Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

وغالبا ما يتطلب مراقبة الحركة المفصلية إلى فهم أفضل لديناميات المرتبطة السكاني وأنماط النثر، وتفضيلات النبات المضيف، والتفاعلات البيئية الأخرى. وعادة ما تعقب المفصليات في الطبيعة عن طريق وضع علامات عليها مع علامة فريدة من نوعها ومن ثم إعادة جمعها عبر الزمان والمكان لتحديد قدرات تشتتهم. بالإضافة إلى علامات المادية الفعلية، مثل الغبار الملون أو الطلاء، وأثبتت أنواع مختلفة من البروتينات فعالة جدا لوسم المفصليات للبحث البيئي. البروتينات يمكن أن تدار داخليا و / أو خارجيا. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن البروتينات على المفصليات استعادت مع انزيم مرتبط المناعي فحص بروتين معين (ELISA). نحن هنا وصف بروتوكولات للخارجيا وداخليا علامات المفصليات مع البروتين. وأظهرت مثالين تجريبية بسيطة: (1) علامة البروتين الداخلية التي أدخلت على حشرة من خلال توفير نظام غذائي التخصيب من البروتين و (2) علامة البروتين الخارجية موضعيا لpplied لحشرة باستخدام البخاخات الطبية. نحن ثم تتصل دليل خطوة بخطوة من الساندويتش وطرق ELISA غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين على الحشرات. في هذه المظاهرة، وتناقش مختلف جوانب اقتناء وكشف عن علامات البروتين على المفصليات للعلامة الافراج عن الاستيلاء، علامة التقاط، وأنواع علامة التقاط النفس من البحوث، جنبا إلى جنب مع مختلف الطرق التي كان الإجراء immunomarking تكييفها لتلائم مجموعة واسعة من أهداف البحث.

Introduction

تتبع حركة الآفات المفصلية، وأعداء الطبيعية (الطفيليات والمفترسات)، والملقحات في الطبيعة أمر ضروري لفهم أفضل لكيفية تحسين خدمات النظام الإيكولوجي. المكون الرئيسي لمعظم أنواع البحوث تشتت هو وجود طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة على المفصلية (ق) من الفائدة. مجموعة متنوعة من المواد (على سبيل المثال، والدهانات والأصباغ والأتربة الملونة، والعلامات، والعناصر النادرة، البروتينات) وقد استخدمت للاحتفال المفصليات لتقييم ديناميات السكان، وتشتيت قدراته، والتغذية والسلوكيات، والتفاعلات البيئية الأخرى 1،2.

ومدى ملاءمة علامة تستخدم لتفريق أي بحث معين يتوقف على نوع الدراسة التي تجري. هناك ثلاثة تصنيفات واسعة لوضع علامات المفصليات: (1) علامة الإفراج الاستيلاء (MRR)، (2) علامة التقاط، و (3) علامة التقاط النفس. للبحث علامة الافراج عن الاستيلاء، المحقق عادة يصادف المفصليات جماعي في laboratoراي والنشرات لهم في نقطة مركزية في هذا المجال. ثم استعادت المفصليات في مختلف فترات الزمنية والمكانية باستخدام أجهزة جمع مختلفة (على سبيل المثال، شبكة الاجتياح، فراغ، فخ لزجة) 3،4،5. ثم يتم فحص العينات استعاد لعلامة محددة للتمييز الإفراج عن أفراد الأصلي. للبحث علامة التقاط، المحقق عادة تنطبق علامة مباشرة في مجال استخدام معدات الرش (على سبيل المثال، بخاخ على ظهره، والازدهار وبخاخ فوهة). أفضل علامات للبحوث علامة التقاط غير مكلفة وتطبيقها بسهولة على الموائل والمفصلية ل. للبحث علامة التقاط النفس، المحقق عادة تنطبق علامات إلى الطعم المفصلية 6،7 أو عش مدخل 8. في المقابل، فإن المفصلية يمثل نفسه داخليا من قبل التهام الطعم ملحوظ أو خارجيا من قبل "تنظيف" حتى مقابل المارك فور خروجها من العش.

