Abstract
监测节肢动物运动常常需要更好地理解相关的人口动态，扩散图案，宿主植物偏好，和其它生态相互作用。节肢动物通常跟踪性质通过用一种独特的标记标记它们并重新加以收集在时间和空间，以确定它们的散布能力。除了实际的物理标记，如彩色灰尘或涂料，各种类型的蛋白已被证明非常有效的标记节肢动物生态研究。蛋白质可以在内部和/或外部给药。蛋白质然后可以上夺回节肢动物用蛋白质特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。在这里，我们描述了外部和内部标记节肢动物与蛋白质协议。两个简单的实验例演示了：（1）通过提供一种富含蛋白质的饮食和（2）的外部的蛋白标记局部一个引入到昆虫的内部蛋白标志pplied使用医用喷雾器昆虫。然后，我们涉及的三明治和用于检测的昆虫蛋白标记间接ELISA方法一步一步的指导。在此示范，采集和检测的蛋白质标志物上的节肢动物对马克释放重捕，标记捕获，和研究自标记捕获类型的各个方面进行了讨论，随着该immunomarking程序，一直以来的各种方式调整，以适应各种各样的研究目标。
Introduction
追踪在自然界中节肢动物害虫，天敌（拟寄生物和捕食者），和授粉的运动是必不可少的，更好地了解如何改善生态系统服务。对于大多数类型的扩散研究的关键组件是具有可靠的方法来标记感兴趣的节肢动物（多个）。多种材料（例如，涂料，染料，着色粉尘，标签，稀有元素，蛋白质）已经被用来标记节肢动物评估其种群动态，扩散能力，摄食行为，以及其他生态相互作用1,2。
在用于任何给定的扩散研究的标记物的适当性将取决于正进行研究的类型。有用于标记节肢动物三大分类已：（1）标记释放回捕（MRR），（2）标记捕获，和（3）自标记捕获。对于标记释放回捕研究，研究者通常标志着节肢动物集中在laboratoRy和释放它们在该领域的中心点。节肢动物，然后在不同的空间和时间间隔收复使用不同的采集设备（ 例如 ，扫网，真空，粘纸）3,4,5。在收复标本，然后检查特定的标记，以区分本地个体释放。对于标记捕获的研究中，研究者通常直接应用在使用现场喷涂设备（例如，背负式喷雾器，喷杆和喷嘴喷雾器）的标志。为标记捕获研究的最佳标记是廉价且容易地施加到节肢动物的栖息地。对于自标记捕获的研究中，研究者通常适用痕节肢动物诱饵6,7或巢穴的入口8。反过来，节肢动物通过“刷”了对马克在退出窝吞噬着明显的诱饵或外部内部标记本身。
如上所述，许多类型的标记已经我们编辑标记各种节肢动物物种。然而，很少是所有这三种传播研究类是有用的。蛋白质immunomarking过程的发展是标志着昆虫的一大突破。 Immunomarking把一个蛋白质标签上节肢动物内部或外部，这反过来，是由一种抗蛋白特异性酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。所使用的第一个这样的蛋白质标记物兔免疫球蛋白（IgG抗体）和鸡IgG /卵黄抗体9,10。它们被证明是非常有效的标记为MRR和自标记捕获的研究（见讨论）。不幸的是，抗体/ IgY的蛋白质是昂贵的，因此不实用的标记捕获的研究和大多数类型的自标记捕获的研究。接着，第二代蛋白质检测的ELISA被用于包含在鸡蛋清（白蛋白），牛奶（酪蛋白）和豆浆（胰蛋白酶抑制剂蛋白）的蛋白质开发的。每个测定是高度灵敏的，特异性的，而且，最重要的是，使用的蛋白质，是比的IgG /蛋白的IgY 11便宜得多。这些蛋白质已被证明有效的MRR，标记捕获和自我标记捕获的研究（见讨论）。
在这篇文章中，我们将介绍并演示了如何进行蛋白质标记实验室保留研究。这种研究是所需的任何类型的场扩散研究的研究的第一阶段。具体而言，至关重要的是，调查人员知道有多长的标记将被踏上字段扩散研究之前保留在靶向节肢动物物种。在这里，我们将介绍并演示了如何在内部和外部标记昆虫MRR，标记捕获和自我标记拍摄类型的实地研究。然后，我们说明如何检测与间接和夹心ELISA中的标记的存在。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.内部标志，保留和检测程序
- 内部标记程序
- 收集感兴趣的昆虫（N≈100人）从实验室群体饲养的人工饲料，或从外地分为两个干净的饲养容器。
- 放置一个20个正规ml食物分组（无标记的阴性对照处理）到容器之一。补充一个每秒20毫升的人工饲料包1.0的1.0毫克/毫升鸡IgG /卵黄抗体溶液，调匀，并将其放置在另一个容器。
注意：如果感兴趣的昆虫没有人工饲料，标记可以放置在或在任何饮食它们通常持续上（例如，绿豆，蛾卵，水，糖，蜂蜜）。 - 让昆虫恢复其取食活动24小时。
