Summary

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em> En Vivo</em> y<em> Ex Vivo</em

Published: April 25, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Abstract

Muchos estudios tratan de identificar y mapear las regiones del cerebro implicadas en las regulaciones fisiológicas específicas. Los c-fos proto-oncogén, un gen temprano inmediato, se expresa en neuronas en respuesta a diversos estímulos. El producto de proteína se puede detectar fácilmente con técnicas inmunohistoquímicas que conducen a la utilización de la detección de c-FOS para mapear grupos de neuronas que muestran cambios en su actividad. En este artículo, nos hemos centrado en la identificación de poblaciones neuronales del tronco cerebral implicados en la adaptación ventilatoria a la hipoxia o hipercapnia. Se describieron dos enfoques para identificar poblaciones neuronales implicadas en vivo en animales y ex vivo en las preparaciones del tronco cerebral deafferented. En vivo, los animales fueron expuestos a mezclas de gases con hipercapnia o hipoxia. Ex vivo, preparaciones deafferented fueron perfundidas con hipoxia o hipercapnia líquido cefalorraquídeo artificial. En ambos casos, ya sea de control o en los animales in vivo ex preparaciones in vivo se mantuvieron en condiciones de normoxia y normocápnicos. La comparación de estos dos enfoques permite la determinación del origen de la activación es decir, neuronal, periférico y / o central. In vivo y ex vivo, se recogieron brainstems, se fijaron, y cortados en secciones. Una vez que se prepararon secciones, la detección inmunohistoquímica de la proteína c-FOS se hizo con el fin de identificar los grupos de tronco cerebral de células activadas por estímulos hipóxicos o hipercapnia. Las células marcadas se contaron en estructuras respiratorias del tronco cerebral. En comparación con la condición de control, la hipoxia o hipercapnia aumentado el número de células marcadas c-fos en varios sitios del tronco cerebral específicas que son, pues, constitutiva de las vías neuronales implicados en la adaptación de la unidad central de la respiración.

Introduction

El gen c-fos se identificó por primera vez a principios de 1980 1,2 y su producto se caracterizó en 1984 como una proteína nuclear que tiene propiedades de gen activador de 3,4. Participa en los mecanismos a largo plazo asociados con la estimulación de las neuronas. De hecho, los cambios en la actividad neuronal conducen a segundo mensajero de señalización cascadas que inducen la expresión del gen temprano inmediato c-fos, que induce la producción del factor de transcripción c-FOS. Este último inicia la expresión de los genes tardíos y por lo tanto participa en las respuestas de adaptación del sistema nervioso a muchos tipos diferentes de estímulos 4. Por lo tanto, desde el final de 1980 5,6, detección de la proteína c-FOS se ha utilizado con frecuencia para estudiar los efectos de factores exógenos sobre la transcripción de genes en general 4 y sobre la actividad del sistema nervioso central (CNS) para trazar las vías neuronales involucrados en diferentes fisiológicacondiciones al.

La expresión basal c-fos se ha estudiado en diversas especies, incluyendo ratones, rata, gato, mono, y humano 4. De este modo, la cinética de su expresión es relativamente bien conocidos. La activación de la transcripción es rápida (5-20 min) 7,8, y la acumulación de ARNm alcanza un máximo entre 30 y 45 min después del comienzo de la estimulación 9 y disminuye con una corta vida media de 12 min. La síntesis de la proteína c-FOS sigue la acumulación de ARNm y se pudo detectar mediante inmunohistoquímica en 20 a 90 minutos después de la estimulación 6.

Análisis de la expresión de c-fos se utiliza clásicamente en estudios in vivo para identificar la red central de la respiración que participan en las respuestas ventilatorias a la hipoxia o hipercapnia 10-14. Más recientemente, esta herramienta también se utilizó en las preparaciones del tronco cerebral ex vivo para explorar adaptaciones de red respiratorias centrales a la hipoxia o hypercapnia 15-18. De hecho, estas preparaciones generan una actividad rítmica clásica asimilada a la unidad central de la respiración 19. Por lo tanto, este tipo de preparación tiene la ventaja de ser completamente deafferented, y por lo tanto, los resultados con respecto a la expresión de c-fos sólo reflejan las consecuencias de una estimulación central sin ninguna intervención de las estructuras periféricas.

La detección c-FOS podría hacerse por métodos inmunohistoquímicos o immunohistofluorescence. inmunodetección indirecta requiere el uso de un anticuerpo primario contra c-FOS y un anticuerpo secundario dirigido contra la especie en la que se produjo el anticuerpo primario. Para el método de inmunohistoquímica, el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima (peroxidasa, por ejemplo) que actúa sobre un sustrato (H 2 O 2 para la peroxidasa). El producto de la reacción enzimática se desarrolla por un cromógeno (tetrahydrochlorid 3,3-diaminobencidinae), que tiñe y se puede observar en el microscopio de luz. La reacción podría ser reforzado con sulfato de amonio níquel. Estos métodos permiten la detección de sustancias activas neuronas durante diferentes retos fisiológicos y, por tanto, la identificación y / o la cartografía de las vías periféricas y centrales que participan en las respuestas fisiológicas consecutivos.

