Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

İzleme eklembacaklı hareketi genellikle daha iyi ilişkili popülasyon dinamikleri, dağılma şekilleri, konukçu bitki tercihleri ​​ve diğer ekolojik etkileşimleri anlamak için gereklidir. Eklembacaklılar genellikle benzersiz bir işareti ile etiketleyerek doğada izlenir ve daha sonra yeniden toplayarak onların dağılma yeteneklerini belirlemek için zaman ve mekan onları edilir. Bu tür renkli toz veya boya gibi gerçek fiziksel etiketler, ilave olarak, proteinler çeşitli ekolojik araştırmaları için eklembacaklıları işaretlenmesi için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. Proteinler dahili ve / veya harici olarak tatbik edilebilir. Bu proteinler daha sonra bir proteine ​​özgü enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yeniden ele artropodları tespit edilebilir. Burada harici ve dahili protein ile eklembacaklılar etiketleme için protokolleri açıklar. İki basit deney örnekleri gösterilmiştir: haricen bir protein açısından zengin bir diyet ve (2) bir dış proteini işareti sağlayarak bir böcek kişiye (1), bir iç bir protein işaretiTıbbi nebulizer kullanarak bir böceğe pplied. Daha sonra sandviç ve böcekler üzerinde protein işaretleri algılamak için kullanılan dolaylı ELISA yöntemlerinin bir adım-adım rehber ilgilidir. Bu gösteri, mark-release-alınışında, mark-yakalama ve araştırma öz-mark-yakalama türleri için eklembacaklılar üzerinde edinimi ve protein belirteçlerinin tespiti çeşitli yönleri immunomarking yöntem olmuştur çeşitli yollarla birlikte, tartışılır Araştırma hedeflerinin geniş bir yelpazede uyacak şekilde adapte.

Introduction

Doğada Eklembacaklı zararlıların doğal düşmanları (parazitoit ve predatör) ve tozlayıcı hareketini izleme ekosistem hizmetlerini geliştirmek için nasıl daha iyi anlaşılması için gereklidir. Dispersal araştırma türlerinin çoğu için temel bileşeni ilgi eklembacaklıların (ler) etiketlemek için güvenilir bir yöntem yaşıyor. Malzemelerin çeşitli (örneğin, boyalar, boya, renkli tozlar, etiketler, nadir elementler, proteinler) davranışları ve diğer ekolojik etkileşimleri 1,2 beslenme, nüfus dinamikleri, dağılma yeteneklerini değerlendirmek için eklembacaklılar işaretlemek için kullanılmıştır.

Herhangi bir dağıtma araştırma için kullanılan bir marker uygunluğu çalışma tipi yürütülen bağlı olacaktır. (1) mark-release-tekrar yakalama (MRR), (2) mark-yakalama ve (3) kendi kendine mark yakalama: eklembacaklılar markalama üç geniş kategorizasyonlar vardır. Mark-release-tekrar yakalama araştırma için, araştırmacı tipik Laborato kolektif eklembacaklılar işaretlerry ve bu alanda merkezi bir noktada serbest bırakır. Eklembacaklılar daha sonra farklı toplama cihazları (örneğin, süpürme, net, vakum, yapışkan tuzak) 3,4,5 kullanarak çeşitli mekansal ve zamansal aralıklarla yeniden ele alınır. Belirli işareti yerli bireylerden serbest ayırt etmek için recaptured numuneler daha sonra incelenir. Mark-yakalama araştırma için, araştırmacı genellikle alanını kullanarak sprey ekipmanı (örneğin, sırt çantası püskürtücü, bom ve meme püskürtücü) doğrudan işareti uygular. Mark-yakalama araştırma için en iyi belirteçler ucuz ve kolay artropodun yaşam uygulanır vardır. Öz-mark-yakalama araştırma için, araştırmacı genellikle eklembacaklı yem 6,7 veya yuva girişine 8 işaretleri uygular. Buna karşılık, eklembacaklıların o yuvayı çıkarken yukarı işareti karşı "fırçalama" tarafından dışarıdan belirgin yem veya yiyor tarafından içten kendini gösteriyor.

