Abstract
모니터링 절지 동물의 움직임은 종종 더 나은 관련된 인구 역학, 분산 패턴, 기주 식물의 환경 설정 및 기타 생태 학적 상호 작용을 이해하는 것이 필요합니다. 절지 동물은 일반적으로 고유의 마크를 태그에 의해 자연에서 추적 한 다음 다시 수집 그들의 분산 기능을 결정하기 위해 시간과 공간을 통해들을 수 있습니다. 이러한 착색 도료 또는 먼지 등의 실제 물리적 태그 외에, 단백질의 다양한 유형에 대한 생태 학적 연구 절지 마킹하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단백질은 내부 및 / 또는 외부로 투여 할 수있다. 단백질이어서 특이 단백질 효소 면역 분석법 (ELISA)과 수복 절지 검출 될 수있다. 여기에서 우리는 외부와 내부에 단백질과 절지 동물에 태그를위한 프로토콜을 설명합니다. 간단한 두 실험 예는 증명되어 국소 적으로 단백질이 풍부한 규정 식 및 (2)의 외부 단백질 마크를 제공하여 곤충에게 소개 (1) 내부 단백질 마크의료용 분무기를 사용하여 곤충 pplied. 우리는 다음과 샌드위치 곤충 단백질 마크를 검출하는데 사용될 간접 ELISA 방법을 단계별로 설명 관한 것이다. 이 데모에서는, 마크 릴리스 탈환, 마크 캡처, 연구의 자기 마크 캡처 유형의 절지 동물의 수집 및 단백질 마커 검출의 다양한 측면은 immunomarking 절차가되었습니다 다양한 방법과 함께 설명되어 있습니다 연구 목적의 다양한 적합하도록.
Introduction
자연에서 절지 동물 해충, 천적 (기생 포식자), 및 수분 매개자의 움직임을 추적하는 것은 생태계 서비스를 개선하는 방법에 대한 이해에 필수적이다. 분산 연구의 대부분의 유형에 대한 핵심 요소는 관심의 절지 동물 (들) 태그를 신뢰할 수있는 방법을 가지고있다. 다양한 재료 (예를 들면, 도료, 염료, 착색 먼지, 태그, 희귀 원소, 단백질) 동작, 및 다른 생태 상호 1,2- 먹이, 그 집단의 동력학, 분산 능력을 평가하는 절지 동물을 표시하는 데 사용되어왔다.
주어진 분산 연구에 사용 마커의 적절성의 연구가 진행되고 유형에 의존 할 것이다. (1) 마크 릴리스 탈환 (MRR), (2) 마크 캡처, (3) 자기 마크 캡처 : 절지 동물을 표시하기위한 세 가지 범주화가 있습니다. 마크 릴리스 탈환 조사의 경우, 조사는 일반적으로 laborato에 집합 절지 동물을 표시RY 및 필드 중앙 지점에서 릴리스 그들을. 절지 동물은 다음 다른 수집 장치 (예를 들어, 스위프 그물, 진공, 접착 트랩) 3,4,5를 사용하여 다양한 공간과 시간 간격에서 다시 캡처됩니다. 특정 마크가 기본 개인 해제 구별 할 탈환 표본은 다음 검사합니다. 마크 캡처 연구, 연구자는 일반적으로 필드 사용하는 스프레이 장비 (예를 들어, 배낭 분무기, 붐과 노즐 스프레이)에서 직접 표를 적용한다. 마크 캡처 연구를위한 최적의 마커는 저렴하고 쉽게 절지 동물의 서식지에 적용됩니다. 자기 마크 캡처 연구, 연구자는 보통 절지 동물 미끼 6,7 또는 둥지 입구 8 마크를 적용합니다. 차례로, 절지 동물은 둥지를 빠져 나갈 때까지 마크에 대해 "칫솔질"에 의해 외부에 표시된 미끼 또는 삼키려에 의해 내부적으로 자체를 표시합니다.
