Abstract
Le contrôle des mouvements des arthropodes est souvent nécessaire pour mieux comprendre la dynamique de la population, associés aux modèles de dispersion, les préférences de la plante hôte, et d'autres interactions écologiques. Arthropodes sont généralement suivis dans la nature en les étiquetant avec une marque unique et puis re-collecte eux au fil du temps et de l'espace pour déterminer leurs capacités de dispersion. En plus de balises physiques réelles, comme la poussière ou de la peinture de couleur, divers types de protéines sont avérées très efficaces pour les arthropodes pour la recherche écologique de marquage. Les protéines peuvent être administrées à l'intérieur et / ou extérieur. Les protéines peuvent ensuite être détectés sur les arthropodes recapturés avec un dosage immuno-enzymatique spécifique de la protéine (ELISA). Nous décrivons ici les protocoles pour extérieurement et intérieurement marquage arthropodes avec des protéines. Deux exemples expérimentaux simples sont démontrés: (1) une marque de protéine interne présenter à un insecte en fournissant une alimentation enrichie en protéines et (2) une marque de protéine externe topique d'unepplied à un insecte en utilisant un nébuliseur médical. Nous relions ensuite un guide étape par étape du sandwich et méthodes ELISA indirectes utilisées pour détecter les traces de protéines sur les insectes. Dans cette démonstration, les divers aspects de l'acquisition et la détection des marqueurs de protéines sur les arthropodes de marque à libération-recapture, marque-capture, et les types de recherche auto-marquage-capture sont discutés, ainsi que les diverses façons que la procédure d'immuno-marquage a été adapté pour convenir à une grande variété d'objectifs de recherche.
Introduction
Suivi des mouvements des arthropodes parasites, ennemis naturels (parasitoïdes et des prédateurs), et les pollinisateurs dans la nature est essentielle pour mieux comprendre comment améliorer les services écosystémiques. L'élément clé pour la plupart des types de recherche de dispersion est d'avoir une méthode fiable pour marquer l'arthropode (s) d'intérêt. Une variété de matériaux (par exemple, les peintures, les teintures, les poussières de couleur, des étiquettes, des éléments rares, protéines) ont été utilisées pour marquer les arthropodes pour évaluer la dynamique de leur population, les capacités de dispersion, les comportements alimentaires, et d'autres interactions écologiques 1,2.
La pertinence d'un marqueur utilisé pour toute recherche de dispersion donné sera fonction du type d'étude en cours. Il existe trois grandes catégorisations pour les arthropodes marquage: (1) marque à libération-recapture (MRR), (2) marque-capture, et (3) l'auto-marquage-capture. Pour la recherche marque à libération-recapture, l'enquêteur marque généralement les arthropodes collectivement dans le laborary et libère eux à un point central dans le domaine. Les arthropodes sont ensuite repris à divers intervalles spatiales et temporelles en utilisant différents dispositifs de collecte (par exemple, nets de balayage, sous vide, piège collant) 3,4,5. Les échantillons récupérés sont ensuite examinés pour la marque spécifique de distinguer libéré de personnes indigènes. Pour la recherche marque-capture, l'enquêteur applique généralement la marque directement dans l'équipement de pulvérisation sur le terrain à l'aide (par exemple, un pulvérisateur à dos, la rampe et buse pulvérisateur). Les meilleurs marqueurs pour la recherche marque de capture sont peu coûteux et facilement appliquée à l'habitat de l'arthropode. Pour la recherche d'auto-marquage-capture, l'enquêteur applique généralement aux marques une entrée arthropodes appât 6,7 ou 8 nid. À son tour, l'arthropode se marque en interne par dévorer l'appât ou à l'extérieur marqué par "brosser" contre la marque telle qu'elle quitte le nid.