كما ذكر أعلاه، فقد كان لنا العديد من أنواع علاماتإد وضع علامة مجموعة متنوعة من الأنواع المفصلية. ومع ذلك، عدد قليل جدا مفيدة للجميع ثلاثة من هذه الفئات البحوث النثر. وكان التطور الإجراء البروتين immunomarking انجازا كبيرا لوسم الحشرات. Immunomarking يضع تسمية البروتين على المفصليات سواء داخليا أو خارجيا والتي، بدورها، تم الكشف من قبل انزيم مرتبط المناعي فحص محدد لمكافحة البروتين (ELISA). وكانت أول علامات هذا البروتين المناعي تستخدم الأرانب (مفتش) والدجاج مفتش / IGY 9،10. فإنها تبين أن علامات فعالة جدا لMRR والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). للأسف، والبروتينات مفتش / IGY مكلفة وبالتالي فهي ليست عملية للبحث علامة التقاط ومعظم أنواع البحوث علامة التقاط النفس. وفي وقت لاحق، تم تطوير الجيل الثاني من ELISAs كشف عن البروتين للبروتينات الموجودة في بياض البيض الدجاج (الزلال)، حليب البقر (الكازين) وحليب الصويا (التربسين البروتين المانع). كل فحص حساس جدا ومحددة، وأكثرالأهم من ذلك، يستخدم البروتينات التي هي أقل تكلفة بكثير من البروتينات مفتش / IGY 11. وقد أثبتت هذه البروتينات الفعال لMRR، علامة التقاط، والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة).

في هذه المقالة، وصفنا وشرح كيفية إجراء علامة البروتين الدراسات الاحتفاظ المختبر. مثل هذه الدراسات هي المرحلة الأولى من الأبحاث اللازمة لأي نوع من الدراسة تشتت المجال. على وجه التحديد، فمن الأهمية بمكان أن المحققين أعرف كم من الوقت سيتم الاحتفاظ علامة على الأنواع المفصلية المستهدفة قبل الشروع في دراسات تشتت المجال. هنا، وصفنا وشرح كيفية داخليا وخارجيا بمناسبة الحشرات لMRR، علامة التقاط، وعلامة التقاط النفس دراسات نوع الحقل. نحن بعد ذلك شرح كيفية الكشف عن وجود علامات مع ELISAs غير المباشرة وشطيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الأقسام الداخلية، الاحتفاظ، والكشف الداخلي

