of acyl CoA:cholesterol acyltransferase in cholesterol absorption and its inhibition by 57-118 in the rabbit. J. Lipid Res. 24, 1127-1134 (1983).
- Noh, S. K., Koo, S. I. Milk sphingomyelin is more effective than egg sphingomyelin in inhibiting intestinal absorption of cholesterol and fat in rats. J. Nutr. 134, 2611-2616 (2004).
- Brunham, L. R., et al. Intestinal ABCA1 directly contributes to HDL biogenesis in vivo. J. Clin. Invest. 116 (4), 1052-1062 (2006).