Comme mentionné ci-dessus, de nombreux types de marqueurs ont été noused pour marquer une variété d'espèces d'arthropodes. Cependant, très peu sont utiles pour ces trois catégories de recherche dispersion. Le développement de la procédure protéine immuno-marquage était une percée majeure pour les insectes de marquage. Immunomarquage met une étiquette de protéine sur les arthropodes interne ou externe qui, à son tour, est détectée par un dosage immuno spécifique lié à une enzyme anti-protéine (ELISA). Les premiers marqueurs protéiques tels utilisées étaient immunoglobuline de lapin (IgG) et le poulet IgG / 9,10 IgY. Ils se sont révélés être des marques très efficaces pour MRR et de la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion). Malheureusement, les protéines IgG / IgY sont coûteux et ne sont donc pas pratique pour la recherche marque-capture et la plupart des types de recherche auto-marquage-capture. Par la suite, les tests ELISA de détection de la protéine de deuxième génération ont été développés pour des protéines contenues dans les blancs d'oeufs de poulet (albumine), le lait de vache (la caséine) et du lait de soja (protéine inhibitrice de la trypsine). Chaque essai est très sensible, spécifique et, plusSurtout, utilise des protéines qui sont beaucoup moins chers que les protéines IgG / 11 IgY. Ces protéines se sont avérés efficaces pour MRR, marque-capture, et la recherche de soi-marquage-capture (voir la discussion).
Dans cet article, nous décrivons et montrons comment réaliser des études de rétention de laboratoire protéines de marque. Ces études sont la première phase de la recherche nécessaire pour tout type d'étude champ de dispersion. Plus précisément, il est essentiel que les enquêteurs savent combien de temps la marque sera conservée sur les espèces d'arthropodes ciblés avant d'entreprendre des études champ de dispersion. Ici, nous décrire et démontrer comment marquer interne et externe des insectes pour MRR, marque de capture, et des études de terrain de type auto-marquage-capture. Nous démontrons comment pour détecter la présence des marques avec ELISA indirects et sandwichs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mark interne, rétention, et de la procédure de détection
- Procédure de marquage interne
- Recueillir les insectes d'intérêt (n ≈ 100 personnes) à partir d'une colonie de laboratoire élevés sur une alimentation artificielle ou sur le terrain et la diviser en deux récipients d'élevage propres.
- Placez un paquet régulière de 20 ml de régime (traitement banalisée de contrôle négatif) dans l'un des conteneurs. Compléter un deuxième paquet de 20 ml alimentation artificielle avec 1,0 ml d'une / ml d'IgG de poulet solution à 1,0 mg / IgY, bien mélanger, et le placer dans l'autre conteneur.
Remarque: Si l'insecte d'intérêt n'a pas une alimentation artificielle, la marque peut être placée sur ou dans quelque régime qu'ils sont normalement maintenus sur (par exemple, haricot vert, œufs de papillons nocturnes, de l'eau, le sucre, le miel). - Laisser les insectes reprennent leur activité d'alimentation pour 24 h.
- Marque interne rétention procédure
- Retirez les paquets de régime de chaque conteneur et de fournir les insectes with autre source de nourriture pour les soutenir pendant la durée de l'expérience (par exemple, des haricots verts).
- Recueillir une cohorte (n = 20) des insectes par jour (ou à tout intervalle de temps désiré) de chaque traitement et congeler immédiatement à -20 ° C.
- Sandwich procédure ELISA
- Ajouter 50 pi de lapin anti-poulet IgY anticorps primaire dilué 1: 500 dans du Tris solution saline tamponnée (TBS) à chaque puits d'une microplaque ELISA propre et incuber pendant un minimum de 1 heure à température ambiante (note: les microplaques peut aussi être incubées O / N à 4 ° C).
- Jeter l'anticorps de la plaque et bloquer chaque puits avec 300 pi d'une solution de lait en poudre 1,0% non gras pendant 30 min.
- En attendant que les étapes d'incubation précédentes, placer des insectes congelés individuellement dans 1,6 ml microtubes avec 1,0 ml de TBS.
- Broyer chaque insecte avec un pilon propre jusqu'à homogénéise et ajouter 100 pi de chaque échantillon à un puits individuel de l'ELISAassiette. Laisser les échantillons incuber à température ambiante pendant 1 h.