위에서 언급 한 바와 같이, 마커의 많은 유형이 우리를왔다ED는 절지 동물 종의 다양한 태그를. 그러나 거의 이러한 분산 연구 범주의 세 가지 유용하다. 단백질 immunomarking 절차의 개발은 곤충 마킹 돌파구이었다. Immunomarking은 절지 동물에 단백질 라벨을두고 내부적 또는 외부 적으로, 이는 차례로, 항 - 단백질 특정 효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 검출된다. 사용 된 최초의 단백질 마커는 토끼 면역 글로불린 (IgG를) 닭의 IgG / IGY 9,10했다. 그들은 MRR과 자기 마크 캡처 연구 (설명 참조)에 매우 효과적 마크 입증했다. 불행하게도, IgG의 / IGY 단백질은 비용이 많이 드는 때문에 마크 캡처 연구 및 자체 마크 캡처 연구의 대부분의 유형에 대한 실질적인 없습니다. 그 후, 2 세대 단백질 검출 ELISA를 닭 달걀 흰자 (알부민), 우유 (카제인)과 두유 (트립신 억제제 단백질)에 포함 된 단백질을 위해 개발되었다. 각각의 분석은, 매우 민감한 특정, 가장중요한 것은, 훨씬 적은 비용의 IgG / IGY 단백질 (11)보다 단백질을 사용합니다. 이 단백질은 MRR, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 연구 (토론 참조)에 대한 효과가 입증하고있다.
이 글에서, 우리는 기술과 단백질 마크 실험실 보존 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연구는 전계 분산 연구의 모든 유형에 필요한 조사의 첫 단계이다. 연구자가 표시 전에 필드 분산 연구에 착수을 대상 절지 동물 종에 유지됩니다 얼마나 알고 구체적으로는 중요하다. 여기, 우리가 설명하고 내부 및 외부 MRR 곤충, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 형 현장 연구를 표시하는 방법을 보여줍니다. 우리는 간접적 샌드위치 ELISA를 함께 표시의 존재를 검출하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
1. 내부 마크, 보존 및 검색 절차
- 내부 마킹 절차
- 인공 다이어트 또는 필드에서 사육 실험실 식민지에서 (n은 100 개인 ≈) 관심의 곤충을 수집하고 두 깨끗한 사육 용기로 나눕니다.
- 컨테이너 중 하나에 정규 20 ㎖ 다이어트 패킷 (표시되지 않은 음성 대조군 처리)를 놓습니다. , 1.0 ㎎ / ㎖ 닭의 IgG / IGY 용액 1.0 mL를 제 20 ㎖ 인공 다이어트 패킷을 보완 철저하게 혼합, 다른 용기에 넣습니다.
주 : 관심 곤충 인공식이가 없으면 마크 또는 이들이 보통 (예를 들어, 녹색 콩 나방 달걀, 물, 설탕, 꿀)에 유지되어 어떠한 다이어트에 배치 될 수있다. - 곤충은 24 시간 동안 그들의 먹이 활동을 재개하도록 허용합니다.
- 내부 마크 보존 절차
- 각 컨테이너에서 다이어트 패킷을 제거하고 승 곤충을 공급다른 음식 소스 i 번째 실험 (예를 들어, 녹색 콩)의 기간 동안을 유지합니다.
- 하루 (또는 임의의 시간 간격으로) 각각의 처리에서 곤충의 코호트 (N = 20)를 수집하고 -20 ℃에서 즉시 동결.
- 샌드위치 ELISA 절차
- 1 희석 토끼 방지 닭 IGY 차 항체의 50 μl를 추가 트리스 500 깨끗한 ELISA 마이크로 플레이트의 각 웰에 식염수 (TBS)을 버퍼 및 RT (주에서 1 시간의 최소 품어 : 마이크로도 배양 할 수 O / N) 4 ° C에서.
- 판에서 항체를 취소하고 30 분 동안 1.0 % 무 지방 분유 용액 300 μL 잘 각을 차단합니다.
- 이전 배양 단계 기다리는 동안, TBS의 1.0 ㎖로 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 냉동 곤충을 배치합니다.
- 완전히 균질화 될 때까지 깨끗한 유봉 각 곤충을 갈기 및 ELISA의 개별 아니라 각 샘플의 100 μl를 추가플레이트. 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다.