Yukarıda zikredildiği gibi, belirteçler, çok çeşitli bize olmuştured Artropod türlerinin çeşitli etiketlemek için. Ancak, çok az bu dağılımı araştırma kategorilerinin her üçü için yararlıdır. Protein immunomarking prosedürünün geliştirilmesi böcekleri işaretlenmesi için büyük bir atılım oldu. Immunomarking artropodları bir protein etiket koyar dahili veya harici olan da, bir anti-protein belirli bir enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile saptanır. Kullanılan bu tür ilk protein belirteçlerinin tavşan immunoglobulin (IgG) ve tavuk IgG / IgY 9,10 idi. Onlar MRR ve kendini mark-yakalama araştırma (tartışma) için çok etkili işaretler olduğunu kanıtladı. Ne yazık ki, IgG / IgY proteinleri pahalı ve bu nedenle mark-yakalama araştırma ve kendini mark-yakalama araştırma türlerinin çoğu için pratik değildir. Daha sonra, ikinci nesil protein algılama ELISA'lar tavuk yumurta akı (albümin), inek sütü (kazein) ve soya sütü (tripsin inhibitörü protein) içerdiği proteinler için geliştirilmiştir. Her bir deney, yüksek ölçüde duyarlı, spesifik, ve en çokDaha da önemlisi, daha az pahalı IgG / IgY proteinleri 11 daha olan proteinleri kullanılır. Bu proteinler MRR, mark-yakalama ve kendini mark-yakalama araştırma (tartışma) için etkili olduğu kanıtlanmıştır.

Bu yazıda tarif ve protein işareti laboratuvar tutma çalışmaları yapmak nasıl gösterilmektedir. Bu tür çalışmalar saha dağılımı çalışmasında herhangi bir türü için gerekli olan araştırmanın ilk aşaması vardır. Araştırmacılar işareti öncesinde saha dağılma çalışmalarına başlamadan hedeflenen eklembacaklı türler üzerinde muhafaza edilecektir ne kadar biliyoruz Özellikle, kritik öneme sahiptir. Burada, tarif ve dahili ve harici MRR için böcekler, mark-yakalama ve kendini mark-yakalama tipi saha çalışmaları işaretlemek için nasıl gösterilmektedir. Biz o zaman dolaylı ve sandviç ELISA ile işaretleri varlığını tespit etmek için nasıl gösterilmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İç Mark, Tutma ve Algılama Prosedürü