- Ajouter 100 pi de négatif (SCT seulement) et positifs (les blancs d'œufs en TBS) des contrôles aux puits dans la première colonne de chaque plaque ELISA. En outre, ajouter 100 pi de contrôles négatifs d'insectes (insectes non marqués) pour les 8 puits dans la dernière colonne de chaque plaque (Figure 1). Laisser les échantillons témoins à incuber à température ambiante pendant 1 heure. Notez que le modèle fourni à la figure 1 est le modèle que nous utilisons pour nos tests standardisés. Le placement des échantillons dans les puits est à la discrétion du chercheur.
- Laver chaque puits trois fois avec du tampon phosphate salin (PBS) et ensuite -tween ajouter 50 ul d'IgG de lapin anti-poulet / IgY conjugué peroxydase de raifort dilué à 1: 10000 en solution à 1% de lait et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween et ajouter 50 pi de tétraméthylbenzidine (TMB) à chaque puits.
- Après 10 minutes, lire les puitsavec un spectrophotomètre de microplaque réglé à une longueur d'onde de 650 nm.
Figure 1. Un schéma montrant les désignations ainsi standardisés utilisés pour un type 96 puits ELISA microplaques. Chaque plaque contient 7 puits réservés aux salins tamponnée au Tris contrôles négatifs (SCT), un puits dédiés à un contrôle de la protéine positive (Pos Ctrl), 80 puits individuels réservés aux insectes recapturés (exemples 1 ... 80), et 8 puits réservés aux non marquées (négatifs) des contrôles d'insectes (Neg Ctrl 1 ... 8). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Mark externe, de rétention, et de la procédure de détection
- Procédure de marquage externe
- Recueillir les insectes d'intérêt (n ≈ 100individus) à partir d'une colonie de laboratoire ou sur le terrain et le lieu dans deux récipients en matière plastique de 1,0 L avec un trou de 2,5 cm de diamètre percé de chaque côté du récipient.
- Vaporiser les insectes dans le premier récipient avec 1,0 ml de dH 2 O (traitement témoin négatif) en utilisant un nébuliseur médical. Vaporiser les insectes dans le second récipient avec 1,0 ml d'une solution à 5,0% de blancs d'oeuf de poule en utilisant un nébuliseur médical.
- Fixer le tuyau du nébuliseur à une prise d'air de laboratoire standard et insérez ensuite la bouche du nébuliseur dans le trou de 2,5 cm du conteneur. Ensuite, tournez sur la sortie d'air progressivement jusqu'à ce que le nébuliseur produit une vapeur.
- Continuer la pulvérisation (marquage) jusqu'à ce que la solution de blancs d'oeufs a été distribuée (env. 2-5 min).
- Retirer le nébuliseur et placer un bouchon dans l'orifice du récipient en plastique. Permettre aux insectes de se tenir à la température ambiante jusqu'à ce que la solution ait complètement séché.
- Marque extérieure rétention procédure
- Placez chaque traitement des insectes sec dans un récipient d'élevage propre et séparée pour éviter toute exposition à la marque.
- Ajouter nourriture et d'eau pour les récipients propres pour soutenir les insectes sur la durée de l'étude.
- Recueillir une cohorte (n = 20) des insectes de chaque traitement quotidien et congeler immédiatement à -20 ° C.
- Procédure ELISA indirect
- Placez les insectes congelés individuellement dans 1,6 ml microtubes et ajouter 1,0 ml de TBS.
- Faire tremper les échantillons pendant 1 heure sur un ensemble de agitation à 120 rpm.
- Ajouter témoins négatifs et positifs comme décrit dans l'étape 1.3.5.
- Après le trempage, la pipette une partie aliquote de 100 pi de chaque échantillon dans l'un des 80 puits d'échantillons désignés sur un nouveau puits plaque de 96 ELISA comme le montre la figure 1 Laisser les échantillons incuber pendant 1 heure à température ambiante (note:. Les microplaques peut aussi être O incubé / N à 4 ° C).
- Laver les puits trois fois avecPBS-Tween, puis ajouter 300 ul de solution saline tamponnée au phosphate contenant 1% d'albumine de sérum bovin (PBS-BSA) dans chaque puits.
- Après 30 min à température ambiante laver deux fois avec du PBS-Tween.