- 각 ELISA 플레이트의 첫 번째 열에 우물 100 (TBS 계란 흰자) 음 (TBS 만 해당)과 긍정적 인 ㎕의 컨트롤을 추가합니다. 또한, 각 플레이트 (그림 1)의 마지막 열에서 8 우물에 부정적인 곤충 컨트롤 (표시되지 않은 곤충)의 100 μl를 추가합니다. 제어 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. 그림 1에서 제공하는 템플릿은 우리가 우리의 표준화 된 분석에 사용하는 템플릿입니다 있습니다. 웰에서 샘플의 위치는 연구자의 판단에 달려있다.
- 각 웰을 인산염 완충 식염수 (PBS) -tween로 3 회 세척 한 후 토끼 방지 닭의 IgG / IGY 고추 냉이 퍼 옥시 다제 1 희석과 결합의 50 μl를 추가 : 10,000 1 % 우유 솔루션을하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판의 50 μl를 추가합니다.
- 10 분 후, 웰을 읽어650 nm의 파장에서 설정된 마이크로 플레이트 분광 광도계.
도 1의 전형적인 96에 사용 표준화 웰 명칭을 나타내는 개략도 웰 ELISA 마이크로. 각 판은 양의 단백질 제어 (POS Ctrl 키)에게 잘 전용 트리스 완충 염수 음성 대조군 전용 7 웰 (TBS)를 포함하고, 표시되지 않은 (음) 곤충 컨트롤 전용 탈환 곤충 (샘플 1 ... 80), 8 우물에 전념 80 개인 우물 (NEG Ctrl 키 1 ... 8). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 외부 표시, 보존 및 검색 절차
- 외부 마킹 절차
- 관심의 곤충 수집 (N 100 ≈2.5 cm 직경 구멍 실험실 콜로니로부터 두 1.0 L를 플라스틱 용기로 필드와 장소에서 개인) 각 용기의 측에서 펀칭.
- 의료 분무기를 사용하여 DH 2 O (음성 대조군 처리)의 1.0 ml의 첫 번째 컨테이너에 곤충 스프레이. 의료 분무기를 사용하여 닭고기 달걀 흰자의 5.0 % 용액 1.0 mL로 두 번째 용기에 곤충 스프레이.
- 표준 실험실 공기 콘센트에 분무기의 호스를 연결 한 다음 컨테이너의 2.5 cm의 구멍에 분무기의 입에 삽입합니다. 분무기가 증기를 생성 할 때까지, 점차적으로 공기 배출구를 켭니다.
- 달걀 흰자위 용액 (약. 2-5 분) 분배 될 때까지 (마킹) 살포를 계속합니다.
- 분무기를 제거하고, 플라스틱 용기의 구멍에 코르크 장소. 솔루션이 완전히 건조 될 때까지 곤충은 실온에서 방치한다.
- 외부 마크 보존 절차
- 마크에 더 이상 노출을 방지하기 위해 별도의 깨끗한 사육 용기에 건조 곤충의 각 처리를 놓습니다.
- 연구 기간 동안 곤충을 유지하기 위해 깨끗한 용기에 음식과 물을 추가합니다.
- 매일 각각의 치료에서 곤충의 코호트를 (N = 20) 수집 및 -20 ° C에서 즉시 동결.
- 간접 ELISA 절차
- 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 얼어 붙은 곤충을 놓고 TBS의 1.0 ml를 추가합니다.
- 120 rpm으로 궤도 흔드는 세트에 1 시간 동안 샘플을 만끽 해보세요.
- 단계 1.3.5에 설명 된대로 부정과 긍정적 인 컨트롤을 추가합니다.
- 도 1에 도시 된 바와 같이, 침지 한 후, 새로운 96 웰 ELISA 플레이트에 80 지정된 샘플 웰 중 하나에 각 시료로부터 100 ㎕의 분취 액을 피펫 샘플을 실온에서 1 시간 동안 배양 허용 (주 :. 마이크로도 될 수있다 배양 O / N 4 ° C에서).
- 와 우물 세 번 씻어PBS-Tween 및 다음도 1 %를 각각 소 혈청 알부민 (BSA-PBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수 300 μl를 추가한다.
- 실온에서 30 분 후 PBS-트윈 (tween)로 두 번 씻는다.