  1. الإجراء بمناسبة الداخلي
    1. جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100 فرد) من مستعمرة المختبر تربى على النظام الغذائي الاصطناعي أو من الميدان وتقسم إلى حاويتين تربية نظيفة.
    2. وضع حزمة العادية 20 مل نظام غذائي (لا تحمل علامات علاج المراقبة السلبية) في واحدة من الحاويات. تكملة 20 مل علبة النظام الغذائي الاصطناعي الثانية مع 1.0 مل من 1.0 ملغ / مل الدجاج مفتش / IGY الحل، تخلط جيدا، ووضعه في حاوية أخرى.
      ملاحظة: إذا لم يكن لدى الحشرة من مصلحة نظام غذائي الاصطناعي، يمكن وضع علامة على أو في أي نظام غذائي مستدام وعادة ما على (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء والبيض العث والماء والسكر والعسل).
    3. السماح للحشرات لاستئناف نشاط التغذية لمدة 24 ساعة.
  2. علامة الداخلية إجراء الاحتفاظ
    1. إزالة الحزم النظام الغذائي من كل حاوية وتوريد الحشرات ثإيث مصدر الغذاء أخرى للحفاظ عليها خلال مدة التجربة (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء).
    2. جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات يوميا (أو في أي الفاصل الزمني المطلوب) من كل معاملة وتجمد على الفور في -20 ° C.
  3. شطيرة إجراء ELISA
    1. إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج IGY الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 500 في تريس مخزنة المالحة (TBS) إلى كل بئر من ELISA صفيحة ميكروسكوبية نظيفة واحتضان مدة لا تقل عن 1 ساعة على RT (ملاحظة: microplates يمكن أيضا أن تكون المحتضنة O / N عند 4 درجات مئوية).
    2. تجاهل الضد من لوحة ومنع كل بئر مع 300 ميكرولتر من 1.0٪ الخالي من الدسم حل الحليب الجاف لمدة 30 دقيقة.
    3. في انتظار الخطوات الحضانة السابقة، ضع الحشرات المجمدة بشكل فردي في 1.6 مل أنابيب microcentrifuge مع 1.0 مل من TBS.
    4. تطحن كل الحشرات مع مدقة نظيفة حتى المتجانس تماما وإضافة 100 ميكرولتر من كل عينة لبئر الفردي للELISAطبق. السماح للعينات لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من سلبية (TBS فقط) وإيجابية (بياض البيض في TBS) ضوابط لالآبار في العمود الأول من كل لوحة ELISA. أيضا، إضافة 100 ميكرولتر من الضوابط الحشرات السلبية (الحشرات لا تحمل علامات) إلى 8 آبار في العمود الأخير من كل لوحة (الشكل 1). السماح للعينات التحكم لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة. لاحظ أن النموذج المقدم في الشكل رقم 1 هو القالب نستخدمها لفحوصات موحدة لدينا. وضع العينات في الآبار متروك للسلطة التقديرية للباحث.
    6. غسل كل بئر ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) -tween ثم إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج مفتش / IGY مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 10000 في 1٪ محلول الحليب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    7. غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة إلى كل بئر.
    8. بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبارمع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر.

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي يظهر التسميات جيدا موحدة تستخدم لنموذجي 96 جيدا ELISA صفيحة ميكروسكوبية. كل لوحة تحتوي على 7 آبار مخصصة لضوابط السلبية المالحة تريس مخزنة (TBS)، وهي مخصصة بشكل جيد لعنصر تحكم البروتين الإيجابية (نقاط البيع على Ctrl)، 80 الآبار الفردية المخصصة للحشرات استعادت (نموذج 1 ... 80)، و 8 آبار مخصصة لتحمل أية علامات (السلبية) الضوابط الحشرات (NEG السيطرة 1 ... 8). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الخارجية مارك، الاحتفاظ، والكشف الداخلي

  1. الإجراء بمناسبة الخارجي
    1. جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100الأفراد) من مستعمرة المختبر أو من مجال ومكان إلى قسمين 1.0 L حاويات من البلاستيك مع وجود ثقب قطره 2.5 سم لكمات من جانب كل حاوية.
    2. رش الحشرات في الحاوية الأولى مع 1.0 مل من درهم 2 O (العلاج السيطرة السلبية) باستخدام البخاخات الطبية. رش الحشرات في الحاويات الثانية مع 1.0 مل من محلول 5.0٪ من بياض البيض والدجاج باستخدام البخاخات الطبية.
    3. نعلق خرطوم من البخاخات لمنفذ الهواء المختبرات القياسية ثم قم بإدراج الفم من البخاخات إلى 2.5 سم حفرة من الحاوية. ثم، بدوره على منفذ الهواء تدريجيا حتى تنتج البخاخات بخار.
    4. مواصلة رش (وسم) حتى تم الاستغناء عن حل بياض البيض (حوالي 2-5 دقائق).
    5. إزالة البخاخات ووضع الفلين في حفرة من الحاويات البلاستيكية. السماح للحشرات على الوقوف في RT حتى جفت الحل تماما.
  2. علامة الخارجية إجراء الاحتفاظ
    1. وضع كل معاملة الحشرات الجافة في وعاء منفصل تربية نظيفة لتجنب التعرض لمزيد من العلامة.
    2. إضافة الغذاء والماء إلى حاويات نظيفة للحفاظ على الحشرات خلال مدة الدراسة.
    3. جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات من كل معاملة يوميا وتجمد على الفور في -20 ° C.
  3. الإجراء ELISA غير المباشرة
    1. وضع الحشرات المجمدة بشكل فردي إلى 1.6 مل أنابيب microcentrifuge وإضافة 1.0 مل من TBS.
    2. نقع العينات لمدة 1 ساعة على مجموعة شاكر المداري في 120 دورة في الدقيقة.
    3. إضافة عناصر تحكم السلبية والإيجابية كما هو موضح في الخطوة 1.3.5.
    4. بعد النقع، ماصة قسامة 100 ميكرولتر من كل عينة في واحدة من 80 بئرا عينة المعينة على 96 الجديدة جيدا لوحة ELISA كما هو مبين في الشكل 1 السماح للعينات لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT (ملاحظة: في microplates يمكن أيضا أن تكون O المحتضنة / N عند 4 درجات مئوية).
    5. غسل الآبار ثلاث مرات معPBS-توين ثم قم بإضافة 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (PBS-BSA) إلى كل بئر.
    6. بعد 30 دقيقة في RT يغسل مرتين مع PBS-توين.
    7. إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة البيض الأجسام المضادة الأولية الألبومين المخفف 1: 8000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    8. غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين ثم إضافة 50 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 2000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) لمدة 1 ساعة على RT.
    9. غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من TMB الركيزة إلى كل بئر.
    10. بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبار مع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر.