- Ajouter 50 ul d'anticorps de lapin anti-albumine d'oeuf anticorps primaire dilué 1: 8000 dans du PBS-BSA-Silwet (0,05%) dans chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween, puis ajouter 50 ul d'anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à la peroxydase de raifort dilué à 1: 2000 dans du PBS-BSA-Silwet (0,05%) pendant 1 heure à température ambiante.
- Laver chaque puits trois fois avec du PBS-Tween et ajouter 50 ul de substrat TMB à chaque puits.
- Après 10 minutes, lire les puits avec un spectrophotomètre de microplaque réglé à une longueur d'onde de 650 nm.
Analyse des données 3.
- Calculer la valeur moyenne de l'absorbance des 8 insectes de contrôle négatif sur chaque plaque ELISA puis calculer l'écart type sur la base des contrôles négatifs communs from toutes les plaques ELISA d'une étude donnée 12.
- Ajouter six fois l'écart-type commun à la moyenne obtenue pour chaque plaque ELISA pour obtenir une valeur de seuil positif ELISA. Tout échantillon insectes produisant une valeur d'absorbance égale ou supérieure à cette valeur est considérée comme positive pour la présence de la marque en protéines.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Marquage interne:
Les résultats de l'essai marque de rétention interne sont présentés dans la figure 2A. La valeur de seuil critique calculée ELISA était de 0,054. Dans l'ensemble (tous les quatre dates d'échantillons combinés), les insectes traités sans protéines ont donné des valeurs uniformément faibles ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Inversement, tous les insectes nourris la diète protéinée enrichie constamment donné des valeurs fortes ELISA (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).
Marquage extérieur:
Les résultats de l'essai marque de rétention externe sont présentés dans la figure 2B. La valeur de seuil critique calculée ELISA était 0,082. Dans l'ensemble, les insectes topique marqués avec seulement de l'eau ont donné constamment faible ELILes valeurs de SA (x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Inversement, tous les insectes topique marqués avec la solution de blancs d'œufs ont donné des valeurs constamment fortes ELISA (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).
Figure 2. Moyenne (± SD) ELISA valeurs de densité optique de (A) insectes marqués intérieurement avec IgY de poulet et (b) les insectes marqués à l'extérieur avec des blancs d'œuf de poule (albumine). Des barres noires sont les valeurs moyenne ± ELISA de densité optique produites par insectes non marquées. Taille de l'échantillon des insectes pour chaque traitement quotidien en protéines était de 20 individus. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La procédure d'immuno-marquage des protéines arthropode a été décrite pour la première près d'un quart de siècle 9. Depuis lors, la procédure a été adaptée pour étudier les modes de dispersion d'une grande variété d'arthropodes en utilisant IgG / IgY fois interne et externe administrés. Ces protéines se sont avérées marqueurs fermes pour la grande variété d'espèces d'insectes testées jusqu'à présent. Cependant, comme mentionné ci-dessus, la principale limitation à l'utilisation IgG / IgY est qu'ils sont très coûteux. Par conséquent, IgG / IgY ne sont utiles que pour MRR et des études de type auto-marquage où de grands lots d'insectes peuvent être marqués dans un petit espace ou les marques peuvent être incorporés dans un régime alimentaire ou appât. Ici, nous avons fourni une démonstration simple de la façon dont une marque interne peut être administré en alimentant la cible insecte une alimentation artificielle enrichie en IgG de poulet / AGI. À son tour, l'IgG / IgY a été détectée en utilisant un ELISA en sandwich. Ce système pourrait être particulièrement avantageux pour les chercheurs qui utilisent déjà unrégime qui contient des oeufs de poulet depuis le dosage sera naturellement détecter l'IgG / IgY trouve dans les œufs. En outre, de petites quantités de protéine IgG / IgY peuvent être administrés par voie topique à l'aide du nébuliseur insectes médical décrit ci-dessus (figure 3A). Un nébuliseur a été d'abord utilisé pour les parasitoïdes marque de masse très délicates et minuscules avec des IgG de lapin pour le type de MRR recherche 3. Depuis, d'autres méthodes ont été utilisées pour administrer marques IgG / IgY pour les arthropodes pour la recherche de la dispersion. Par exemple, un atomiseur de parfum a été utilisé pour appliquer des marques IgG / IgY sur d'autres espèces de parasitoïdes 13,14. D'autres ont marqué l'interne divers insectes en les nourrissant (auto-marquage) IgG de lapin marqué miel 14,15 ou d'eau sucrée 16 (figure 3B). Enfin, Baker et al. 7 alimenté en carton pour les termites qui est imprégné d'IgG de lapin (Figure 3C). Ces termites facilement auto-marqués comme ils ont ingéré de la nourriture appâtédes truc.
