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Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

Überwachung Arthropoden Bewegung ist oft erforderlich, um damit verbundenen Bevölkerungsdynamik, Verbreitungsmuster, Wirtspflanze Vorlieben, und andere ökologische Wechselwirkungen besser zu verstehen. Arthropoden sind in der Regel in der Natur durch Markieren sie mit einer einzigartigen Signatur verfolgt und dann neu zu sammeln sie über Zeit und Raum, um ihre Ausbreitung Fähigkeiten zu bestimmen. Neben der tatsächlichen physikalischen Tags, wie farbige Staub oder Farbe wurden verschiedene Arten von Proteinen sehr wirksam für die Kennzeichnung von Arthropoden für ökologische Forschung bewährt. Proteine ​​können intern und / oder extern verabreicht werden. Die Proteine ​​können dann wieder eingefangen Arthropoden mit einem Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen werden. Hier beschreiben wir Protokolle für außen und innen Tagging Arthropoden mit Protein. Zwei einfache experimentellen Beispiele werden gezeigt: (1), um ein Insekt durch die Bereitstellung eines Protein-angereicherte Ernährung und (2) eine externe Protein Zeichen topisch a eingeführt eine interne Proteinzeichenum ein Insekt mit einem medizinischen Vernebler ngewandte. Wir beziehen dann eine Schritt-für-Schritt-Anleitung des Sandwich und indirekt verwendet werden, um Proteinmarkierungen auf den Insekten erkennen ELISA-Verfahren. In dieser Demonstration werden verschiedene Aspekte der Akquisition und den Nachweis von Protein-Marker auf Arthropoden für Mark-Release-Wiederfang, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Arten der Forschung diskutiert, zusammen mit den verschiedenen Möglichkeiten, die immunomarking Verfahren wurde angepasst ist, eine Vielzahl von Forschungszielen entsprechen.

Introduction

Verfolgen der Bewegung von tierischen Schädlingen, natürliche Feinde (Parasitoide und Raubtiere) und Bestäuber in der Natur ist für ein besseres Verständnis, wie man wesentliche Ökosystemdienstleistungen zu verbessern. Die Schlüsselkomponente für die meisten Arten von Ausbreitungs Forschung ist eine zuverlässige Methode, um die Arthropoden (en) von Interesse zu markieren. Eine Vielzahl von Materialien (zB Lacke, Farben, farbig Stäube, Tags, seltenen Elementen, Proteine) verwendet worden, um Arthropoden markieren, ihre Populationsdynamik, Ausbreitung Fähigkeiten zu beurteilen, Fütterung Verhalten und anderen ökologischen Interaktionen 1,2.

Die Zweckmäßigkeit einer Markierung für eine gegebene Ausbreitungs Forschung verwendet werden abhängig von der Art der Untersuchung, die durchgeführt werden. Es gibt drei große Kategorisierungen für die Kennzeichnung von Arthropoden: (1) Mark-Release-Wiederfang (MRR), (2) Mark-Erfassung, und (3) Eigenmarke-Capture. Für Mark-Release-Rückeroberung der Forschung, der Ermittler kennzeichnet typischerweise die Arthropoden kollektiv in der Laboratory und gibt sie an einer zentralen Stelle im Feld. Die Arthropoden werden dann auf verschiedenen räumlichen und zeitlichen Abständen unter Verwendung verschiedener Erfassungsgeräte (zB Sweep net, Vakuum, klebrigen Falle) 3,4,5 zurückerobert. Die zurückerobert Proben werden dann untersucht, für die spezifische Markierung von nativen Personen veröffentlicht zu unterscheiden. Für Mark-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel die Markierung direkt im Feld mit Spritzgeräten (zB Rückenspritze, boom und Düsenspritze). Die besten Marker für die Mark-Capture-Forschung sind kostengünstig und einfach an den Arthropoden Lebensraum aufgebracht. Für Eigenmarke-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel Noten zu einem Arthropoden Köder 6,7 oder Nesteingang 8. Im Gegenzug, die Arthropoden kennzeichnet sich intern durch verschlingt die markierte Köder oder extern durch "Bürsten" gegen die Marke, wie es das Nest verlässt.