تحليل 3. البيانات

  1. حساب قيمة الامتصاصية متوسط ​​من 8 الحشرات سيطرة سلبية على كل لوحة ELISA ثم حساب الانحراف المعياري استنادا إلى ضوابط السلبية المجمعة جيئة وذهابام كل من لوحات ELISA لدراسة معينة 12.
  2. إضافة ست مرات الانحراف المعياري المجمعة إلى الوسط التي تم الحصول عليها عن كل لوحة ELISA للحصول على قيمة العتبة إيجابية ELISA. يعتبر أي عينة الحشرات ذات العوائد قيمة الامتصاصية مساوية أو أكبر من هذه القيمة أن تكون إيجابية لوجود علامة البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الداخلية بمناسبة:

وأظهرت نتائج الاختبار الداخلي الاحتفاظ علامة في الشكل 2A. كانت محسوبة ELISA قيمة العتبة الحرجة 0.054. عموما (جميع التواريخ عينة أربعة مجتمعة)، والحشرات علاجها بدون بروتين أسفرت القيم المنخفضة باستمرار ELISA (X = 0.038 ± 0.002، ن = 80). على العكس، كل من الحشرات تتغذى على البروتين المخصب أسفرت عن قيم قوية باستمرار ELISA (X = 0.475 ± 0.221، ن = 80).

بمناسبة الخارجية:

وأظهرت نتائج الاختبار الخارجي الاحتفاظ علامة في الشكل 2B. كانت محسوبة ELISA قيمة العتبة الحرجة 0.082. وعموما، فإن الحشرات ملحوظ موضعيا مع الماء فقط أسفرت منخفضة باستمرار ELISA القيم (X = 0.048 ± 0.007، ن = 80). على العكس، كل من الحشرات ملحوظ موضعيا مع الحل بياض البيض أسفرت عن قيم قوية باستمرار ELISA (X = 0.746 ± 0.232، ن = 80).