- 内部标记保留程序
- 取下每个容器中的饮食数据包，并提供昆虫W¯¯第i另一食物来源以维持它们在实验（例如，绿豆）的持续时间。
- 来自每个治疗每天（或在任何期望的时间间隔）收集昆虫的队列（20），并在-20℃下立即冻结。
- 夹心ELISA方法
- 加入50微升稀释的1兔抗鸡的IgY初级抗体：500的Tris缓冲盐水（TBS）到一个干净的ELISA培养板的各孔中，并孵育至少1小时的在RT（注：微孔板，也可以培养ö / N，4℃）。
- 丢弃从板的抗体和用300微升30分钟1.0％的无脂干乳溶液以及阻止的每个。
- 在等待前面的孵化步骤，将冻结昆虫单独1.6 ml离心管中与1.0ml TBS的。
- 磨每个昆虫用干净杵直到彻底均化，并添加100微升各样品到ELISA的单个井盘。允许样品在室温下孵育1小时。
- 加入100微升阴性（仅TBS）和正的（蛋清在TBS中）控制到孔中的每个ELISA板的第一列。另外，在各板（图1）的最后一列中添加100μl的阴性对照昆虫（未标记昆虫）到8孔中。允许控制样品在室温下孵育1小时。 注意 ，在图1中提供的模板是，我们使用我们的标准试验的模板。孔中的样品的放置要由研究者决定。
- 洗各孔三次用磷酸缓冲盐水（PBS） - 吐温，然后添加50微升的兔抗鸡IgG /卵黄抗体缀合辣根过氧化物酶稀释1:10,000在1％牛奶溶液孵育1小时，在室温。
- 用PBS-Tween洗各孔三次，并添加50μl的四甲基联苯胺（TMB）底物的每个孔中。
- 10分钟后，读出井用微孔板分光光度计设定在650nm的波长。
图1表示用于一个典型的96标准化以及标号示意图孔ELISA培养板，每块板含有7井专用于Tris-缓冲盐水阴性对照（TBS），一个井专用到正蛋白对照（位置Ctrl键），致力于夺回虫（样品1 ... 80），和8个孔，致力于无人盯防的（负）昆虫控制80个人口井（NEG按Ctrl 1 ... 8）。 请点击此处查看该图的放大版本。
2.外部标记，保留和检测程序
- 外部标记程序
- 收集感兴趣的昆虫（N≈100个体）从一个实验室群体或从外地和地方成两个1.0升的塑料容器具有直径为2.5厘米的孔冲裁每个容器的侧面。
- 喷在第一容器的昆虫使用的医用喷雾器1.0毫升的dh 2 O（阴性对照处理）。喷在第二容器中的昆虫用1.0毫升鸡蛋清使用医学喷雾器一个5.0％的溶液。
- 连接喷雾器的软管到标准实验室空气出口，然后插入雾化器的口进入容器的2.5厘米的孔。然后，打开出风口逐渐直至雾化器产生蒸汽。
- 继续喷射（标记），直至蛋清溶液已被分配（约2-5分钟）。
- 除去雾化器和放置一个软木入塑料容器的孔。让昆虫站在RT直至溶液完全干燥。
- 外部标记保留程序
- 将干燥的昆虫每次治疗到一个单独的干净容器中饲养，以避免进一步暴露的标志。
- 加入食物和水的干净的容器在研究期间维持昆虫。
- 每日收集来自每个处理的昆虫的队列（20），并在-20℃下立即冻结。
- 间接ELISA方法
- 将冷冻昆虫分别为1.6毫升离心管中，加入1.0毫升TBS的。
- 浸泡样品1小时在定轨摇动器组在120rpm。
- 加入阴性和阳性对照的步骤1.3.5描述。
- 浸泡后，吸取从每个样品一100μl的等分试样插入一个新的96孔ELISA板的80指定样品孔中的一个，如图1允许样品在室温下孵育1小时（注：在微孔板，也可培养O / N在4°C）。
- 用洗孔三次PBS-吐温，然后添加300微升含有1％牛血清白蛋白（PBS-BSA）到每个孔中的磷酸缓冲盐水。
- 在室温30分钟后，用PBS-Tween洗两次。
- 加入50微升稀释的1兔抗卵清蛋白的一抗的：在PBS-BSA-的Silwet（0.05％）8000至每个孔，并孵育1小时，在室温。
- 用PBS-Tween洗各孔三次，然后加入50微升山羊抗兔IgG缀合的辣根过氧化物酶稀释1：1小时在RT 2000在PBS-BSA-的Silwet（0.05％）。
- 用PBS-Tween洗各孔三次，并加入50微升TMB底物至每孔中。
- 10分钟后，读出的井微量培养板分光光度计设定在650nm的波长。
3.数据分析
- 计算8阴性对照昆虫的吸光度平均值在每个ELISA板，然后计算基于所述合并阴性对照来回的标准偏差m该给定的研究12的ELISA板。
- 添加六倍汇集标准偏差为每个ELISA板以获得ELISA阳性阈值而得到的平均值。任何昆虫样品得到的吸光度值等于或大于该值被认为是阳性的蛋白质标记的存在。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