  1. İç işaretleme prosedürü
    1. Yapay diyet veya alanından yetiştirilen bir laboratuvar kolonisinden (n 100 bireyleri ≈) ilgi böcekleri toplamak ve iki temiz yetiştirme kapları bölün.
    2. Kapların birine düzenli bir 20 ml'lik diyet paketi (işaretsiz negatif kontrol tedavisi) yerleştirin. , 1.0 mg / ml tavuk IgG / IgY çözeltisi 1.0 ml ile ikinci 20 mi yapay bir diyet paket Supplement iyice karıştırın ve başka bir kap içine koyun.
      Not: ilgi böcek yapay diyet yoksa işaretleyiniz veya normalde (örn, yeşil fasulye, güve yumurtaları, su, şeker, bal) üzerine sürekli ne olursa olsun diyet yerleştirilebilir.
    3. Böcekler 24 saat onların beslenme etkinliğini sürdürmek için izin verin.
  2. İç işareti tutma işlemi
    1. Her kaptan diyet paketlerini çıkarın ve w böcekler kaynağıBaşka bir besin kaynağı i deney (örneğin, yeşil fasulye) süresi boyunca onları sürdürmek.
    2. Günlük olarak (veya arzu edilen herhangi bir zaman aralığı) her tedavi için bir böcek kohort (n = 20) toplamak ve -20 ° C 'de hemen dondurma.
  3. Sandviç ELISA prosedürü
    1. 1 seyreltilmiş tavşan anti-tavşan IgY birincil antikor 50 ul ekle Tris 500 temiz bir ELISA mikrolevhamn her çukuruna tuz (TBS) tampon ve RT (not 1 saat en az inkübe: mikro de inkübe edilebilir, O / N), 4 ° C'de ilave edildi.
    2. Plaka antikorun atın ve 30 dakika boyunca% 1.0 yağsız kuru süt çözeltisi 300 ul her bir blok.
    3. Önceki İnkübasyon beklerken, TBS 1,0 ml ile ayrı ayrı 1,6 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde dondurulmuş böcek yerleştirin.
    4. İyice homojenize edilene kadar temiz bir havan tokmağı ile her bir böcek öğütün ve ELISA iyi bir birey için her numunenin 100 ulplaka. Numuneler 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe olmasına izin verin.
    5. Her ELISA plakasının ilk sütunda kuyulara 100 (TBS yumurta akı) negatif (TBS sadece) ve pozitif ul kontrolleri ekleyin. Ayrıca, her bir plakanın (Şekil 1) son sütununda 8 kuyu olumsuz böcek denetimleri (işaretsiz böcekler) 100 ul ekleyin. Kontrol numuneleri, 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe olmasına izin verin. Şekil 1'de verilen şablon bizim standartlaşmış deneyleri için kullanmak şablon olduğunu unutmayın. Kuyularda örneklerin yerleştirme araştırmacı takdirine kalmıştır.
    6. Her bir oyuk, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez -tween yıkayın ve daha sonra tavşan anti-tavşan IgG / IgY yaban turpu peroksidaz ile konjuge 1 seyreltilmiş 50 ul: 10.000,% 1 süt çözeltisi ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    7. PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve her bir tetrametilbenzidin (TMB) substrat 50 ul ekle.
    8. 10 dakika sonra, kuyunun okunması650 nm dalga boyuna ayarlanmış bir mikroplaka spektrofotometre ile.

figür 1
Şekil 1., tipik bir 96 için kullanılan standart bir sıra belirtme gösteren bir şematik diyagramdır ELISA mikrotablaya ilave edilmiştir. Her bir plaka, bir pozitif protein kontrolü (Pos Ctrl) bir de, özel Tris-tamponlu tuzlu su, negatif kontroller için adanmış 7 kuyu (TBS) içerir, işaretsiz (negatif) böcek kontrolleri adanmış recaptured böcekler (Numune 1 ... 80) ve 8 kuyu adanmış 80 ayrı kuyu (Neg Ctrl 1 ... 8). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Dış Mark, Tutma ve Algılama Prosedürü