الرقم 2
الرقم 2. يعني (± SD) ELISA قيم الكثافة البصرية من (A) الحشرات ملحوظ داخليا مع IGY الدجاج و (B) الحشرات ملحوظ خارجيا مع بياض البيض والدجاج (الزلال). أشرطة سوداء والقيم يعني ± SD ELISA الكثافة البصرية أثمرت عن طريق الحشرات لا تحمل علامات مميزة. كان الحشرات حجم العينة لكل معاملة البروتين اليومية 20 شخصا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وصفت الإجراء immunomarking البروتين المفصلية أول ما يقرب من ربع قرن منذ 9. منذ ذلك الحين، تم تكييفها الإجراء لدراسة أنماط تشتت تشكيلة واسعة من المفصليات باستخدام تدار داخليا وخارجيا مفتش / IgYs. وقد أثبتت هذه البروتينات علامات ثابتة لمجموعة واسعة من أنواع الحشرات اختبار حتى الآن. لكن، وكما ذكر أعلاه، فإن القيود الرئيسية لاستخدام مفتش / IgYs هي أنها مكلفة للغاية. ونتيجة لذلك، مفتش / IgYs لا تصلح إلا لMRR ودراسات النوع علامات النفس حيث يمكن أن تكون علامة دفعات كبيرة من الحشرات في مساحة صغيرة أو يمكن أن تدمج علامات في اتباع نظام غذائي أو الطعم. هنا، قدمنا ​​مظاهرة بسيطة للكيفية التي يمكن أن تدار علامة الداخلية عن طريق تغذية الهدف الحشرات نظام غذائي الاصطناعي المخصب مع مفتش الدجاج / IGY. في المقابل، تم الكشف عن مفتش / IGY باستخدام شطيرة ELISA. هذا النظام قد يكون من المفيد خصوصا للباحثين أن استخدام بالفعلالنظام الغذائي الذي يحتوي على بيض الدجاج منذ الفحص وبطبيعة الحال كشف مفتش / IGY الموجودة في البيض. بالإضافة إلى ذلك، كميات صغيرة من البروتين مفتش / IGY يمكن أن تدار موضعيا للحشرات باستخدام البخاخات الطبية الموصوفة أعلاه (الشكل 3A). تم استخدام البخاخات أول من الطفيليات علامة كتلة حساسة جدا وصغيرة مع مفتش أرنب لنوع MRR البحوث 3. منذ ذلك الحين، تم استخدام طرق أخرى لإدارة العلامات مفتش / IGY لالمفصليات للبحث تشتت. على سبيل المثال، تم استخدام رذاذ العطر لتطبيق علامات مفتش / IGY على أنواع الطفيليات الأخرى 13،14. اتسمت الآخرين داخليا الحشرات المختلفة عن طريق تغذية لهم (أي علامات النفس) الأرنب مفتش المسمى العسل أو السكر 14،15 المياه 16 (الشكل 3B). وأخيرا، بيكر وآخرون. 7 من الورق المقوى لتغذية النمل الأبيض التي كانت مشربة أرنب مفتش (الشكل 3C). هذه النمل الأبيض بسهولة تميز الذاتي كما تناولها الطعام اصطادالمواد.

الشكل (3)
الرقم 3. الطرق المختلفة المستخدمة لإدارة علامة البروتين: (A) الطفيليات الدقيقة التي تميز مع IGY الدجاج باستخدام البخاخات الطبية، (B) لطفيل يتغذى على الأرانب التخصيب مفتش حل العسل، (C) النمل الأبيض تتغذى على أرنب التخصيب مفتش الكرتون بمناسبة الذاتي الطعم، (D) نحل العسل مع الحليب الجاف لأنها تذهب من خلال جهاز الغبار وضعت عند مدخل خلية، (E) الحشرات الأم التي ملحوظ مع الحليب في حقل القطن باستخدام التقليدية تلاعب جرار رش، (F ) الحشرات الأم التي تحمل علامة بياض البيض الدجاج مع جهاز الازدهار ورذاذ فوهة محمولة على مركبة، (G) الحشرات الأم في شريط من البرسيم الذي يتم الاحتفال به مع بياض البيض والدجاج مع العودةحزمة جهاز الرش، و(H، I) الحشرات الأم في البرسيم يتم وضع علامة مع بياض البيض الدجاج باستخدام أدوات تطبيقها الجوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس فقط استخدمت البروتينات مفتش / IGY لدراسة تشتت الحشرات. كما تم استخدامها لتتبع وصلات التغذية في سلسلة المفصلية الغذاء. هاغلر ودوراند 17 أول من اقترح مفهوم بمناسبة فريسة مع مفتش / IGY وبدوره، إجراء محتوى شطيرة الأمعاء مفتش / IGY محددة ELISA على الحيوانات المفترسة التي تستهلك الفريسة ملحوظة. هذه التقنية اكتسبت شعبية في الآونة الأخيرة بين الباحثين تحليل الأمعاء لأنه أقل مملة ومكلفة من إجراء فريسة محددة ELISA أو تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) اكتب التحليلات محتوى الأمعاء الجزيئية (انظر هاغلر 18 و فورنييه وآخرون. (19) لاستعراضات عشرإيجابيات وسلبيات ه لمختلف تقنيات فحص الأمعاء الغليظة). خلال العقد الماضي، وقد استخدمت هذه التقنية immunomarking فريسة لتحديد النشاط تغذية الحيوانات المفترسة القطن على أرنب بعلامات مفتش الآفات 18،20،21، trophallaxis والعلاقات التغذية في مستعمرات النمل الأبيض باستخدام أرنب مفتش المعالجة مصدر الغذاء ورقة 22، granivory لتجميع المفصلية في الغازية بذور الحشائش الهندباء ملحوظ مع الأرنب مفتش 23، نتن علة معدلات الافتراس على hornworms الطماطم مفتش ملحوظ التي تم جمعها في مؤامرات تتعرض لمختلف العلاجات semiochemical 24، والنشاط الكسح المفترس على الجيف مفتش / IGY ملحوظ-25.