- 물론 각 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 8,000 실온에서 1 시간 동안 품어 : 1 희석 토끼 반 달걀 알부민 차 항체의 50 μl를 추가합니다.
- PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척 한 후 1 희석 고추 냉이 과산화 효소와 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 50 μL 추가 : 실온에서 1 시간 동안 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 2,000.
- PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다.
- 10 분 후, 650 nm 파장으로 설정 마이크로 플레이트 분광 광도계로 웰을 판독.
3. 데이터 분석
- 아프로 풀링 음성 대조군에 기초한 표준 편차를 각각 ELISA 플레이트 상에 8 대조군 곤충의 평균 흡광도 값을 계산하고 계산M 주어진 연구 (12)의 ELISA 플레이트의 모든.
- ELISA 양성 임계 값을 획득하기 위해 각 ELISA 플레이트에 대해 얻어진 평균 여섯 배 풀링 표준 편차를 추가한다. 이 값 이상 흡광도 값을 산출 상관 곤충 시료 단백질 마크의 존재에 대한 긍정적 인 것으로 간주된다.
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Representative Results
내부 표시 :
내부 마크 보존 시험의 결과는도 2a에 도시되어있다. 계산 된 ELISA 위험 임계 값은 0.054이었다. 전체 (전 4 샘플 날짜가 결합), 단백질없이 처리 된 곤충은 지속적으로 낮은 ELISA 값 (X = 0.038 ± 0.002, N = 80)을 수득 하였다. 반대로, 모든 곤충 단백질 농축 다이어트 일관 강한 ELISA 값 (X = 0.475 ± 0.221, N = 80)을 수득 공급.
외부 표시 :
외부 마크 보존 시험의 결과는도 2b에 도시된다. 계산 된 ELISA 위험 임계 값은 0.082이었다. 전반적으로, 국소에만 물 표시 곤충은 지속적으로 낮은 ELI를 산출SA 값 (X = 0.048 ± 0.007, N = 80). 반대로, 국소 달걀 흰자위 솔루션으로 표시 곤충의 모든 지속적으로 강한 ELISA 값 (X = 0.746 ± 0.232, N = 80)을 수득 하였다.
그림 2. 평균 (± SD) ELISA 닭 IGY와 닭고기 달걀 흰자 (알부민)과 외부 표시 (B) 곤충 내부적으로 표시 () 곤충의 광학 밀도 값. 블랙 바는 평균 ± SD ELISA 광학 밀도 값에 의해 산출된다 표시되지 않은 곤충. 각 매일 단백질 치료를위한 곤충 표본의 크기가 20 개인이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
절지 동물 단백질 immunomarking 절차는 먼저 세기 전 (9)의 4 분의 1 정도를 설명했다. 이후 절차는 내부 및 외부 투여의 IgG / IgYs를 사용 절지 동물의 다양한 분산 패턴을 연구하기 위해 적용되어왔다. 이 단백질은 지금까지 테스트 곤충 종의 다양한에 대한 확고한 마커를 입증했다. 그러나, 전술 한 바와 같이, IgG의 / IgYs를 사용하는 주요 한계는 이들이 매우 비싸다는 것이다. 따라서, IgG의 / IgYs는 MRR 및 곤충의 큰 배치는 작은 공간에 표시 할 수 있습니다 또는 마크가 다이어트 또는 미끼에 통합 될 수 자기 표시 유형 연구에만 유용하다. 여기, 우리는 내부 마크가 닭의 IgG / IGY 풍부 인공 다이어트 곤충의 슈팅이 골대를 공급하여 관리 할 수있는 방법의 간단한 데모를 제공했다. 차례대로, IgG에 / IGY는 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출 하였다. 이 시스템은 이미 사용을 연구자들에게 특히 유리할 수있다자연스럽게 계란에서 발견 된 IgG의 / IGY를 감지 분석하기 때문에 계란이 들어 다이어트. 또한, IgG의 / IGY 단백질 소량 (도 3A) 상술 의료용 분무기를 사용하여 곤충에 국소 적으로 투여 될 수있다. 분무기 먼저 MRR 형 연구 3 토끼의 IgG와 질량 마크 매우 섬세하고 작은 기생하는 데 사용되었다. 그 이후로, 다른 방법은 분산 연구를위한 절지 동물에의 IgG / IGY 마크를 관리하는 데 사용되었다. 예를 들면, 향수 분무기 기생자 다른 종의 IgG (13, 14)에 / IGY 마크를 적용했다. 기타 내부를 공급함으로써 다양한 곤충을 표시 한 (즉, 자기 표시) 토끼 IgG를 표시 꿀 14, 15 또는 설탕 물 (16) (그림 3B). 마지막으로, 토끼 IgG에 (그림 3C) 함침 흰개미 베이커 등. 7 공급 판지. 그들이 유혹 음식을 섭취 이러한 흰개미는 쉽게 자기 표시거즈.