  1. Dış işaretleme işlemi
    1. Çevrede böcekleri toplayın (n 100 ≈2.5 cm çaplı bir deliği olan bir laboratuvar kolonisinden veya iki 1,0 litrelik plastik kaplara alan ve yerden birey) her bir kabın yan kesilerek.
    2. Tıbbi bir nebulizer kullanılarak dH 2 O (negatif kontrol tedavisi) 1,0 ml ilk kap içinde böceklerin püskürtün. Tıbbi bir nebulizer kullanılarak tavuk yumurtası akı bir% 5.0 çözeltisinin 1.0 ml'si ile ikinci kabın böcekleri püskürtün.
    3. Standart bir laboratuvar hava çıkışına nebulizatör hortumu takın ve daha sonra kabın 2.5 cm deliğine nebulizatör ağzını yerleştirin. Nebulizatör bir buhar üretir kadar Sonra yavaş yavaş hava çıkışına açın.
    4. Yumurta akı çözeltisi (yakl. 2-5 dakika) dağıtılan kadar (işaretleme) püskürtme devam edin.
    5. Nebulizatörü çıkarın ve plastik kabın deliğe bir mantar yerleştirin. Çözelti tamamen kuruyana kadar böcekler oda sıcaklığında bekletin.
  2. Dış işareti tutma işlemi
    1. Işareti daha maruz kalmaktan kaçınmak için ayrı bir temiz yetiştirme kabına kuru böceklerin her tedavisini yerleştirin.
    2. Çalışmanın süresi boyunca böcekler sürdürmek için temiz kaplarda yiyecek ve su ekleyin.
    3. Günlük olarak her tedavi için bir böcek kohort (n = 20) toplamak ve -20 ° C 'de hemen dondurma.
  3. Dolaylı ELISA prosedürü
    1. Bireysel 1.6 ml mikrosantrifüj tüpler içine donmuş böcekler yerleştirin ve TBS 1.0 ml ekleyin.
    2. 120 rpm'de bir orbital çalkalayıcı sette 1 saat için numune bekletin.
    3. Aşama 1.3.5 tarif edildiği gibi pozitif ve negatif kontroller ekleyin.
    4. Şekil 1 'de gösterildiği gibi nemlendirici sonra, yeni bir 96 oyuklu ELISA levhası üzerine 80 belirlenen örnek kuyu birine her bir örnek bir 100 ul tablet pipetle numune oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona izin verin. (Not: mikro da olabilir kuluçkalanmıştır O / N 4 ° C'de).
    5. Ile wells üç kez yıkayınPBS-Tween ile yıkandı ve daha sonra% 1 de her sığır serum albümini (PBS-BSA) içeren fosfat tamponlu tuzlu su içinde 300 ul ilave edin.
    6. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, PBS-Tween ile iki kez yıkanır.
    7. Her bir oyuğa, PBS-BSA-Silwet (% 0.05) 'de 8.000 ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir: 1 seyreltilmiş tavşan anti-yumurta albümininin birincil antikor 50 ul ekle.
    8. PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve daha sonra 1 seyreltilmiş bayır turbu peroksidazı ile konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG'si 50 ul: oda sıcaklığında 1 saat için PBS-BSA-Silwet (% 0.05) 'de 2000.
    9. PBS-Tween ile, her oyuğa üç kez yıkayın ve her bir TMB substratı 50 ul ekle.
    10. 10 dakika sonra, 650 nm dalga boyuna ayarlanmış bir mikroplaka spektrofotometre ile kuyu okuyun.

3. Veri Analizi

  1. Fro toplanmış negatif kontroller dayanarak standart sapmayı her ELISA plaka üzerinde 8 negatif kontrol böceklerin ortalama absorbans değerini hesaplayın ve daha sonra hesaplamasım, belirli bir çalışma 12 ELISA plakalar her.
  2. ELISA pozitif eşik değerini elde etmek için her ELISA plakası için elde edilen ortalama altı kat toplanmış standart sapmayı ekleyin. Bu değere eşit ya da daha büyük bir absorbans değeri elde herhangi bir böcek Numune, protein işareti varlığı için pozitif olduğu kabul edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İç işaretleme:

İç işareti tutma testi sonuçları Şekil 2A'da gösterilmektedir. Hesaplanan ELISA kritik eşik değeri 0,054 idi. Genel (dört örnek tarihleri ​​kombine), protein olmadan tedavi böcekler sürekli düşük ELISA değerleri (X = 0.038 ± 0.002, n = 80) vermiştir. Tersine, böceklerin tüm protein zenginleştirilmiş diyet sürekli güçlü ELISA değerleri (X = 0,475 ± 0,221, n = 80) vermiştir beslenen.

Dış işaretleme:

Dış işareti tutma testi sonuçları Şekil 2B'de gösterilmiştir. Hesaplanan ELISA kritik eşik değeri 0.082 oldu. Genel olarak, topikal sadece su ile işaretlenmiş böcekler sürekli düşük ELI vermiştirSA değerleri (X = 0.048 ± 0.007, n = 80). Tersine, topikal yumurta akı çözeltisi ile işaretlenmiş böcekler her sürekli güçlü ELISA değerleri (X = 0,746 ± 0,232, n = 80) vermiştir.

Şekil 2,
Şekil 2. Ortalama (± SD) ELISA tavuk IgY ve tavuk yumurta akı (albümin) ile harici işaretli (B) böcekler ile içten işaretlenmiş (A) böceklerin optik yoğunluk değerleri. Siyah çubuklar ortalama ± SD ELISA optik yoğunluk değerleri ile elde edilir işaretsiz böcekler. Her günlük protein tedavisi için Böcek örneklem büyüklüğü 20 kişi oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eklembacaklı protein immunomarking prosedürü ilk yüzyıl önce 9 neredeyse dörtte tanımlanmıştır. O zamandan beri, prosedür hem dahili ve harici uygulanan IgG / IgYs kullanarak eklembacaklıların geniş bir yelpazede dağılma modellerini incelemek için adapte edilmiştir. Bu proteinler şu ana kadar test edilen böcek türlerinin çok çeşitli kararlı işaretleri kanıtlamıştır. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, IgG / IgYs kullanmak için önemli bir sınırlama çok pahalı olmasıdır. Sonuç olarak, IgG / IgYs İİH ve böceklerin büyük toplu küçük bir alana işaretlenebilir veya işaretler, bir diyet veya yem içine dahil edilebilir kendini işaretleme tipi çalışmaları için sadece yararlıdır. Burada, bir iç işareti tavuk IgG / IgY ile zenginleştirilmiş bir diyet yapay böcek hedef besleyerek verilebilir nasıl basit bir gösteri sağladı. Buna karşılık, IgG / IgY bir sandviç ELISA kullanılarak saptandı. Bu sistem, zaten kullanan araştırmacılar özellikle avantajlı olabilirdoğal yumurta bulunan IgG / IgY algılar tahlil beri tavuk yumurtası içeren diyet. Buna ek olarak, IgG / IgY proteini az miktarda (Şekil 3A), yukarıda tarif edilen tıbbi püskürtücü kullanılarak böcekler topik olarak uygulanabilir. Bir nebülizatör ilk MRR tipi araştırması 3 tavşan IgG ile kitle işareti çok hassas ve küçük parazitoit için kullanıldı. O zamandan bu yana, diğer yöntemler dağıtma araştırma için eklembacaklıların IgG / IgY işaretleri yönetmek için kullanılmıştır. Örneğin, bir parfüm atomizör diğer parazitoiti türler 13,14 IgG / IgY işaretleri uygulamak için kullanılmıştır. Diğerleri dahili onları besleyerek çeşitli böcekler işaretlediğiniz (yani, kendini işaretleme) tavşan IgG etiketli bal 14,15 veya şekerli su 16 (Şekil 3B). Son olarak, tavşan IgG (Şekil 3C) ile emdirildi termitlere Baker ve ark., 7 beslenen karton. Onlar baited gıda yutulur gibi bu termitler kolayca kendini işaretlimaddeleri.

Şekil 3,
Şekil 3. Çeşitli yöntemler, bir protein işareti yönetmek için kullanılan (A), hassas parazitoidler bir tavşan IgG-zenginleştirilmiş Kartona besleme tıbbi bir nebulizer kullanılarak tavuk IgY, (B), tavşan IgG-zenginleştirilmiş bal çözeltisi üzerine besleme parazitoiti, (C) termitler ile işaretlenen Onlar yerli böcekler geleneksel traktör sprey teçhizat kullanılarak pamuk tarlasında süt ile işaretlenmiş bir kovanın girişinde, (E) yerleştirilen bir toz cihazı (F geçmesi gibi yem, (D) bal arılarının kuru süt ile kendini işaretleme ) yerel böcekler, bir ATV, (G) yonca bir şerit yerli böcekler üzerine monte edilmiş bir patlama ve meme püskürtme cihazı ile tavuk yumurta akı ile işaretlenmiş bir arka tavuk yumurta akı ile işaretlenmişYonca pack sprey cihazı ve (H, I) yerel böcekler hava aplikatörlerin kullanarak tavuk yumurta akı ile işaretlenmiş olması. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