تم تطوير الجيل الثاني من الكشف عن البروتين ELISAs غير المباشرة تقريبا قبل عقد من الزمن. وقد صممت هذه ELISAs خصيصا للكشف عن البروتينات الواردة في "حاضرة" المنتجات الغذائية، مثل بروتين البيض الزلال في بياض البيض والدجاج وفول الصويا البروتين مثبط التربسين في حليب الصويا، وبروتين الكازينفي الحليب البقري. أثبتت immunomarkers البروتين الجيل الثاني من المفيد للMRR، علامة التقاط والبحوث نوع علامة الذاتي. على سبيل المثال، أظهرت ايرفين وآخرون 26 انه من الممكن للاحتفال موضعيا الطفيليات الحساسة مع هذه البروتينات الجاهزة. وعلاوة على ذلك، أظهرت هاغلر وآخرون 8،27 أن نحل العسل يمكن علامة الذاتية مع بياض البيض والحليب البقري البودرة الجافة لأنها خروج عن طريق موزع البروتين وضعت عند مدخل خلية (الشكل 3D). ولعل معظم الاستخدام الخلاق للبروتين العلامات تشارك استهداف المغتربون البقر مع بياض البيض باستخدام البخاخ طائرة 28. بدوره، اكتسب البالغين وجه ذبابة علامة الذاتي لدى خروجهما من مراحلها العذراء وخرجت من بات البقر.

وأهم ما يميز الجيل الثاني من immunomarkers البروتين هي أنها متاحة بسهولة بكميات كبيرة وعلى جزء صغير من تكلفة البروتينات مفتش / IGY 11. هذه الميزة قد تزيد السرعةolutionized الطريقة التي يتم بها إجراء بحوث نوع علامة القبض على نطاق المنطقة. على وجه التحديد، المحققين لديهم الآن وسيلة يمكن الاعتماد عليها لبسرعة وبشكل موحد المفصليات علامة على مناطق واسعة في مجال استخدام مجموعة واسعة من معدات الرش التقليدية تلاعب (الشكل 3E). على سبيل المثال، تم وضع علامة عليها الحشرات الآفات مباشرة في البساتين والحقول باستخدام نوع المحمول مسدس الرش 29،30، يحركها آلات الرش دفع الهواء 31،32، والرشاشات زلق 33. هورتون وآخرون. 34 استخدام جهاز كهربائي رش محمولة على سيارة لاند روفر لتحديد التطبيقات من بياض البيض للحشرات الاحتلال محاصيل التغطية جزءا لا يتجزأ من بستان الكمثرى (الشكل 3F). وبالمثل، Swezey وآخرون 5،35 استخدام البخاخ على ظهره لتطبيق تطبيقات محددة من البيض بيض الدجاج إلى صفوف من محصول البرسيم فخ (أ النبات العائل المفضل) جزءا لا يتجزأ من حقل الفراولة المزروعة عضويا لوضع علامة على الآفات وأعدائها الطبيعية ( وآخرون 36 تطبيقها تطبيق البث من الحليب البقري والبيض إلى 29 و 16 هكتار من البرسيم أزهر، على التوالي (الشكل 3H، I). وكان الهدف من هذه الدراسة بمناسبة المفصليات المقيمين في البرسيم، وبعد ذلك، بعد أن تم حصاد البرسيم من قبل القص (مما أثار حالة التشتت)، لتتبع أنماط تشتت المفصليات في حقول القطن المجاورة (محصول عرضة لل أنواع الآفات).