Wie oben erwähnt, sind viele Arten von Markierungen uns gewesened, um eine Vielzahl von Arthropoden-Arten zu taggen. Aber nur sehr wenige sind nützlich für alle drei dieser Zerstreuung Forschungskategorien. Die Entwicklung des Proteins immunomarking Verfahren war ein großer Durchbruch zur Markierung Insekten. Immunomarking stellt ein Protein Etikett auf Arthropoden entweder intern oder extern, was wiederum, wird von einem Anti-Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen. Die erste derartige Protein-Marker verwendet wurden Kaninchen-Immunglobulin (IgG) und Huhn IgG / IgY 9,10. Sie erwiesen sich als sehr wirksam Markierungen für MRR und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) sein. Leider sind die IgG / IgY Proteine ​​kostspielig und daher nicht praktisch für die Mark-Capture-Forschung und die meisten Arten von Eigenmarke-Capture-Forschung. Anschließend wurden der zweiten Generation Proteinnachweis ELISAs für Proteine ​​in Hühner Eiweiß (Albumin), Kuhmilch (Casein) und Soja-Milch (Trypsin-Inhibitor-Protein) enthalten entwickelt. Jeder Test ist sehr empfindlich, spezifisch und am meistenwichtiger ist, verwendet Proteinen, die viel weniger teuer als die IgG / IgY-Proteine ​​sind 11. Diese Proteine ​​wurden effektiv für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) bewährt.

In diesem Artikel beschreiben wir, und zeigen, wie die Proteinmarkierung Labor Retention Studien durchzuführen. Solche Studien sind die erste Phase der Forschung für jede Art von Feldausbreitung Studie erforderlich. Genauer gesagt, ist es entscheidend, dass die Ermittler wissen, wie lange die Marke wird über die gezielten Arthropodenarten vor dem Einschiffen auf Feldausbreitungsstudien beibehalten werden. Hier beschreiben wir, und zeigen, wie man nach innen und außen zu markieren Insekten für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Aufnahmeart Feldstudien. Wir haben uns dann zeigen, wie man die Anwesenheit der Markierungen mit indirekter und Sandwich ELISAs zu erkennen.