그림 3. 다양한 방법이 단백질 마크를 관리하는 데 사용 (A) 섬세한 기생은 토끼 IgG를 강화 판지에 먹이 의료 분무기를 사용하여 닭 IGY, (B) 토끼 IgG의 풍부한 꿀 솔루션에 먹이 포식 기생자, (C) 흰개미가 표시되고 그들은 원시 곤충 기존의 트랙터 스프레이 장비를 사용하여면 필드에 우유와 함께 표시되는 벌집의 입구, (E)에 배치 채취 장치 (F 통과로 미끼, (D) 꿀벌의 분유와 자기 표시 ) 원시 곤충이 ATV (G) 알팔파의 스트립의 기본 곤충에 장착 된 붐과 노즐 분무 장치와 닭 계란 흰자로 표시되는이 다시 닭 계란 흰자로 표시되는알팔파에 팩 분무 장치, 및 (H, I) 기본 곤충 공중 어플리케이터를 사용하여 닭고기 달걀 흰자로 표시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
의 IgG / IGY 단백질은 단지 곤충 분산을 연구에 사용되지 않았다. 그들은 또한 절지 동물 먹이 사슬 영양 링크를 추적하는 데 사용되어왔다. Hagler에와 듀란 (17)는 처음으로 표시된 먹이를 소비 육식 동물에서의 IgG / IGY 특정 샌드위치 장 내용 ELISA를 실시, 차례로, IgG의 / IGY와 먹이를 마킹의 개념을 제안합니다. 그것은 먹이 특정 ELISA 또는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행보다 지루하고 비용이 많이 드는이기 때문에이 기술은 최근 장내 분석 연구자들 사이에서 인기를 얻고있는 분자 장 내용 분석을 입력 (일의 리뷰에 대한 Hagler에 18 푸르니에 등. 19 참조전자의 장점과 다양한 장 분석 기법의 단점). 지난 십 년간 내에서 먹이 immunomarking 기술은 토끼 IgG를 마크 해충 18,20,21, 종이 음식 소스 (22) IgG를 처리 토끼를 사용 trophallaxis 및 흰개미 식민지에서 공급 관계, granivory에면 포식자의 먹이 활동을 식별하는 데 사용 된 토끼 IgG를 23로 표시된 침입 민들레 잡초 씨앗 절지 동물 군집의 다양한 semiochemical 처리 (24)를 실시 플롯에서 수집 된 IgG에 표시된 토마토 hornworms에 버그 포식 비율, 및 IgG의 / IGY 마크 썩은 고기 (25)에 포식자 청소 활동을 악취.
단백질 검출 간접 ELISA를의 두 번째 세대는 10 년 전 거의 개발되었다. 이러한 ELISA를 그러한 닭고기 계란 흰자 계란 알부민 단백질, 두유 대두 트립신 억제제 단백질 및 카제인 단백질로서 "기성품"식품에 함유 된 단백질을 검출하기 위해 구체적으로 설계된소 우유. 2 세대 단백질 immunomarkers는 MRR, 마크 캡처 및 자기 마크 형 연구를위한 유용한 입증했다. 예를 들어, 어빈 등. (26)는 가능했다 이러한 기성 단백질과 섬세한 기 생체를 국소을 표시하는 것으로 나타났다. 또한, Hagler에 등. 8,27은 보여 주었다 꿀벌 수 달걀 흰색과 소 우유 건조 분말과 자기 마크 하이브 (그림 3D)의 입구에 배치 된 단백질 디스펜서를 통해 그들은 출구로. 아마도 단백질의 가장 창조적 인 사용은 제트 스프레이 (28)를 사용하여 달걀 흰자와 소 거주자를 대상으로 참여 마킹. 그들의 번데기에서 등장하고 소 확실 종료로 차례로, 얼굴 플라이 성인은 자기 마크를 취득했다.