Protocol

Nota: La detección de c-fos es un procedimiento normalizado que implica varios pasos (Figura 1). Todos los experimentos se realizaron en ratas o ratones. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en el experimento con animales Charles Darwin (ce5 / 2011/05), realizado de conformidad con la Directiva del Consejo Comunidades Europeas de 22 de septiembre, 2010 (2010/63 / UE) para el cuidado de los animales, y realizarse de conformidad con las leyes francesas para el cuidado d…

Representative Results

La detección de c-fos es una herramienta útil que permite la identificación de grupos de células activadas en condiciones específicas, tales como la hipoxia e hipercapnia vivo (Figura 2A) en o en situaciones que imitan estas condiciones ex vivo (Figura 2 B). En vivo, recién nacido, joven , o roedores adultos se colocaron en una caja hermética en que el medio gaseoso es continuamente renovada por una mezcla de ga…

Discussion

C-fos es un gen temprano inmediato, y la detección de su producto, la proteína c-FOS, se utiliza clásicamente para identificar poblaciones neuronales implicados en las respuestas respiratorias específicas in vivo y ex vivo 11,13,25,28 16-18, 27,32,33.

Los pasos críticos dentro del protocolo

Tenga cuidado durante la etapa de perfusión. La solución PFA 4% debe estar bien prep…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The University Paris 13 supported this work. ASPT was supported by a University Paris 13 fellowship and the “Association Française pour le Syndrome d’Ondine”. FJ was supported by a Laboratory of Excellence GR-Ex fellowship. The GR-Ex (ref ANR-11-LABX-0051) is funded by the program “Investissement d’avenir” of the French National Research agency (ref ANR-11-IDEX-0005-02).

Materials

Cell culture plate 12-Well Costa 35/3
15 mm Netwell inserts with mesh polyester membrane Corning 3477 The 15mm diameter well inserts have 74µm polyester mesh bottoms attached to polystyrene inserts
primary antibody (rabbit polyclonal antibody against the c-Fos protein) Santa Cruz Biotechnology sc-52
Vectastain Elite ABC KIT  Vector laboratories PK-6101
(Rabbit IgG-secondary antibody)
NaH2PO4*2H2O Sigma 71505
Na2HPO4 Sigma S7907
Paraformaldehyde Sigma P6148
NaOH 0.1N Sigma 43617
Polyvinyl-Pyrrolidone Sigma PVP-360
Sucrose Sigma S7903
NaCl Sigma S7653
Ethylene-glycol Sigma 33068
Triton X100 Sigma T8787
Trisma HCl Sigma T5941
Trisma Base Sigma T1503
3.3-diaminobenzidine tetrahydrochloride  Rockland DAB50
Nickel ammonium sulphate Alfa Aesar 12519
H2O2 Sigma H1009
Xylene Sigma 33817
Entellan Neo Merck Millipore 107961
Slide  Thermo-scientific 1014356190 Superfrost ultraplus
Cover glass Thermo-scientific Q10143263NR1 24 x 60mm
BSA Sigma A2153