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Protocol

1. Interne Mark, Retention und Nachweisverfahren

  1. Interner Markierungsverfahren
    1. Sammeln von Insekten von Interesse (n ≈ 100 Personen) von einer Laborkolonie auf einer künstlichen Ernährung oder aus dem Bereich aufgezogen und teilen sich in zwei saubere Aufzuchtbehältern.
    2. Legen Sie einen regelmäßigen 20 ml Diät-Paket (nicht markierten negativen Kontrollbehandlung) in einem der Behälter. Ergänzen eine zweite 20 ml künstliche Ernährung Paket mit 1,0 ml einer 1,0 mg / ml Huhn IgG / IgY Lösung, mischen Sie gründlich, und legen Sie sie in den anderen Behälter.
      Hinweis: Wenn das Insekt von Interesse nicht über eine künstliche Ernährung kann die Markierung auf oder in irgendeiner Diät sind sie in der Regel auf (zB, grüne Bohnen, Motteneier, Wasser, Zucker, Honig) anhalt platziert werden.
    3. Lassen Sie die Insekten, um ihre Fraßaktivität 24 Stunden lang fortgesetzt.
  2. Interne Zeichen Retentionsverfahren
    1. Entfernen Sie die Diät-Pakete von jedem Behälter und liefern die Insekten with weiteren Nahrungsquelle, um sie über die Dauer des Experiments (zB grünen Bohnen) stützen.
    2. Sammeln eine Kohorte (n = 20) von Insekten täglich (oder in jedem gewünschten Zeitintervall) von jeder Behandlung und gefrier sofort bei -20 ° C.
  3. Sandwich-ELISA-Verfahren
    1. Zugabe von 50 & mgr; l von Kaninchen-Anti-Huhn-IgY primären Antikörper, verdünnt 1: 500 in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) in jede Vertiefung einer sauberen ELISA Mikrotiterplatten und Inkubieren für mindestens 1 h bei RT (Anmerkung: Die Mikrotiterplatten können inkubiert werden O / N bei 4 ° C).
    2. Entsorgen Sie die Antikörper von der Platte und blockieren jede Vertiefung mit 300 ul einer 1,0% fettfreie Trockenmilch-Lösung für 30 min.
    3. Während des Wartens auf den vorherigen Inkubationsschritte, legen froren Insekten einzeln in 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,0 ml TBS.
    4. Mahlen jedes Insekt mit einem sauberen Stößel, bis sie gründlich homogenisiert und fügen Sie eine 100 ul jeder Probe auf eine individuelle Vertiefung der ELISAPlatte. Man lässt die Proben bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
    5. 100 l negativ (nur TBS) und positive (Eiweiß in TBS) Kontrollen in die Vertiefungen in der ersten Spalte jeder ELISA-Platte. Fügen Sie außerdem 100 ul negativen Insekten Kontrollen (nicht markierten Insekten) an die 8 Vertiefungen in der letzten Spalte jeder Platte (Abbildung 1). Lassen Sie die Kontrollproben bei RT für 1 h inkubiert. Beachten Sie, dass die Vorlage in der 1 vorgesehen ist die Vorlage, die wir für unsere standardisierten Tests. Die Plazierung der Proben in den Wells ist im Ermessen des Forschers.
    6. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -tween und fügen Sie dann 50 ul Kaninchen-anti-Huhn IgG / IgY konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1: 10.000 in 1% Milchlösung und Inkubation für 1 h bei RT.
    7. Dreimal mit PBS-Tween waschen jede Vertiefung geben und fügen Sie 50 ul Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat in jede Vertiefung.
    8. Nach 10 Minuten, lesen Sie die Vertiefungenmit einem Mikroplatten-Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm eingestellt.

Abbildung 1
Abbildung 1 eine schematische Darstellung der standardisierten auch Bezeichnungen für ein typisches 96 verwendet ELISA Mikroplatten. Jede Platte enthält 7 Brunnen Tris-gepufferte Kochsalzlösung negative Kontrollen gewidmet (TBS), ein gut zu einer positiven Proteinsteuerung (Pos Ctrl) gewidmet, 80 Einzelbecken zur erobert Insekten (Probe 1 ... 80) und 8 Vertiefungen, um nicht markierte (negativ) Insekten Kontrollen gewidmet (Neg Ctrl 1 ... 8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Externe Mark, Retention und Nachweisverfahren