IgG / IgY proteinleri sadece böcek dağıtmasına incelemek için kullanılmamıştır. Ayrıca eklembacaklı besin zincirinin trofik bağlantıları izlemek için kullanılmıştır. Hagler ve Durand 17 ilk belirgin avını tüketilen avcılar üzerinde bir IgG / IgY özgü sandviç gut içeriği ELISA yürütülmesi, sırayla, IgG / IgY ile avlarını işaretleme kavramını önerdi ve. O av spesifik ELISA veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) iletken daha az sıkıcı ve pahalı olduğundan, bu teknik, son zamanlarda bağırsak analizi araştırmacılar arasında popülerlik kazanmıştır moleküler bağırsak içeriği analizleri tip (th yorumlara Hagler 18 ve Fournier ve ark. 19 bkze artılarını ve çeşitli bağırsak tahlil teknikleri eksileri). Geçtiğimiz on yıl içinde, av immunomarking tekniği tavşan IgG-işaretlenmiş zararlılara 18,20,21, kağıt besin kaynağı 22 IgG tedavi bir tavşan kullanarak trophallaxis ve termit kolonilerinin besleme ilişkileri, granivory pamuk yırtıcı besleme aktivitesini belirlemek için kullanılır olmuştur Tavşan IgG 23 ile işaretlenmiş invaziv karahindiba yabani ot tohumları bir eklembacaklı montajının çeşitli semiochemical tedavilere 24 tabi araziler toplanan IgG işaretli domates hornworms böcek avlanma oranları ve IgG / IgY işaretli leş 25 yırtıcı süpürücü aktivite kıyameti.

Protein tespiti dolaylı ELISA ikinci kuşak on yıl önce neredeyse geliştirilmiştir. Bu ELISA'lar gibi tavuk yumurta akı yumurta albumin protein, soya sütü soya tripsin inhibitörü proteini ve kazein proteini gibi "off-the-raf" gıda ürünleri, içerdiği proteinler tespit etmek için özel olarak tasarlanmıştırsığır sütünde. Ikinci nesil protein immunomarkers MRR, mark-yakalama ve kendini işareti tipi araştırma için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örneğin, Irvin ve ark., 26 bunun mümkün olduğu, bu off-the-raf proteinleri ile hassas parazitoit topikal işaretlemek için olduğunu gösterdi. Ayrıca, Hagler ve ark., 8,27 gösterdi bal arılarının can yumurta akı ve sığır süt kuru tozlar ile kendini işareti kovanı (Şekil 3D) girişinde yerleştirilen bir protein dağıtıcı aracılığıyla çıkarken. Belki de proteinin en yaratıcı kullanımı bir jet püskürtücü 28 ile yumurta akı ile inek pats hedef alan işaretleme. Onların pupa aşamasından çıktı ve inek pat çıkıldı Buna karşılık, yüz sinek yetişkinlerin kendi kendine işareti satın aldı.

Ikinci nesil protein immunomarkers en önemli özelliği kitle miktarlarda ve IgG / IgY proteinlerinin 11 maliyetinin bir kısmını hazır olmasıdır. Bu özellik rev varAlan geniş mark-yakalama tipi araştırması yapılır yolu olutionized. Özellikle, araştırmacılar artık güvenilir bir yöntem var konvansiyonel sprey teçhizat donanımları (Şekil 3E) geniş bir yelpazede kullanarak alanındaki engin alanlarda hızlı ve homojen bir etiket eklembacaklılar için. Örneğin, haşere böcekler portatif el tabancası tipi spreyler 29,30, traktör tahrikli hava şoku püskürtme 31,32 ve kızak spreyler 33 ile bahçelerde ve tarlalarda doğrudan işaretlendi. Horton ve ark., 34 bir armut bahçesinde (Şekil 3F) gömülü kapak bitkileri işgal böceklere yumurta akı uygulamaları saptamak için bir arazi araca monte elektrikli sprey cihazı kullanıldı. Benzer şekilde, Swezey ve ark., 5,35 (bir zararlının ve doğal düşmanları işaretlemek için bir organik olarak yetiştirilen çilek alanında gömülü bir yonca tuzak kırpma (bir tercih konak bitki) satır tavuk yumurta akı kesin uygulamalarını uygulamak için bir sırt çantası püskürtücü kullanılan ve ark., 36 çiçeklenme alfalfa 29 ve 16 ha, sırasıyla, (Şekil 3H, I), sığır, süt ve yumurta akı bir yayın uygulanmakla. Bu çalışmanın amacı, yonca yerleşik eklembacaklılar işaretlemek için, ve sonra, yonca (duyarlı bir kırpma komşu pamuk alanlarına eklembacaklıların dağılma kalıplarını izlemek için, (bir dağılma olayı kıvılcım) biçme ile hasat edildikten sonra haşere türleri).