بعض مستخدمي الجيل الثاني الإجراء علامة التقاط عدلت الإجراء الأصلي إلى حد ما لتلبية الاحتياجات البحثية الخاصة. نوع الجسم وحجم روقال انه استهدف الحشرات، جنبا إلى جنب مع خصائصه السلوكية، التي ستحدد حجم وتركيز العلامة المطلوبة وكيف تدار علامة 37. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المستخدمة لاستعادة الحشرات في مجال متوقفة على هذه العوامل. حتى الآن، الطريقة تقريبا كل استخدام (على سبيل المثال، والفخاخ لزجة، وشبكات الاجتياح، فراغ) لجمع الحشرات وقد استخدم بنجاح لجمع الحشرات ملحوظ 3،5،8،11،29،31،32،35،38. ولكن نظرا إلى الحساسيات الشديدة للELISAs كشف عن البروتين، ونحن نؤكد أن عناية كبيرة يجب اتخاذها لضمان أن العينات تحمل علامات لا تصبح ملوثة خلال جمع أو فرز العمليات 38.

وذكرت الدراسة الأصلية 11 التي وصفت الجيل الثاني من أنظمة البروتين بمناسبة (أي ألبومين البيض والحليب الكازين، والتربسين المانع فول الصويا) العوامل التي تؤثر على حساسية الفحص قد تختلف بين أنواع علامة. على وجه التحديد، أنها أظهرت أن DIFمصادر ferent المياه والمواد المضافة (السطحي)، وحتى نوع ELISA لوحة استخدمت تتأثر (سلبا أو إيجابا) على الفحص. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الدراسة ودراسات لاحقة 37،39،40 أن ثلاثة البروتين فحوصات الكشف علامة تختلف في فعاليتها. تم الابقاء على علامة زلال البيض لفترة أطول من علامة الحليب، والتي تم الاحتفاظ أطول من حليب الصويا علامة. هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية البروتين اختبار علامة الإبقاء على أي حشرة معينة قبل الشروع في البحث الميداني. أيضا، هذه الجيل الثاني ELISAs غير المباشرة تظهر أحيانا على مستوى منخفض من الضوضاء في الخلفية مع أنواع معينة من الحشرات (على سبيل المثال، الحيوانات العاشبة) (بيرس. التوليد). ويمكن تخفيض هذه الضوضاء في الخلفية بإضافة 100 ميكرولتر من بيروكسيد الهيدروجين إلى كل بئر من لوحة ELISA لمدة 30 دقيقة بين الخطوة 2.3.4 والخطوة 2.3.5 في البروتوكول أعلاه (unpubl. البيانات).

وتجدر الإشارة إلى أن ELISAs غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين الجيل الثانيهي فعالة جدا في الكشف عن البروتين على الحشرات غارقة في عينة العازلة. ومع ذلك، فإن ELISAs غير المباشرة ليست فعالة مثل شطيرة ELISA في الكشف عن علامات البروتين الداخلية أو البروتينات تفترس الحشرات. وقد أظهرت الدراسات أن ELISAs غير المباشرة ليست فعالة مثل ELISAs شطيرة في الكشف عن البروتين في عينات الحشرات المتجانس 34،41.