Figure 3. Diverses méthodes utilisées pour administrer une marque de protéines: (A) parasitoïdes délicates étant marqués avec IgY de poulet en utilisant un nébuliseur médical, (B) un parasitoïde se nourrissant de solution de miel IgG enrichi lapin, (C) termites alimentation sur un carton d'IgG enrichi lapin appâts, (D) les abeilles auto-marquage avec du lait sec car ils passent par un dispositif de dépoussiérage placé à l'entrée d'une ruche, (E) les insectes indigènes étant marquées avec du lait dans un champ de coton en utilisant une plate-forme tracteur de pulvérisation classique, (F ) insectes indigènes étant marqués avec les blancs d'œufs de poulet avec un dispositif de flèche et la buse de pulvérisation monté sur un VTT, (G) insectes indigènes dans une bande de luzerne étant marqué avec les blancs d'œufs de poulet avec un dosdispositif de pulvérisation de meute, et (H, I) insectes indigènes dans la luzerne étant marqués avec les blancs d'œufs de poulet en utilisant les applicateurs aériens. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Protéines IgG / IgY ont non seulement été utilisée pour étudier la dispersion des insectes. Ils ont également été utilisés pour le suivi des liens trophiques dans la chaîne alimentaire des arthropodes. Hagler et Durand 17 d'abord proposé le concept de proie avec IgG / IgY marquage et, à son tour, la conduite d'une teneur en sandwich intestin IgG / IgY-ELISA spécifique sur les prédateurs qui consomment la proie marquée. Cette technique a récemment gagné en popularité parmi les chercheurs d'analyse de l'intestin, car il est plus facile et moins coûteux que la réalisation ELISA ou chaîne de polymérase proie spécifique (PCR) de type analyses de contenu de l'intestin moléculaires (voir Hagler 18 et Fournier et al. 19 pour les examens de epros e et les inconvénients des différentes techniques d'analyse de l'intestin). Dans la dernière décennie, la technique immuno-marquage de proie a été utilisé pour identifier l'activité d'alimentation des prédateurs du coton sur IgG de lapin marqué ravageurs 18,20,21, trophallaxie et relations alimentaires dans les colonies de termites en utilisant une IgG de lapin-traitée source de nourriture de papier 22, prédation des graines d'un assemblage d'arthropodes sur les graines de mauvaises herbes de pissenlit envahissantes marqués d'IgG de lapin 23, pentatome taux de prédation sur sphinx de la tomate IgG marqués recueillies dans les parcelles soumises à divers traitements semiochimiques 24 et prédateur activité de piégeage sur la charogne IgG / IgY marqué 25.
Une deuxième génération de détection de protéines ELISA indirects ont été développés il ya presque une décennie. Ces tests ELISA ont été conçus spécifiquement pour détecter les protéines contenues dans les produits "hors-la-étagère" alimentaires, tels que les protéines d'albumine d'oeuf dans les blancs d'œufs de poulet, protéine de soja de l'inhibiteur de trypsine dans du lait de soja, de caséine et de protéinesdans le lait bovin. Les immunomarqueurs de protéines de deuxième génération se sont révélés utiles pour MRR, marque de capture et d'auto-marque de la recherche. Par exemple, Irvin et al. 26 ont montré qu'il était possible de marquer topique parasitoïdes délicates avec ces protéines off-the-shelf. En outre, Hagler et al. 8,27 montré que les abeilles peuvent auto-marque avec le blanc d'œuf et de lait bovin poudres sèches à leur sortie à travers un distributeur de protéines placé à l'entrée d'une ruche (Figure 3D). Peut-être l'utilisation la plus créative de la protéine marquage consisté à cibler les bouses aux blancs d'œufs à l'aide d'un pulvérisateur à jet 28. À leur tour, les adultes de mouches du visage acquis une auto-marque comme ils ont émergé de leur stade de pupe et sortit de la pat de la vache.
La caractéristique la plus importante des immunomarqueurs de protéines de deuxième génération est qu'ils sont facilement disponibles en grandes quantités et à une fraction du coût des protéines IgG / IgY 11. Cette fonctionnalité a revolutionized la façon dont la recherche est menée de marque de type de capture à l'échelle régionale. Plus précisément, les enquêteurs ont maintenant une méthode fiable pour rapidement et uniformément tag arthropodes sur de vastes étendues dans le domaine de l'aide d'une grande variété d'équipements de pulvérisation de forage conventionnel (figure 3E). Par exemple, les insectes nuisibles ont été marqués directement dans les vergers et les champs à l'aide de pistolet portable pulvérisateurs de type 29,30, pulvérisateurs à jet porté conduit des tracteurs et pulvérisateurs 31,32, de débardage 33. Horton et al. 34 utilise un dispositif de pulvérisation électrique monté sur un véhicule tout-terrain pour identifier les applications de blancs d'œufs à insectes occupant cultures de couverture embarqués dans un verger de poiriers (figure 3F). De même, Swezey et al. 5,35 utilisé un pulvérisateur à dos pour appliquer des applications précises de blancs d'oeufs de poulet à des rangées d'une culture de la luzerne piège (une plante hôte préférée) incorporé dans un champ de fraises de culture biologique pour marquer un ravageur et ses ennemis naturels (
Certains utilisateurs de la procédure de marquage-capture de la deuxième génération ont modifié la procédure initiale peu pour répondre à leurs besoins de recherche spécifiques. Le type de corps et la taille de til cible les insectes, avec ses caractéristiques comportementales, va dicter le volume et la concentration de la marque nécessaire et comment la marque est administré 37. En outre, la méthode utilisée pour récupérer les insectes dans le domaine sera subordonnée à ces facteurs. À ce jour, presque chaque méthode utilisée (par exemple, les pièges collants, des filets de balayage, aspirateurs) pour recueillir les insectes a été utilisée avec succès pour recueillir des insectes marqués 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Toutefois, en raison des sensibilités extrêmes des tests ELISA de détection de protéines, nous soulignons que le plus grand soin doit être pris pour assurer que les spécimens non marquées ne soient pas contaminés pendant les processus de collecte ou de tri 38.
L'étude originale 11 qui décrit la deuxième génération de systèmes de marquage de protéines (par exemple, l'albumine d'oeuf, la caséine du lait, et l'inhibiteur de trypsine de soja) a rapporté les facteurs affectant la sensibilité du test peut varier entre les types de marqueurs. Plus précisément, ils ont montré que difsources diffé- d'eau, des additifs (tensioactifs), et même le type de plaque ELISA utilisé affectés (positivement ou négativement) l'essai. En outre, cette étude et des études ultérieures ont montré que les 37,39,40 tests de détection de marque de trois protéines varient en efficacité. Le marqueur de blanc d'oeuf a été maintenu plus longtemps que le marqueur de lait, qui a été maintenu plus longtemps que marqueur de lait de soja. Ces résultats soulignent l'importance de la protéine d'essai marque rétention sur tout insecte donné avant de se lancer dans la recherche de terrain. En outre, ces tests ELISA indirects deuxième génération montrent parfois un niveau de bruit de fond avec certains types d'insectes (par exemple, les herbivores) (pers. Obs) faible. Ce bruit de fond peut être réduite par addition de 100 ul de peroxyde d'hydrogène à chaque puits de la plaque ELISA pendant 30 minutes entre l'étape et l'étape 2.3.5 2.3.4 dans le protocole ci-dessus (données non publiées)..
Il convient de noter que les tests ELISA indirecte utilisé pour détecter les marques de protéines de deuxième générationsont très efficaces pour la détection de la protéine d'insectes trempées dans le tampon d'échantillon. Cependant, les tests ELISA indirects ne sont pas aussi efficaces que le sandwich ELISA pour détecter les traces de protéines internes ou des protéines proies sur les insectes. Des études ont montré que les tests ELISA indirects ne sont pas aussi efficaces que les tests ELISA sandwich à détecter la protéine dans des échantillons d'insectes homogénéisés 34,41.