内部标记：
内部标记保持试验的结果示于图2A中。计算出的ELISA临界阈值是0.054。总体（所有四个样本数据合并），没有蛋白质治疗的昆虫产生持续偏低ELISA值（x = 0.038±0.002，N = 80）。相反，所有的昆虫喂富含蛋白质的饮食产生持续强劲的ELISA值（x = 0.475±0.221，N = 80）。
外部标记：
外部标记保持试验的结果示于图2B。计算出的ELISA临界阈值为0.082。总体而言，局部打上只有水的昆虫产生持续偏低ELISA值（x = 0.048±0.007，N = 80）。相反，所有的局部标有蛋清液的昆虫产生持续强劲的ELISA值（x = 0.746±0.232，N = 80）。
图 2。 平均（±SD）ELISA检测鸡卵黄抗体并用鸡蛋白（白蛋白）标示外（B）昆虫内部标记（A）昆虫光密度值。黑条的平均值±SD ELISA光密度值产生了由无人盯防的昆虫。每个每日蛋白质的治疗昆虫样本量为20人。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
节肢动物蛋白immunomarking过程首次被描述一个世纪前9的近四分之一。此后，程序已经适应研究各种各样的使用在内部和外部施用的IgG / IgYs节肢动物的分散型态。这些蛋白质已被证明坚定标记的各种测试迄今的昆虫物种。然而，如上所述，对于使用的IgG / IgYs的主要限制是，它们是非常昂贵的。因此，抗体/ IgYs仅用于MRR和自标记类型的研究，其中的昆虫的大批量可标记在小的空间或标记可以掺入饮食或诱饵有用。在这里，我们提供了怎样的内部标记可以通过喂食目标昆虫的人工饲料富含鸡IgG /卵黄抗体给予一个简单的演示。反过来中，IgG / IgY抗体，使用夹心ELISA检测。该系统可能是特别有利的研究人员已经使用一饮食中含有鸡蛋，因为该法自然会检测到的IgG /卵黄抗体在鸡蛋中。此外，少量的IgG /蛋白的IgY的可局部给药至使用上述（图3A）中描述的医疗喷雾器昆虫。雾化器最早用于质量标志非常微妙和微小的寄生与兔IgG的MRR型研究3。自那时以来，其他方法已被用于施用的IgG / IgY的马克到节肢动物为扩散研究。例如，香料喷雾器已被用于施加于其他寄生物种13,14的IgG / IgY的标记。喂养它们他人内部被标记各种昆虫（即，自标记）兔IgG标记的蜂蜜14,15或糖水16（图3B）。最后，Baker等7馈纸板到已浸渍兔IgG（图3C）的白蚁。这些白蚁很容易自我标记，因为他们摄入的食物诱饵东西。
图 3。 各种方法用于管理的蛋白质标记：（A）精致的寄生蜂被标记鸡卵黄抗体使用医用雾化器，（B）一个寄生于兔IgG富集的蜂蜜水溶液喂，（C）白蚁对兔IgG富集纸板喂养用干牛奶诱饵，（D）的蜜蜂自标记，因为它们经过放置在蜂房的，（E）的入口除尘装置天然昆虫被标以使用常规的拖拉机喷洒钻机，牛奶在棉场 （F ）原生虫被打上鸡蛋白与安装在亚视，（G）在苜蓿条原生虫的繁荣和喷嘴的喷雾装置被打上鸡蛋白一回包喷雾装置，并在紫花苜蓿（H，I）原生昆虫被标记使用空中涂抹鸡蛋清。 请点击此处查看该图的放大版本。
抗体/卵黄抗体蛋白已经不只是被用于研究昆虫传播。它们也被用于跟踪在节肢动物食物链营养链接。哈格勒和迪朗17首次提出标志着猎物的IgG /卵黄抗体的概念，反过来，进行了抗体/卵黄抗体特异性肠道夹心ELISA内容上消耗的显着猎物的食肉动物。这种技术最近获得了普及之中肠道分析研究，因为它是更少繁琐和昂贵的比导电猎物特异性ELISA或聚合酶链反应（PCR）型分子肠内容分析（见哈格勒18和Fournier等人的 19个的评价的Ë优点和各种肠道测定技术缺点）。在过去的十年中，猎物immunomarking技术已被用于标识兔IgG标害虫18,20,21，交哺和白蚁群饲养的关系用兔IgG处理过的纸的食物来源22，granivory棉花天敌取食活动在标有兔IgG 23侵入蒲公英杂草种子节肢动物组合的，臭的抗体标记的番茄天蛾虫捕食率收集地块受到各种semiochemical治疗24，和IgG抗体/卵黄抗体标记腐肉25捕食者清除活性。