Ikinci nesil işareti yakalama prosedürü Bazı kullanıcılar biraz kendi özel araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için özgün prosedürü değiştirdiniz. Vücut tipi ve t boyutuO, böcek hedeflenen onun davranışsal özellikleri ile birlikte, hacim ve markanın konsantrasyonu gerekli ve nasıl işareti 37 uygulanır belirleyecektir. Ayrıca, alandaki böcekler geri almak için kullanılan yöntem bu faktörlere bağlı olacaktır. Bugüne kadar, hemen hemen her yöntemi (örneğin, yapışkan tuzaklar, süpürme ağlar, vakum) böcekleri toplamak için işaretli böcekleri 3,5,8,11,29,31,32,35,38 toplamak için başarıyla kullanılmaktadır kullanılmaktadır. Ancak, protein algılama ELISA aşırı hassasiyetleri nedeniyle, biz büyük bir dikkatle işaretsiz numuneler toplama veya sıralama süreçlerinde 38 sırasında kontamine olmazlar sağlamak için alınması gerektiğini vurgulamaktadır.

Protein markalama sistemleri (örneğin, yumurta albümini, kazein, süt, soya tripsin inhibitörü) ikinci nesil tarif edilen orijinal çalışma 11 işaretleyici türleri arasında değişebilir deney duyarlılığını etkileyen faktörleri rapor etmiştir. Özel olarak, o dif gösterdiferent su kaynakları, katkı maddeleri (sürfaktanlar) ve ELISA plakasının daha tipi (pozitif veya negatif) deneyi etkilenen kullanmıştır. Ayrıca, bu çalışma ve sonraki çalışmalarda 37,39,40 üç protein işaret algılama deneyleri etkinliği farklılık gösterdi. Yumurta beyazı işaretleyici uzun soya sütü işaretleyici daha uzun tutuldu süt belirteci, daha tutuldu. Bu sonuçlar önceki alan araştırması başlamadan için herhangi bir böceğin üzerine test protein işareti tutma önemini vurgulamaktadır. Ayrıca, bu ikinci nesil dolaylı ELISA bazen bazı böceklerin türleri (örneğin, otçul) ile arka plan gürültü (pers. Obs) düşük seviyesini gösterir. Bu arka plan gürültü yukarıdaki protokole Aşama 2.3.4 ve Adım 2.3.5 arasında 30 dakika boyunca ELISA plakasının her bir oyuğuna (yayınlanmamış. Verileri) ve hidrojen peroksit, 100 ul ilave edilerek düşürülebilir.

Bu kullanılan dolaylı ELİSA 'lar ikinci nesil protein işaretleri tespit etmek için dikkat edilmelidirnumune tamponu içinde ıslatılmış böcek proteininin tespit etmede çok etkilidir. Ancak, dolaylı ELISA böcekler üzerinde dahili protein işaretleri veya av proteinleri tespit de sandviç ELISA kadar etkili değildir. Çalışmalar dolaylı ELISA homojenize böcek örneklerinin 34,41 protein tespit etmede sandviç ELISA kadar etkili olmadığını göstermiştir.