عامل مهم للنظر مع أي ELISA هو أن هذا الإجراء غالبا ما يظهر لوحة لوحة (يعزى أساسا إلى يوم بعد يوم آثار تشغيل فحص) تقلب 42،43. وبالتالي، فمن الضروري أن كل لوحة ELISA ما يلي: (1) واحد أو أكثر TBS ضوابط السلبية فقط، (2) واحد أو أكثر TBS + نقية الضوابط الإيجابية البروتين، و (3) لا يقل عن ثمانية ضوابط الحشرات السلبية (أي الأفراد المعروفين لا تحتوي على علامة البروتين). وTBS فقط، TBS + البروتين، وضوابط السلبية الحشرات أؤكد أن المخزن المؤقت ليس مصدرا للخطأ، الكواشف تعمل بشكل صحيح، لالثانية أنه لا توجد أي البروتينات في الحشرات التي تعبر تتفاعل مع الكواشف ELISA، على التوالي. وعلاوة على ذلك، والضوابط السلبية الحشرات ضرورية لحساب ELISA قيم العتبة (انظر أدناه). تصميم لوحة معروضة في هذه التظاهرة تضمنت 7 الفراغات TBS، 1 بروتين + مراقبة إيجابية TBS (في العمود الأول) وثمانية ضوابط السلبية (في العمود الأخير) على كل لوحة ELISA (الشكل 1).

عامل مهم آخر في الاعتبار عند التعامل مع البيانات ELISA هو تحديد قيمة الحد الأدنى للتسجيل حشرة عن وجود أو عدم وجود علامة البروتين. تم تعريف الطريقة التي Stimmann 44 المقترح أصلا لتسجيل الحشرات بعلامات الروبيديوم كمستوى متوسط ​​من علامة في بركة من الحشرات لا تحمل علامات زائد ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري للأفراد غير المراقب. كما تم استخدام هذه الطريقة كأسلوب تقليدي لتسجيل الحشرات لوجود علامات البروتين 9،17. ومع ذلك، في بعض المستخلصاتوفاق، وقد اختار الباحثون بشكل حدسي المزيد من القيم عتبة المحافظة للحد من احتمال الحصول على ايجابيات كاذبة. أسهل طريقة لإضافة فقط 4-6 الانحرافات المعيارية للمتوسط ​​وضوابط السلبية بدلا من ثلاثة 18،34. واقترح طريقة أكثر تطورا للحد من زيادة فرصة الحصول على المغلوطة التي كتبها Sivakoff وآخرون. 12. ينطوي هذا الأسلوب حساب قيمة الامتصاصية يعني من ثمانية الحشرات سيطرة سلبية على كل لوحة ELISA ثم حساب الانحراف المعياري استنادا إلى ضوابط السلبية المجمعة من كل من لوحات ELISA دراسة معينة.

وباختصار، وهي طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة المفصليات أمر بالغ الأهمية لنجاح معظم الدراسات النثر. وقد استخدمت أساليب مختلفة للاحتفال المفصليات مع البروتينات على مدى العقدين الماضيين. immunomarking البروتين وكشف عن علامات سهلة وغير مكلفة نسبيا وقابلة للتكيف جدا لعدد لا يحصى من لياليtudies. يجب على المستخدمين المستقبلي للتقنية immunomarking ضمان منهجيتها مناسبة لخصوصيات أبحاثهم. وسوف تركز وحجم العلامة المطلوبة وكيفية تطبيق علامة على عوامل مثل السلوك، نوع الجسم وحجم الأنواع المستهدفة 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. USDA هو مزود تكافؤ الفرص والعمل.

Acknowledgments

تم توفير التمويل من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس 5347-22620-021-00D و، في جزء منه، من قبل الزراعة والأغذية بحوث مبادرة التنافسية منحة لا. 2011-67009-30141 من المعهد الوطني USDA الأغذية والزراعة. ونحن ممتنون للدعم الفني للجوانا ناصيف. كما نشكر بول بيكر، ديفيد هورتون، دييغو نييتو، وفرانسيس Sivakoff لتوفير بعض الصور المستخدمة في الشكل (3).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Tags

العلوم البيئية، العدد 107، Immunomarking، الحشرات، ELISA، علامة التقاط، علامة الافراج عن الاستيلاء، علامة الذاتي
إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter