La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em> En Vivo</em> y<em> Ex Vivo</em

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.

Introduction

El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 ^1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de ^3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos diferentes de estímulos ^4. Por lo tanto, desde el final de 1980 ^5,6, detección de la proteína c-FOS se ha utilizado con frecuencia para estudiar los efectos de factores exógenos sobre la transcripción de genes en general ⁴ y sobre la actividad del sistema nervioso central (CNS) para trazar las vías neuronales involucrados en diferentes fisiológicacondiciones al.

La expresión basal c-fos se ha estudiado en diversas especies, incluyendo ratones, rata, gato, mono, y humano ^4. De este modo, la cinética de su expresión es relativamente bien conocidos. La activación de la transcripción es rápida (5-20 min) ^7,8, y la acumulación de ARNm alcanza un máximo entre 30 y 45 min después del comienzo de la estimulación ⁹ y disminuye con una corta vida media de 12 min. La síntesis de la proteína c-FOS sigue la acumulación de ARNm y se pudo detectar mediante inmunohistoquímica en 20 a 90 minutos después de la estimulación ^6.

Análisis de la expresión de c-fos se utiliza clásicamente en estudios in vivo para identificar la red central de la respiración que participan en las respuestas ventilatorias a la hipoxia o hipercapnia ^10-14. Más recientemente, esta herramienta también se utilizó en las preparaciones del tronco cerebral ex vivo para explorar adaptaciones de red respiratorias centrales a la hipoxia o hypercapnia ^15-18. De hecho, estas preparaciones generan una actividad rítmica clásica asimilada a la unidad central de la respiración ^19. Por lo tanto, este tipo de preparación tiene la ventaja de ser completamente deafferented, y por lo tanto, los resultados con respecto a la expresión de c-fos sólo reflejan las consecuencias de una estimulación central sin ninguna intervención de las estructuras periféricas.

La detección c-FOS podría hacerse por métodos inmunohistoquímicos o immunohistofluorescence. inmunodetección indirecta requiere el uso de un anticuerpo primario contra c-FOS y un anticuerpo secundario dirigido contra la especie en la que se produjo el anticuerpo primario. Para el método de inmunohistoquímica, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima (peroxidasa, por ejemplo) que actúa sobre un sustrato (H ₂ O ₂ para la peroxidasa). El producto de la reacción enzimática se desarrolla por un cromógeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobencidinae), que tiñe y se puede observar en el microscopio de luz. La reacción podría ser reforzado con sulfato de amonio níquel. Estos métodos permiten la detección de sustancias activas neuronas durante diferentes retos fisiológicos y, por tanto, la identificación y / o la cartografía de las vías periféricas y centrales que participan en las respuestas fisiológicas consecutivos.

Protocol

Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado d…

Representative Results

La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de ga…

Discussion

C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo ^{11,13,25,28 16-18, 27,32,33.}

Los pasos críticos dentro del protocolo

Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien prep…

Materials

Cell culture plate 12-Well	Costa	35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane	Corning	3477	The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein)	Santa Cruz Biotechnology	sc-52
Vectastain Elite ABC KIT	Vector laboratories	PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O	Sigma	71505
Na2HPO4	Sigma	S7907
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
NaOH 0.1N	Sigma	43617
Polyvinyl-Pyrrolidone	Sigma	PVP-360
Sucrose	Sigma	S7903
NaCl	Sigma	S7653
Ethylene-glycol	Sigma	33068
Triton X100	Sigma	T8787
Trisma HCl	Sigma	T5941
Trisma Base	Sigma	T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride	Rockland	DAB50
Nickel ammonium sulphate	Alfa Aesar	12519
H2O2	Sigma	H1009
Xylene	Sigma	33817
Entellan Neo	Merck Millipore	107961
Slide	Thermo-scientific	1014356190	Superfrost ultraplus
Cover glass	Thermo-scientific	Q10143263NR1	24 x 60mm
BSA	Sigma	A2153