2 세대 단백질 immunomarkers의 가장 중요한 특징은 질량 수량과의 IgG / 단백질 IGY (11)의 적은 비용으로 쉽게 이용할 수 있다는 점이다. 이 기능은 회전이영역 전반 마크 포착 방식 연구가 수행되는 방식을 olutionized. 특히, 연구자들은 이제 신뢰할 수있는 방법이 기존의 스프레이 장비 장비 (그림 3E)의 다양한 사용 분야에서 광대 한 지역에 걸쳐 신속하고 균일하게 태그 절지 동물에. 예를 들어, 해충은 휴대용 손으로 총 형 분무기 29, 30, 트랙터 중심 airblast 분무기 31, 32, 및 스키드 분무기 (33)를 사용하여 과수원과 필드에 직접 표시했습니다. 호튼 등. (34)는 배 과수원 (그림 3 층)에 포함 된 커버 작물을 점유 곤충 달걀 흰자의 응용 프로그램을 정확하게 모든 지형 차량에 장착 된 전기 분무 장치를 사용했다. 마찬가지로, 스 웨지 등. 5,35은 (해충과 천적을 표시 유기농 딸기 필드에 포함 된 알팔파 트랩 작물 (선호 기주 식물)의 행에 닭고기 달걀 흰자의 정확한 응용 프로그램을 적용하는 배낭 분무기를 사용
2 세대 마크 포착 절차의 일부 사용자는 다소 특정 연구 요구를 충족하기 위해 원래의 절차를 수정했다. 신체 유형 및 T의 크기그는 곤충을 대상으로 자사의 행동 특성과 함께, 볼륨 및 마크의 농도에 필요한 방법과 마크 37을 투여을 지시합니다. 또한, 현장에서 곤충을 캡처하는 데 사용되는 방법은 이러한 불확정 요인이 될 것이다. 지금까지 거의 모든 방법 (예, 끈적 트랩, 스위프 그물, 진공) 곤충을 수집이 표시 곤충 3,5,8,11,29,31,32,35,38를 수집하기 위해 성공적으로 사용되어왔다 사용. 그러나, 단백질의 검출 ELISA를 극한 감도로 인해, 우리는 큰 관심이 도장이 표본 수집 또는 선별 공정 (38) 중에 오염이되지 않도록주의해야 함을 강조한다.
단백질 마킹 시스템 (예, 달걀 알부민, 우유의 카세인, 간장 트립신 억제제)의 2 세대 기술 원래 연구 (11)는 마커의 종류에 따라 다를 수 있습니다 분석 감도에 영향을 미치는 요인을보고했다. 구체적으로는, 그들은 그 DIF 나타났다ferent 물 소스, 첨가제 (계면 활성제), 및 ELISA 플레이트의도 유형 (긍정적으로 또는 부정적으로) 분석에 영향을 사용합니다. 또한, 그 연구와 후속 연구 37,39,40 세 가지 단백질 마크 검출 분석이 효능에 차이가 있음을 보여 주었다. 난백 마커 이상 두유 마커보다 오랫동안 유지되었다 우유 마커보다 유지한다. 이러한 결과는 이전의 현장 조사에 착수에 특정 곤충에 테스트 단백질 마크 보존의 중요성을 강조. 또한, 이러한 2 세대 간접 ELISA를 때때로 특정 곤충의 종류 (예를 들면, 초식 동물)와 배경 잡음 (인당. OBS)의 낮은 레벨을 나타낸다. 이러한 배경 잡음은 상기 프로토콜의 단계 2.3.4 및 2.3.5 단계 사이에 30 분 동안 ELISA 플레이트의 각 웰 (unpubl. 데이터) 과산화수소 100 ㎕를 첨가함으로써 감소 될 수있다.