Herhangi bir ELISA ile dikkate alınması gereken önemli bir faktör prosedürü genellikle plaka-to-plaka değişkenlik 42,43 (bir test çalışan gün-gün etkilerine özellikle atfedilen) göstermesidir. Bu nedenle, her ELISA plaka içerir gereklidir: (1) bir veya daha fazla TBS yalnızca negatif kontrol, (2) bir veya daha fazla TBS + saf bir protein pozitif kontrol grubu, ve (3) en az sekiz negatif böcek kontrol (yani, bireyler, bilinen ) bir protein işareti içermemesi. TBS sadece TBS + protein ve böcek negatif kontroller tampon hata kaynağı olmadığını temin ederim, reaktifler, düzgün çalışıyornd sırasıyla ELISA reaktifleri ile reaksiyona çapraz böceğin herhangi proteinler yoktur ki. Ayrıca, böcek negatif kontroller ELISA eşik değerleri (aşağıya bakınız) hesaplamak için gereklidir. Bu gösteriye gösterilen plaka tasarımı her ELISA plaka üzerinde 7 TBS boşlukları, (ilk sütunda) 1 proteini + TBS pozitif kontrol ve (son sütunda) sekiz negatif kontroller (Şekil 1) dahil.

ELISA verileri ele bir protein işareti olup olmadığını belirlemek için bir böcek skoru bir eşik değerini belirlemek için bir diğer önemli faktör dikkate. Başlangıçta rubidyum-işaretlenmiş böcekler puanlama için Stimmann 44 tarafından önerilen yöntem işaretsiz böcekler artı işaretsiz bireylerin üç kez standart sapma bir havuzda marker ortalama düzeyi olarak kabul edildi. Bu yöntem aynı zamanda, protein işaretleri 9,17 varlığı için böceklerin puanlama için geleneksel bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Ancak, bazı cas içindees araştırmacılar sezgisel yanlış pozitif elde olasılığını azaltmak için daha muhafazakar eşik değerleri seçtiniz. Kolay yöntem, sadece üç yerine 18,34 negatif kontrollerin ortalamasına dört ila altı standart sapmalar eklemektir. Ayrıca yanlış pozitif elde şansını azaltmak için daha gelişmiş bir yöntem Sivakoff ve ark., 12 tarafından önerilmişti. Bu yöntem, her ELISA plaka üzerinde sekiz negatif kontrol böceklerin ortalama absorbans değerinin hesaplanması ve daha sonra belirli bir çalışmanın ELISA plakalarının tüm toplanmış negatif kontrol dayanarak standart sapmayı hesaplamak gerektirir.

Özetle, eklembacaklılar etiketlemek için güvenilir bir yöntem çoğu dağılma çalışmaların başarısı için kritik öneme sahiptir. Çeşitli yöntemler, son iki yıl içinde proteinler ile eklem bacaklıların işaretlemek için kullanılmıştır. Protein immunomarking ve markaların tespiti s sayısız nispeten kolay ve ucuz ve çok uyarlanabilirtudies. Immunomarking tekniği Geleceği kullanıcıların metodoloji kendi araştırmalarının ayrıntılarına uygun olduğundan emin olmalıdır. Işareti uygulanır konsantrasyon ve işareti hacmi gerektiği ve nasıl hedef türlerin 40 davranışı, vücut tipi ve boyutu gibi faktörlere bağlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu yayındaki ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon belirli bilgi vermek amacıyla sadece ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından öneri veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

Acknowledgments

Harçlar Tarım ve Gıda Araştırmaları Girişimi Rekabetçi Grant hayır, kısmen, USDA CRIS 5347-22620-021-00D tarafından sağlandı ve. Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü 2011-67009-30141. Biz Johanna Nassif teknik destek için müteşekkiriz. Biz de Şekil 3'te kullanılan resimlerin bazılarını sağlamak için Paul Baker, David Horton, Diego Nieto ve Frances Sivakoff teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Tags

Çevre Bilimleri Sayı 107 Immunomarking böcek ELISA mark-yakalama mark-release-tekrar yakalama öz-mark
Yönetme ve Dağılma Araştırma Arthropodlara Protein Marks algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter