Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.
מחקרים רבים מבקשים לזהות ולמפות את אזורי המוח מעורבי תקנות פיסיולוגיות ספציפיות. The-פוס ג פרוטו-אונקוגן, גן ראשונים מיידי, מתבטא נוירונים בתגובה לגירויים שונים. מוצר החלבון ניתן לאתר בקלות עם טכניקות immunohistochemical המובילות לשימוש של זיהוי c-FOS למפה קבוצות של נוירונים המציגים שינויים בפעילותם. במאמר זה התמקדנו בזיהוי אוכלוסיות גזע המוח עצבי מעורבת הסתגלות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia. שתי גישות תוארו לזהות אוכלוסיות נוירונים מעורבים vivo בחיות לשעבר vivo בהכנות גזע המוח deafferented. בשנת vivo, בעלי חיים שנחשפו תערובות גז hypercapnic או חוסר חמצן. גופיים, ההכנות deafferented היו superfused עם חוסר חמצן או מלאכותי הנוזל השדרתי hypercapnic. בשני המקרים, בין אם מלא בחי vivo או דוארx הכנות vivo נשמרו בתנאי normoxic ו normocapnic. ההשוואה של שתי גישות אלה מאפשר קביעת מקורם של קרי ההפעלה העצבית, היקפי ו / או מרכזי. בשנת vivo לשעבר vivo, brainstems נאספו, קבוע, ופרוסים למקטעים. לאחר סעיפים הוכנו, זיהוי immunohistochemical של חלבון C-FOS נעשה על מנת לזהות את קבוצות גזע המוח של תאים מופעלים על ידי גירויים היפוקסי או hypercapnic. תאים תווית נספרו במבנים הנשימה בגזע המוח. לשם השוואה למצב מלא, היפוקסיה או hypercapnia הגדיל את מספר תאי שכותרתו ג-FOS באתרי גזע מוח כמה הספציפיים מונחים ובכך מכוננים של המסלולים העצביים המעורבים בעיבוד של כונן הנשימה המרכזי.
הגן פוס c- זוהה לראשונה בתחילת 1980 1,2 ו מוצריה התאפיין בשנת 1984 כחלבון גרעיני בעלי תכונות-מפעיל גנים 3,4. והיא הועלתה מנגנוני לטווח ארוך הקשורים גירוי נוירון. ואכן, שינויים בפעילות עצבית להוביל מפלי שניית שליח איתות משרי הביטוי של C-FOS הגן מוקדם המיידי, אשר גורם ייצור של גורם שעתוק ג-FOS. האחרון יוזם את הביטוי של גנים מאוחר ובכך משתתף בתגובות הסתגלות של מערכת העצבים לסוגים רבים ושונים של 4 גירויים. לכן, מאז סוף 1980 5,6, זיהוי החלבון C-FOS נעשה בהם שימוש תכוף כדי לחקור את ההשפעות של הגורמים החיצוניים על שעתוק הגנים בכלל 4 ועל הפעילות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עבור מיפוי מסלולים עצביים מעורב פיזיולוגי שונהתנאי al.
C-FOS בסל הביטוי נחקר במינים שונים, כוללים עכברים, חולדות, חתולים, קופים, ואנושי 4. ובכך, קינטיקה הביטוי שלה ידוע טוב יחסית. הפעלת השעתוק היא מהירה (5 עד 20 דקות) 7,8, והצטברות mRNA מגיעה לשיא בין 30 ל -45 דקות לאחר תחילת גירוי 9 וירידה עם זמן מחצית חיים קצרים של 12 דקות. סינתזת חלבון C-FOS כדלקמן הצטברות mRNA ויכולה להיות מזוהית על ידי אימונוהיסטוכימיה ב 20 כדי 90 דקות פוסט גירוי 6.
ניתוח של ביטוי c-Fos משמש קלסי במחקרי in vivo לזהות את רשת הנשימה המרכזית המעורבת בתגובות נשימתית היפוקסיה או hypercapnia 10-14. לאחרונה, הכלי הזה שמש גם בהכנות גזע מוח vivo לשעבר לחקור עיבודי רשת נשימה מרכזיים היפוקסיה או hypercapnia 15-18. ואכן, הכנות אלה ליצור פעילות קצבית מתבוללים קלסיים לכונן הנשימה המרכזית 19. לכן, זה סוג של הכנה יש את היתרון של להיות deafferented לחלוטין, ולכן, תוצאות לגבי הביטוי פוס-ג רק לשקף את התוצאות של גירוי מרכזי ללא כל התערבות של מבנים היקפיים.
גילוי ג-FOS יכול להתבצע על ידי גישות immunohistochemical או immunohistofluorescence. עקיפת immunodetection מחייב שימוש נוגדן ראשוני נגד ג-FOS וכן נוגדנים משני המכוונים נגד המין שבו הנוגדן הראשוני הופק. לקבלת השיטה immunohistochemical, נוגדנים משני הוא מצומדות עם אנזים (peroxidase, למשל) שפועל על מצע (H 2 O 2 עבור peroxidase). המוצר של התגובה האנזימטית הוא פותח על ידי אַב צֶבַע (3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloridה), אשר מכתים אותו ניתן לראות תחת מיקרוסקופ אור. התגובה יכולה להיות מחוזקת באמצעות אמוניום סולפט ניקל. שיטות אלה מאפשרים זיהוי של נוירונים פעילים במהלך אתגרים פיסיולוגיים שונים ולכן זיהוי ו / או המיפוי של מסלולים היקפיים ומרכזי מעורב התגובות הפיזיולוגיות הרצופות.
C-Fos הוא גן מוקדם מיידי, ואת זיהוי המוצרים שלה, חלבון C-FOS, משמש קלסי לזהות אוכלוסיות נוירונים המעורבים בתגובות נשימה ספציפיות in vivo 11,13,25,28 לשעבר vivo 16-18, 27,32,33.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול …
The authors have nothing to disclose.
The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).
Cell culture plate 12-Well | Costa | 35/3 | |
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane | Corning | 3477 | The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts |
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
Vectastain Elite ABC KIT | Vector laboratories | PK-6101 | |
(Rabbit IgG-secondary antibody) | |||
NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
NaOH 0.1N | Sigma | 43617 | |
Polyvinyl-Pyrrolidone | Sigma | PVP-360 | |
Sucrose | Sigma | S7903 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Ethylene-glycol | Sigma | 33068 | |
Triton X100 | Sigma | T8787 | |
Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
Trisma Base | Sigma | T1503 | |
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Rockland | DAB50 | |
Nickel ammonium sulphate | Alfa Aesar | 12519 | |
H2O2 | Sigma | H1009 | |
Xylene | Sigma | 33817 | |
Entellan Neo | Merck Millipore | 107961 | |
Slide | Thermo-scientific | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
Cover glass | Thermo-scientific | Q10143263NR1 | 24 x 60mm |
BSA | Sigma | A2153 |