Un facteur important à considérer avec toute ELISA est que la procédure montre souvent plaque-plaque (attribuée principalement à des effets de jour en jour de l'exécution d'un test) la variabilité 42,43. Par conséquent, il est essentiel que chaque plaque ELISA comprend: (1) un ou plusieurs SCT contrôles que négatifs, (2) un ou plusieurs SCT + commandes positives de protéines pures, et (3) au moins huit témoins négatifs d'insectes (ie, des individus connus ne pas contenir une marque de protéines). Le SCT seulement, protéines TBS +, et les contrôles négatifs insectes assurent que la mémoire tampon ne sont pas une source d'erreur, les réactifs fonctionnent correctement, unnd qu'il n'y a pas toutes les protéines dans l'insecte qui traversent réagir avec les réactifs ELISA, respectivement. En outre, les contrôles négatifs insectes sont indispensables pour calculer les valeurs de seuil ELISA (voir ci-dessous). La conception de la plaque représentée à cette manifestation comprenait 7 ébauches de SCT, 1 protéines + contrôle positif SCT (dans la première colonne) et huit contrôles négatifs (dans la dernière colonne) sur chaque plaque ELISA (Figure 1).
Un autre facteur important à considérer lors de la manipulation des données ELISA est de déterminer une valeur de seuil de marquer un insecte pour la présence ou l'absence d'une marque de protéines. La méthode proposée initialement par Stimmann 44 pour marquer les insectes de rubidium-marquée a été défini comme le niveau moyen de marqueur dans une piscine d'insectes non marquées et trois fois l'écart type des individus non marquées. Ce procédé a également été utilisé en tant que procédé classique pour avoir les insectes pour la présence de traces de protéines 9,17. Toutefois, dans certains CASes, les chercheurs ont sélectionné intuitivement plusieurs valeurs de seuil conservateurs pour réduire la probabilité d'obtenir des faux positifs. La méthode la plus simple est de simplement ajouter quatre à six écarts-types de la moyenne des contrôles négatifs au lieu de trois 18,34. Une méthode plus sophistiquée pour réduire davantage la possibilité d'obtenir des faux positifs a été proposé par Sivakoff et al. 12. Cette méthode consiste à calculer la valeur moyenne de l'absorbance des huit insectes de contrôle négatif sur chaque plaque ELISA, puis en calculant l'écart-type sur la base des contrôles négatifs rassemblées à partir de toutes les plaques ELISA d'une étude donnée.
En résumé, une méthode fiable pour marquer arthropodes est essentiel à la réussite de la plupart des études de dispersion. Diverses méthodes ont été utilisées pour marquer les arthropodes avec des protéines au cours des deux dernières décennies. Immunomarquage des protéines et la détection des marques sont relativement faciles et peu coûteux et très adaptable à une myriade de ses études. Les futurs utilisateurs de la technique d'immuno-marquage devraient veiller à ce que leur méthodologie est adaptée aux spécificités de leur recherche. La concentration et le volume de la marque nécessaire et comment la marque est appliquée dépendra de facteurs comme le comportement, le type de carrosserie et la taille des espèces cibles 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
La mention de marques de commerce ou de produits commerciaux dans la présente publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et ne signifie pas qu'ils sont approuvés par le ministère américain de l'Agriculture. L'USDA est un fournisseur de l'égalité des chances et de l'employeur.
Acknowledgments
Le financement a été fourni par l'USDA CRIS 5347-22620-021-00D et, en partie, par l'Agriculture and Food Research Initiative concurrentiel Subvention pas. 2011-67009-30141 de l'Institut national de l'alimentation et de l'agriculture USDA. Nous sommes reconnaissants de l'appui technique de Johanna Nassif. Nous remercions également Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, et Frances Sivakoff pour fournir certains des images utilisées dans la figure 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
- Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
- Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
- Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
- Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
- Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
- Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
- Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
- Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
- Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
- Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
- Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
- Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
- Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
- Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
- Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
- Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
- Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
- Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
- Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
- Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
- Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
- Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
- Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
- Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
- Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).