  1. Äußere Kennzeichnung Verfahren
    1. Sammeln von Insekten von Interesse (n ≈ 100Einzelpersonen) aus einem Labor-Kolonie oder vom Feld und Ort in zwei 1,0 l Kunststoffbehälter mit einem Loch mit einem Durchmesser von 2,5 cm ausgestanzt aus der Seite eines jeden Containers.
    2. Sprühen die Insekten in den ersten Behälter mit 1,0 ml dH 2 O (negative Kontrollbehandlung) unter Verwendung einer medizinischen Zerstäuber. Sprühen die Insekten in den zweiten Behälter mit 1,0 ml einer 5,0% igen Lösung von Hühnereiweiß Verwendung eines medizinischen Zerstäuber.
    3. Befestigen Sie den Schlauch des Verneblers zu einem Standard-Labor Luftauslass und dann die Öffnung des Zerstäubers in die 2,5 cm Loch des Behälters einzufügen. Schalten Sie dann den Luftaustritt nach und nach, bis der Vernebler erzeugt einen Dampf.
    4. Weiter Spritzen (Kennzeichnung), bis das Eiweiß-Lösung abgegeben worden ist (ca. 2-5 min).
    5. Entfernen Sie den Vernebler und legen Sie einen Korken in das Loch des Kunststoffbehälters. Lassen Sie die Insekten bei RT stehen, bis die Lösung vollständig getrocknet ist.
  2. Externe Marke Retentionsverfahren
    1. Platzieren Sie jede Behandlung der trockenen Insekten in einem separaten sauberen Aufzuchtbehälter, um weitere Exposition zur Marke zu vermeiden.
    2. Nahrung und Wasser hinzufügen, um die saubere Behälter, um die Insekten über die Dauer der Studie erhalten.
    3. Sammeln Sie eine Kohorte (n = 20) von Insekten aus jeder Behandlungs täglich und frieren sofort bei -20 ° C.
  3. Indirekte ELISA-Verfahren
    1. Legen Sie die gefrorenen Insekten einzeln in 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 1,0 ml TBS.
    2. Weichen Sie die Proben für 1 Stunde auf einem Orbitalschüttler Satz bei 120 UpM.
    3. Fügen Sie negative und positive Kontrollen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    4. Nach dem Einweichen, Pipette 100 ul Aliquot von jeder Probe in eine der mit 80 bezeichnet Probenvertiefungen auf einem neuen 96-Napf-ELISA-Platte, wie in Figur 1 gezeigt lässt die Proben für 1 Stunde bei RT inkubiert. (Anmerkung: Die Mikroplatten kann auch inkubiert O / N bei 4 ° C).
    5. Dreimal mit Waschen Sie die VertiefungenPBS-Tween gewaschen und dann werden 300 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 1% Rinderserumalbumin (PBS-BSA) in jede Vertiefung.
    6. Nach 30 min bei RT waschen zweimal mit PBS-Tween.
    7. In 50 ul Kaninchen-Anti-Eieralbumin primäre Antikörper verdünnt 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) in jede Vertiefung und Inkubation für 1 h bei RT.
    8. Dreimal mit PBS-Tween waschen jeder Vertiefung gegeben und dann werden 50 & mgr; l Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist, verdünnt 1: 1 h bei RT 2.000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%).
    9. Dreimal mit PBS-Tween waschen jede Vertiefung geben und fügen Sie 50 ul TMB Substrat in jede Vertiefung.
    10. Nach 10 Minuten, lesen Sie die Vertiefungen mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 650 nm eingestellt.

3. Datenanalyse

  1. Berechnen Sie die mittlere Absorptionswert der 8 negative Kontrolle Insekten auf jeden ELISA-Platte und dann die Berechnung der Standardabweichung auf Basis der gepoolten negativen Kontrollen herm all den ELISA-Platten einer gegebenen Studie 12.
  2. In sechs Mal die gepoolte Standardabweichung zu dem für jeden ELISA-Platte, um einen ELISA positiven Schwellenwert zu erhalten, erhalten Mittelwert. Jede Insekten Probe ergab einen Absorptionswert gleich oder größer als dieser Wert wird als positiv für die Gegenwart des Proteins Zeichen sein.

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Representative Results

Interne Kennzeichnung:

Die Ergebnisse der internen Zeichen Retentionstest sind in 2A gezeigt. Die berechnete ELISA kritischen Schwellenwert war 0,054. Insgesamt (alle vier Probendaten kombiniert), die ohne Protein behandelten Insekten ergab konstant niedrig ELISA-Werte (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Umgekehrt werden alle Insekten gefüttert das Protein angereicherte Ernährung lieferte konstant starke ELISA-Werte (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).

Äußere Kennzeichnung:

Die Ergebnisse der externen Zeichen Retentionstest sind in 2B gezeigt. Die berechnete ELISA kritischen Schwellenwert war 0,082. Insgesamt sind die Insekten topisch mit nur Wasser markiert ergab konstant niedrig ELISA-Werte (x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Umgekehrt werden alle Insekten topisch mit dem Eiweiß-Lösung markiert lieferte konstant starke ELISA-Werte (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).