이는 간접 ELISA를 이용은 2 세대 단백질 마크를 검출하는 것을 주목해야한다샘플 버퍼에 담가 곤충 단백질을 검출하는데 매우 효과적이다. 그러나 간접 ELISA를 곤충에 내부 단백질 마크 또는 먹이 단백질을 검출에서 샌드위치 ELISA로 적용되지 않습니다. 연구는 간접 ELISA를 균질화 곤충 표본 34,41 단백질을 검출에서 샌드위치 ELISA를만큼 효율적없는 것으로 나타났습니다.
어떤 ELISA와 함께 고려해야 할 중요한 요소는 절차가 종종 판 - 투 - 플레이트 변동성 42, 43 (분석 실행의 일상적인 효과에 주로 기인)을 나타낸다는 것이다. 따라서, 각 ELISA 플레이트 포함하는 것이 중요하다 : (1) 하나 이상의 TBS만을 음성 대조군을, (2) 하나 이상의 TBS + 순수한 단백질 양성 대조군, 및 (3) 적어도 8 네거티브 곤충 제어 (즉, 개인 공지 ) 단백질 마크를 포함 할 수 없습니다. TBS 만, TBS + 단백질, 곤충 음성 대조군은 버퍼가 오류의 원인이 아니라고 확신, 시약, 제대로 작동ND 각각 ELISA 시약과 반응 교차 곤충에 어떤 단백질이 아니라는 것을. 또한, 곤충 음성 대조군은 ELISA 임계 값 (아래 참조)을 계산하기위한 필수적이다. 이 데모에 표시된 플레이트 설계는 각 ELISA 플레이트에 7 TBS 공백, (첫 번째 열에서) 1 단백질 + TBS 양성 대조군과 (마지막 열)에 여덟 음성 대조군 (그림 1)을 포함.
ELISA 데이터를 운반하는 단백질 마크의 유무에 대한 곤충의 점수의 임계 값을 결정하는 경우에 또 다른 중요한 요소는 고려해야한다. 원래 루비듐 마크 곤충을 처치 Stimmann (44)에 의해 제안 된 방법은 도장이 곤충 플러스 도장이 개인의 표준 편차의 3 배의 풀의 마커의 평균 수준으로 정의 하였다. 이 방법은 또한 단백질 9,17 마크의 존재는 곤충을 처치 종래의 방법으로 사용되어왔다. 그러나 일부 CAS에ES 연구자들은 직관적 가양 획득의 가능성을 줄이기 위해 보수적 임계 값을 선택 하였다. 가장 쉬운 방법은 대신 세 18,34의 음성 대조군의 평균에 4-6 표준 편차를 추가하는 것입니다. 오탐를 얻는 기회를 줄이기 위해 더욱 정교한 방법은 Sivakoff 외. (12)에 의해 제안되었다. 이 방법은 각각의 ELISA 플레이트에 여덟 곤충 음성 대조군의 평균 흡광도 값을 산출 한 후 소정의 연구 ELISA 플레이트 모두에서 풀링 된 음성 대조군에 기초하여 표준 편차를 산출 수반한다.
요약하면, 절지 태그를 신뢰할 수있는 방법이 가장 분산 연구의 성공에 매우 중요하다. 다양한 방법이 지난 20 년에 걸쳐 단백질과 절지를 표시하는 데 사용되어왔다. 단백질 immunomarking와 마크의 검출은 (S)의 무수 비교적 용이하고 저렴하고 매우 적응력tudies. immunomarking 기술의 미래 사용자는 자신의 방법론이 연구의 특성에 적합한 지 확인해야합니다. 마크가 적용된 농도 마크의 필요한 부피 및 방법은 표적 종 (40)의 동작, 본문 유형 및 크기와 같은 요인에 의존 할 것이다.
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Disclosures
이 책에서 상표명 또는 상업적 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하는 목적으로 만이며, 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.
Acknowledgments
자금은 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 아니에 의해, 부분적으로, USDA CRIS 5347-22620-021-00D에 의해 제공되었다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2011-67009-30141. 우리는 요한나 Nassif의 기술 지원을 감사하고 있습니다. 우리는 또한 그림 3에서 사용 된 사진의 일부를 제공하기 위해 폴 베이커, 데이비드 호튼, 디에고 니에 토와 프랜시스 Sivakoff 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
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