References

  1. Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
  2. Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M. Structure of the FBJ murine osteosarcoma virus genome: molecular cloning of its associated helper virus and the cellular homolog of the v-fos gene from mouse and human cells. Mol Cell Biol. 3, 914-921 (1983).
  3. Curran, T., Miller, A. D., Zokas, L., Verma, I. M. Viral and cellular fos proteins: a comparative analysis. Cell. 36, 259-268 (1984).
  4. Herdegen, T., Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: control of gene expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res Brain Res Rev. 28, 370-490 (1998).
  5. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J Neurosci Methods. 29, 261-265 (1989).
  6. Bullitt, E. Expression of c-fos-like protein as a marker for neuronal activity following noxious stimulation in the rat. J Comp Neurol. 296, 517-530 (1990).
  7. Greenberg, M. E., Ziff, E. B. Stimulation of 3T3 cells induces transcription of the c-fos proto-oncogene. Nature. 311, 433-438 (1984).
  8. Greenberg, M. E., Greene, L. A., Ziff, E. B. Nerve growth factor and epidermal growth factor induce rapid transient changes in proto-oncogene transcription in PC12 cells. J Biol Chem. 260, 14101-14110 (1985).
  9. Muller, R., Bravo, R., Burckhardt, J., Curran, T. Induction of c-fos gene and protein by growth factors precedes activation of c-myc. Nature. 312, 716-720 (1984).
  10. Teppema, L. J., Berkenbosch, A., Veening, J. G., Olievier, C. N. Hypercapnia induces c-fos expression in neurons of retrotrapezoid nucleus in cats. Brain Res. 635, 353-356 (1994).
  11. Teppema, L. J., et al. Expression of c-fos in the rat brainstem after exposure to hypoxia and to normoxic and hyperoxic hypercapnia. J Comp Neurol. 388, 169-190 (1997).
  12. Larnicol, N., Wallois, F., Berquin, P., Gros, F., Rose, D. c-fos-like immunoreactivity in the cat’s neuraxis following moderate hypoxia or hypercapnia. J Physiol Paris. 88, 81-88 (1994).
  13. Bodineau, L., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience. 108, 643-653 (2001).
  14. Erickson, J. T., Millhorn, D. E. Hypoxia and electrical stimulation of the carotid sinus nerve induce Fos-like immunoreactivity within catecholaminergic and serotoninergic neurons of the rat brainstem. J Comp Neurol. 348, 161-182 (1994).
  15. Bodineau, L., et al. Consequences of in utero caffeine exposure on respiratory output in normoxic and hypoxic conditions and related changes of Fos expression: a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Pediatr Res. 53, 266-273 (2003).
  16. Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat. Neuroscience. 132, 843-854 (2005).
  17. Voituron, N., Frugiere, A., Champagnat, J., Bodineau, L. Hypoxia-sensing properties of the newborn rat ventral medullary surface in vitro. J Physiol. 577, 55-68 (2006).
  18. Voituron, N., et al. The kreisler mutation leads to the loss of intrinsically hypoxia-activated spots in the region of the retrotrapezoid nucleus/parafacial respiratory group. Neuroscience. 194, 95-111 (2011).
  19. Suzue, T. Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat. J Physiol. 354, 173-183 (1984).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , e3564 (2012).
  21. Rousseau, J. P., Caravagna, C. Electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording. J Vis Exp. , e53071 (2015).
  22. Start, R. D., Layton, C. M., Cross, S. S., Smith, J. H. Reassessment of the rate of fixative diffusion. J Clin Pathol. 45, 1120-1121 (1992).
  23. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
  24. Paxinos, G., Franklin, K. B. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
  25. Berquin, P., Bodineau, L., Gros, F., Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas involved in respiratory chemoreflexes: a Fos study in adult rats. Brain Res. 857, 30-40 (2000).
  26. Berquin, P., Cayetanot, F., Gros, F., Larnicol, N. Postnatal changes in Fos-like immunoreactivity evoked by hypoxia in the rat brainstem and hypothalamus. Brain Res. 877, 149-159 (2000).
  27. Bodineau, L., Cayetanot, F., Frugiere, A. Fos study of ponto-medullary areas involved in the in vitro hypoxic respiratory depression. Neuroreport. 12, 3913-3916 (2001).
  28. Takakura, A. C., et al. Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats. J Physiol. 572, 503-523 (2006).
  29. Mulkey, D. K., et al. Respiratory control by ventral surface chemoreceptor neurons in rats. Nat Neurosci. 7, 1360-1369 (2004).
  30. Finley, J. C., Katz, D. M. The central organization of carotid body afferent projections to the brainstem of the rat. Brain Res. 572, 108-116 (1992).
  31. Bodineau, L., et al. Data supporting a new physiological role for brain apelin in the regulation of hypothalamic oxytocin neurons in lactating rats. Endocrinology. 152, 3492-3503 (2011).
  32. Okada, Y., Chen, Z., Jiang, W., Kuwana, S., Eldridge, F. L. Anatomical arrangement of hypercapnia-activated cells in the superficial ventral medulla of rats. J Appl Physiol (1985). 93, 427-439 (2002).
  33. Saadani-Makki, F., Frugiere, A., Gros, F., Gaytan, S., Bodineau, L. Involvement of adenosinergic A1 systems in the occurrence of respiratory perturbations encountered in newborns following an in utero caffeine exposure. a study on brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats. Neuroscience. 127, 505-518 (2004).
  34. Morgan, J. I., Cohen, D. R., Hempstead, J. L., Curran, T. Mapping patterns of c-fos expression in the central nervous system after seizure. Science. 237, 192-197 (1987).
  35. Sagar, S. M., Sharp, F. R., Curran, T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level. Science. 240, 1328-1331 (1988).
  36. Herdegen, T., Kovary, K., Leah, J., Bravo, R. Specific temporal and spatial distribution of JUN, FOS, and KROX-24 proteins in spinal neurons following noxious transsynaptic stimulation. J Comp Neurol. 313, 178-191 (1991).
  37. Marina, N., Morales, T., Diaz, N., Mena, F. Suckling-induced activation of neural c-fos expression at lower thoracic rat spinal cord segments. Brain Res. 954, 100-114 (2002).

Play Video

Cite This Article
Perrin-Terrin, A., Jeton, F., Pichon, A., Frugière, A., Richalet, J., Bodineau, L., Voituron, N. The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo. J. Vis. Exp. (110), e53613, doi:10.3791/53613 (2016).

View Video