Figur 2
Abbildung 2. Mittelwert (± SD) ELISA optische Dichtewerte (A) Insekten intern mit Huhn IgY und (B) Insekten extern mit Huhn Eiweiß (Albumin) markiert. Schwarze Balken werden die Mittelwert ± Standardabweichung ELISA Werte der optischen Dichte von ergab unmarkierte Insekten. Insektenstichprobengröße für jede tägliche Proteinbehandlung betrug 20 Personen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Arthropoden Protein immunomarking Verfahren wurde erstmals vor einem Jahrhundert 9 beschrieben, fast ein Viertel. Seitdem hat sich das Verfahren so angepasst, dass die Verbreitungsmuster von einer Vielzahl von Arthropoden mit intern und extern verabreicht IgG / IgYs studieren. Diese Proteine ​​wurden standhaft Marker für die große Vielzahl von bisher getesteten Insektenarten erwiesen. Wie oben erwähnt, ist die Haupteinschränkung für die Verwendung von IgG / IgYs ist jedoch, dass sie sehr teuer sind. Folglich sind IgG / IgYs nur für MRR und Selbstmarkierungstyp Studien, in denen große Chargen von Insekten können in einem kleinen Raum zu kennzeichnen oder die Noten in eine Diät oder Köder aufgenommen werden nützlich. Hier stellten wir ein einfaches Beispiel dafür, wie eine interne Markierung kann durch Zuführen der Zielinsekten eine künstliche Ernährung mit Huhn IgG / IgY bereichert verabreicht werden. Wiederum wurde die IgG / IgY Verwendung eines Sandwich-ELISA nachgewiesen. Dieses System könnte besonders vorteilhaft, Forscher, dass bereits eine seinDiät, die Hühnereier seit dem Test wird natürlich erkennen, die IgG / IgY in Eiern enthält. Zusätzlich können geringe Mengen an IgG / IgY-Protein topisch auf Insekten unter Verwendung des obigen (3A) beschriebenen medizinischen Zerstäubers verabreicht werden. Ein Zerstäuber wurde erstmals die Massenmarkierung sehr empfindlich und winzige Parasiten mit Kaninchen-IgG für MRR Typ Forschungs 3 verwendet. Seitdem wurden andere Verfahren verwendet worden, um IgG / IgY Marken zur Bekämpfung von Arthropoden zur Dispersion Forschungs verabreichen. Zum Beispiel hat ein Duftstoffzerstäuber verwendet worden, um IgG / IgY Markierungen an anderen Parasitoidenarten 13,14 anzuwenden. Andere haben intern durch Fütterung markiert verschiedene Insekten (dh Selbstkennzeichnung) Kaninchen-IgG-markierten Honig 14,15 und Zuckerwasser 16 (3B). Schließlich Baker et al. 7 zugeführten Karton Termiten, die mit Kaninchen-IgG (3C) imprägniert wurde. Diese Termiten ohne weiteres selbst markiert, da sie verschluckt den Köder Lebensmittelstopft.

Figur 3
Figur 3. Es sind verschiedene Verfahren verwendet werden, um ein Protein Zeichen zu verwalten: wobei (A) empfindliche Parasitoide mit Huhn IgY mit einem medizinischen Vernebler, (B) ein Parasitoid Fütterung auf Kaninchen-IgG-angereicherten Honiglösung, (C) Termiten ernähren sich von einem Kaninchen-IgG-angereicherten Karton markiert Köder, (D) Honigbienen Selbstmarkierung mit Trockenmilch, wie sie durch eine Bestäubungseinrichtung am Eingang eines Bienenstocks, (E) gelegt einheimische Insekten, die mit Milch in einem Baumwollfeld unter Verwendung eines herkömmlichen Traktors spray rig, markiert (F gehen ) einheimische Insekten mit Hühnereiweißweine mit einem Ausleger und Düsen Sprühvorrichtung auf ein ATV, (G) einheimische Insekten in einem Streifen von Luzerne montiert markiert mit Hühnereiweißweine mit einer Rück markiertPackung Sprühvorrichtung, und (H, I) einheimische Insekten in Luzerne mit Hühnereiweißweine mit Luft Applikatoren gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