第二代蛋白质检测间接ELISA试剂盒进行了将近十年前开发的。这些ELISA的是专门设计来检测包含在“场外的货架”食品产品，如卵清蛋白蛋白在鸡蛋清，在豆奶大豆胰蛋白酶抑制剂的蛋白质，和酪蛋白的蛋白质在牛乳。第二代蛋白质immunomarkers已经证明了MRR，标记捕获和自我标记类型的研究很有用。例如，欧文等人 26表明，它是可行的，以局部标记细腻寄生有这些现成的，货架蛋白质。此外，哈格勒等人 8,27表明蜜蜂能自我标记用蛋清和牛乳干燥粉末作为通过蛋白质分配器放置在一个蜂巢（图3D）的入口它们退出。也许标记所涉及的最有创意的使用蛋白靶向牛拍使用喷射式喷雾器28蛋清。反过来，面对飞成年人获得了自我的标记，因为他们从自己的蛹期出现，并退出了牛拍。
第二代蛋白immunomarkers的最重要的特点是，它们是大批量地和IgG抗体/ IgY抗体蛋白11的成本的一小部分不详。此功能有转olutionized区域范围内的标记拍摄类型的研究进行的方式。具体而言，研究人员现在有一种可靠的方法能够迅速且均匀地标签节肢动物比使用各种常规的喷雾钻机设备（图3E）的广大地区的领域。例如，害虫已直接使用手提枪式喷雾器29,30，拖拉机驱动的气流式喷雾器31,32，和防滑喷雾器33果园和农田标注。霍顿等人 34使用安装在全地形车要找准蛋清昆虫占据嵌入在梨园（ 图3F）覆盖作物应用的电喷装置。同样，Swezey 等人 5,35采用背负式喷雾器向鸡蛋清精确的应用程序适用于行的苜蓿陷阱作物（优选的寄主植物）嵌入在有机种植的草莓地，纪念害虫及其天敌（
第二代标记捕捉的程序有些用户修改了原来的程序有所以满足其特定的研究需求。身型和T的大小他目标昆虫，连同其行为特征，将决定的体积和需要的标记的浓度和方式标志施用37。此外，用于重新捕获的昆虫在该领域的方法将取决于这些因素。到目前为止，几乎所有的方法， 使用 （例如，粘虫，扫网，真空）收集昆虫已成功地用于收集标志着昆虫3,5,8,11,29,31,32,35,38。然而，由于蛋白检测ELISA试剂盒的灵敏度极限，我们强调，必须采取非常谨慎，以确保无人盯防的标本不会成为在收集或分拣流程38污染。
最初的研究11所描述的第二代蛋白质标记系统（ 即 ，卵白蛋白，乳酪蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂）的报道影响检测灵敏度可中标记的类型而异的因素。具体来说，他们发现，DIF同的水源，添加剂（表面活性剂）和酶标板的连类型中使用受影响（正面或负面）的检测。此外，该研究和随后的研究37,39,40显示这三种蛋白标志检测分析变化的疗效。蛋清标记被保留长于牛奶标记，将其保持长于豆奶标记。这些结果凸显着手实地调研前的测试蛋白标记保留在任何给定的昆虫的重要性。而且，这些第二代间接ELISA中有时显示的某些类型的昆虫（例如，食草动物）背景噪声（个人OBS）低水平。这个背景噪声可以通过在协议加入100微升过氧化氢到ELISA板的各孔30分钟步骤2.3.4和2.3.5。步骤之间上述（unpubl。数据）被减少。
应当指出，所用的间接ELISA，检测第二代蛋白标记是非常有效的对昆虫浸泡在样品缓冲液中检测该蛋白。然而，间接ELISA中不一样有效的夹心ELISA在检测对昆虫内部蛋白标志或猎物蛋白。有研究表明，间接ELISA中是不一样有效夹心ELISA中在匀化昆虫样品34,41中检测的蛋白质。
与任何的ELISA要考虑的一个重要因素是在过程往往显示板直接制版（主要归因于运行的测定当天到一天效果）变异42,43。因此，至关重要的是，每一个ELISA板包括：（1）一种或多种的TBS只阴性对照，（2）一种或多种的TBS +纯蛋白阳性对照，和（3）至少八个阴性昆虫控制（即，个人的已知不含蛋白标记）。只有TBS，TBS +蛋白质，和昆虫阴性对照保证该缓冲区不是错误的来源，所用试剂都正常工作，一第二，有没有在昆虫交叉与ELISA试剂反应，分别任何蛋白质。此外，昆虫阴性对照是用于计算的ELISA阈值（见下文）是必不可少的。在此示范所示的板的设计包括7的TBS坯，1蛋白质+ TBS阳性对照（在第一列）和8阴性对照（在最后一列）上的每个ELISA板（ 图1）。
当处理的ELISA数据是确定的阈值的得分的昆虫的蛋白质标记的存在或不存在的另一个重要的考虑因素。最初提出Stimmann 44为计分铷标记的昆虫的方法，被定义为标记在没有标记的昆虫加未标记的个体的三倍的标准偏差的一个池的平均等级。这个方法也被用来作为得分昆虫的蛋白质标记9,17的存在的传统方法。然而，在一些CASES，研究人员已经直观地选择更保守的阈值，以减少获得假阳性的可能性。最简单的方法是只添加四个至6个标准偏差的阴性对照，而不是三个18,34的平均值。提出由Sivakoff 等人 12所述的更复杂的方法，以进一步减少获得假阳性的机会。这种方法需要计算八个阴性对照的昆虫在每个ELISA板的平均吸收值，然后基于从所有的给定研究的ELISA板的汇集阴性对照计算的标准偏差。
总之，一种可靠的方法标记节肢动物是最扩散研究的成功是至关重要的。各种方法已被用来在过去的二十年里，以纪念节肢动物与蛋白质。蛋白质immunomarking和标记的检测是相对容易和便宜，非常适合于第无数案例研究。在immunomarking技术未来的用户应该确保他们的方法是适合他们的研究细节。的浓度和所需的标记的量，以及如何将标记施加将取决于象行为目标种类40，身型和尺寸的因素。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
本出版物中的商品名称或商业产品的一提的是专为提供特定信息的目的，由农业部美国农业部并不意味着推荐或认可。美国农业部是平等机会提供者和雇主。
Acknowledgments
经费是由美国农业部CRIS 5347-22620-021-00D提供，并且部分，由农业和食品研究计划竞争性赠款没有。 2011-67009-30141来自粮食和农业的美国农业部研究所。我们感谢技术支持约翰娜纳西夫的。我们也感谢保罗·贝克，大卫·霍顿，迭戈涅托和弗朗西斯Sivakoff提供一些在图3中使用的图片。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
- Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
- Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
- Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
- Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
- Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
- Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
- Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
- Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
- Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
- Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
- Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
- Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
- Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
- Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
- Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
- Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
- Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
- Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
- Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
- Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
- Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
- Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
- Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
- Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
- Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).