IgG / IgY Proteine ​​nicht nur für das Studium Insekten Verbreitung verwendet. Sie haben auch für die Verfolgung von trophischen Links in der Arthropoden-Lebensmittelkette verwendet. Hagler und Durand 17 zum ersten Mal vorgeschlagen, das Konzept der Kennzeichnung Beute mit IgG / IgY und wiederum die Durchführung einer IgG / IgY spezifischen Sandwichdarminhalt ELISA auf Raubtiere, die die markierte Beute verzehrt. Diese Technik wurde vor kurzem an Popularität gewann unter Darmanalyse Forscher, weil es weniger mühsam und kostspielig als die Durchführung Beute spezifische ELISA oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist der Typ molekularen Darminhaltsanalysen (siehe Hagler 18 und Fournier et al. 19 auf Bewertungen von the Vor-und Nachteile der verschiedenen Darmtesttechniken). Innerhalb der letzten zehn Jahre hat sich die Beute immunomarking Technik verwendet worden, um Fraßaktivität von Baumwolle Raubtiere auf Kaninchen-IgG-markierten Schädlinge 18,20,21, Trophallaxis und Fütterung Beziehungen in Termitenkolonien unter Verwendung eines Kaninchen-IgG behandelten Papiernahrungsmittelquelle 22, granivory identifizieren eines Arthropoden Assemblage auf invasive Unkrautsamen Löwenzahn mit Kaninchen-IgG-23 markiert, stinken Bug predation Preise auf IgG-markierten Tomatenhornwürmer in Grundstücke, verschiedene semiochemischen Behandlungen unterzogen 24 gesammelt und Raubfangende Aktivität auf IgG / IgY markierten Aas 25.

Eine zweite Generation von Protein-Nachweis indirekten ELISAs wurden fast vor zehn Jahren entwickelt. Diese ELISAs wurden speziell entwickelt, um Proteine ​​in "off-the-shelf" Lebensmittelprodukte, wie Eieralbuminprotein in Hühner Eiweiß, Soja-Trypsin-Inhibitor-Protein in Sojamilch und Casein Protein enthielt detektierenin Kuhmilch. Die zweite Generation des Proteins immunomarkers haben nützlich für MRR, Mark-Abscheidung und Eigenmarke Art der Forschung bewährt. B. Irvin et al. 26 zeigte, daß es möglich ist, topisch markieren empfindliche Parasiten mit diesen off-the-shelf-Proteine. Außerdem Hagler et al. 8,27 zeigte, dass Honigbienen können sich selbst Zeichen mit Eiweiß und Rindermilch-Trockenpulver, wie diese durch eine Proteinspender am Eingang eines Bienenstocks (3D) platziert. Vielleicht ist die kreative Verwendung des Proteins Kennzeichnung beteiligt Targeting Kuhfladen mit Eiweiß Verwendung einer Strahlspritzen 28. Im Gegenzug erwarb Gesicht fly Erwachsenen eine Eigenmarke, wie sie aus ihren Puppenstadium heraus und verließ den Kuhfladen.

Die wichtigste Eigenschaft der zweiten Generation Protein immunomarkers ist, dass sie in großen Mengen und zu einem Bruchteil der Kosten von IgG / IgY Proteine ​​11 leicht verfügbar sind. Dieses Merkmal hat revolutionized den Weg flächendeck mark-Aufnahmeart Forschung durchgeführt wird. Genauer gesagt, haben Forscher nun eine zuverlässige Methode, um schnell und gleichmäßig tag Arthropoden über weite Gebiete in dem Gebiet mit einer Vielzahl von herkömmlichen Spritz rig Ausrüstung (3E). Zum Beispiel Schadinsekten wurden direkt in Obstgärten und Felder mit tragbaren Handpistole Typ Sprühgeräte 29,30, traktorbetriebenen Sprühgeräte 31,32 und Kompaktspritzen 33 markiert. Horton et al. 34 verwendet eine elektrische Spritzgerät auf einem Geländewagen, um Anwendungen von Eiweiß, um Insekten zu besetzen Gründüngung in einem Birnenobstgarten (3F) eingebettet lokalisieren montiert. Ebenso Swezey et al. 5,35 verwendet eine Rückenspritze, um präzise Anwendungen Hühner Eiweiß, um Zeilen einer Luzerne Falle Ernte (eine bevorzugte Wirtspflanze) in einer biologisch angebaute Erdbeerfeld eingebettet gelten für eine Schädlingsbekämpfung und ihrer natürlichen Feinde markieren ( et al. 36 angelegt eines Broadcast Anwendung Kuhmilch und Eiweiß bis 29 und 16 ha blühen Alfalfa, bzw. (3H, I). Das Ziel dieser Studie war es, die ansässige Arthropoden in der Luzerne zu markieren, und dann, nach der Luzerne wurde vom Mähen (Funken einer Ausbreitung Ereignis), um die Verbreitungsmuster der Arthropoden in benachbarte Baumwollfeldern zu verfolgen (eine Ernte anfällig für das geerntete Schädlingsarten).

Einige Benutzer der Mark-Capture-Verfahren der zweiten Generation haben die ursprünglichen Verfahren ein wenig geändert, um ihre spezifischen Forschungsbedürfnisse zu erfüllen. Die Körper-Typ und Größe der ter gezielt Insekten, zusammen mit seiner Verhaltensmerkmale, wird das Volumen und die Konzentration der Markierung benötigt wird und wie die Marke verabreicht 37 diktieren. Darüber hinaus wird die zur Bekämpfung von Insekten im Bereich zurück-Verfahren abhängig dieser Faktoren sein. Bisher verwendet fast jeder Methode (zB Klebefallen, Sweep Netze, Vakuum), um Insekten zu sammeln wurde erfolgreich verwendet, um markierte Insekten 3,5,8,11,29,31,32,35,38 zu sammeln. Jedoch wegen der extremen Empfindlichkeiten der Proteindetektion ELISAs, betonen wir, dass große Sorgfalt darauf geachtet, dass nicht markierte Proben nicht während der Sammlung oder Sortierprozessen 38 kontaminiert werden.

Die ursprüngliche Studie 11, die die zweite Generation der Proteinmarkierungssysteme (dh Eieralbumin Milchcasein und Soja-Trypsin-Inhibitor) beschrieben gemeldet Faktoren, die Assay-Empfindlichkeit kann zwischen den Arten von Markierungs variieren. Insbesondere zeigten sie, dass difschiedlichen Wasserquellen, Additive (Tenside), und auch die Art der ELISA-Platte verwendet betroffen (entweder positiv oder negativ) des Assays. Darüber hinaus, dass Studium und nachfolgende Studien 37,39,40 ergab, dass die drei Proteinmarkenerkennung Assays variieren in der Wirksamkeit. Das Eiweiß Marker wurde länger als die Milch Marker, der länger ist als Sojamilch Marker beibehalten wurde beibehalten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Testprotein Zeichen Retention an einem bestimmten Insekten vor der Einschiffung auf Feldforschung. Auch diese zweite Generation der indirekten ELISAs zeigen manchmal einen niedrigen Pegel der Hintergrundgeräusche mit bestimmten Arten von Insekten (zB Pflanzenfresser) (pers. Obs). Dieses Hintergrundrauschen kann durch Zugabe von 100 ul von Wasserstoffperoxid zu jeder Vertiefung der ELISA-Platte für 30 Minuten zwischen Schritt und Schritt 2.3.5 2.3.4 im obigen Protokoll (unpubl Daten.) Verringert werden.

Es sei darauf hingewiesen, dass die indirekten ELISAs verwendet, um die zweite Generation der Proteinmarkierungen zu erfassensind sehr effektiv bei der Erkennung des Proteins von Insekten im Probenpuffer getränkt. Allerdings sind die indirekten ELISAs nicht so effektiv wie die Sandwich-ELISA auf die Erkennung interner Proteinmarkierungen oder Beute-Proteine ​​von Insekten. Studien haben gezeigt, dass die indirekten ELISAs sind nicht so effizient wie Sandwich-ELISAs bei Nachweis von Protein in Insektenproben homogenisiert 34,41.

Ein wichtiger Faktor, um mit jedem ELISA berücksichtigen ist, dass das Verfahren zeigt oft Platte-zu-Platte Variabilität 42,43 (vor allem für Tag-zu-Tag-Effekte beim Betrieb eines Assay zurückgeführt). Daher ist es wesentlich, dass jede ELISA-Platte umfaßt: (1) ein oder mehrere TBS nur negativen Kontrollen, (2) ein oder mehrere TBS + reines Protein positive Kontrollen, und (3) mindestens acht negativen Insekten Kontrollen (dh Personen bekannter nicht, um ein Protein Zeichen enthalten). Nur die TBS, TBS + -Protein und Insektennegativkontrollen sicherstellen, dass der Puffer nicht eine Fehlerquelle werden die Reagenzien richtig funktioniert, einnd, dass es nicht alle Proteine ​​im Insekt, das Kreuz mit der ELISA-Reagenzien reagieren auf. Außerdem sind die Insektennegativkontrollen wichtig für die Berechnung ELISA Schwellenwerte (siehe unten). Die in dieser Demonstration gezeigten Plattendesign inklusive 7 TBS Rohlinge, 1-Protein + TBS Positivkontrolle (in der ersten Spalte) und acht negative Kontrollen (in der letzten Spalte) auf jeder ELISA-Platte (Abbildung 1).

Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Handhabung ELISA-Daten, um einen Schwellenwert zu bestimmen, um ein Insekt auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteins Filter erzielen. Die ursprünglich von Stimmann 44 für Scoring Rubidium-markierten Insekten vorgeschlagene Verfahren wurde als die mittlere Höhe der Marker in einem Pool von nicht markierten Insekten sowie das Dreifache der Standardabweichung der nicht markierten Individuen definiert. Dieses Verfahren ist auch als das herkömmliche Verfahren zum Ritzen von Insekten auf das Vorhandensein von Proteinmarkierungen 9,17 verwendet. Jedoch kann in einigen cases haben Forscher intuitiv ausgewählt konservativer Schwellwerte, um die Wahrscheinlichkeit zu erhalten Fehlalarme zu reduzieren. Die einfachste Methode ist, fügen Sie einfach vier Minuten vor sechs Standardabweichungen zum Mittelwert der Negativkontrollen statt drei 18,34. Ein anspruchsvolleres Verfahren, um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens Fehlalarmen weiter reduzieren durch Sivakoff et al. 12 vorgeschlagen. Dieses Verfahren beinhaltet die Berechnung der mittleren OD wird der acht negative Kontrolle Insekten auf jeden ELISA-Platte und dann Berechnung der Standardabweichung auf Basis der gepoolten negativen Kontrollen von all den ELISA-Platten einer gegebenen Studie.

Zusammenfassend ist eine zuverlässige Methode zur Bekämpfung von Arthropoden markieren kritisch für den Erfolg der meisten Ausbreitungsstudien. Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um Arthropoden mit Proteinen in den vergangenen zwei Jahrzehnten zu markieren. Protein immunomarking und die Detektion der Markierungen sind relativ einfach und kostengünstig und sehr anpassungsfähig an eine Vielzahl von sTUDIEN. Künftigen Nutzer des immunomarking Technik sollten sicherstellen, dass ihre Methode ist geeignet, um die Besonderheiten ihrer Forschung. Die Konzentration und das Volumen der Markierung benötigt wird und wie sich die Marke bezieht, wird von Faktoren wie Verhalten, Körper-Typ und Größe der Zielarten 40 abhängen.

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Disclosures

Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukte in dieser Publikation ist ausschließlich für den Zweck der Bereitstellung von spezifischen Informationen und stellen keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.

Acknowledgments

Die Finanzierung wurde von USDA CRIS 5347-22620-021-00D Verfügung gestellt und zum Teil von der Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative Competitive Grants-Nr. 2011-67009-30141 vom USDA National Institute of Food and Agriculture. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung der Johanna Nassif. Wir danken auch Paul Baker, David Horton, Diego Nieto und Frances Sivakoff für die Bereitstellung einiger der in 3 verwendeten Bilder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

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References

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Umweltwissenschaften Heft 107 Immunomarking Insekt ELISA Mark-Erfassung Mark-Release-Wiederfang Eigenmarke
Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung
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Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

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