Abstract
節足動物の動きを監視することは、多くの場合、よりよい関連する人口動態、分散パターン、宿主植物の環境、およびその他の生態系の相互作用を理解するために必要です。節足動物は、通常、分散能力を決定するために、時間と空間の上にそれらをユニークなマークでそれらをタグ付けし、その後再収集することにより、自然の中で追跡されます。そのような着色埃や塗料などの実際の物理的なタグに加えて、タンパク質の様々なタイプの生態研究の節足動物をマーキングするための非常に効果的であることが証明されています。タンパク質は、内部および/または外部から投与することができます。タンパク質は、その後、タンパク質に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって奪還節足動物に検出することができます。ここでは、外部と内部のタンパク質と節足動物をタグ付けするためのプロトコルについて説明します。 2つの単純な実験例が示されています。タンパク質が豊富な食事を提供することで、昆虫に導入（1）内部のタンパク質マークと（2）外部のタンパク質マーク局所医療ネブライザーを用いて、昆虫にpplied。それから、サンドイッチや昆虫タンパク質にマークを検出するために使用される間接的なELISA法を順を追って説明を関連付けます。このデモでは、マーク・リリース・再捕獲、マーク・キャプチャ、および研究の自己マークキャプチャー・タイプの節足動物の取得及びタンパク質マーカーの検出の様々な側面は、免疫標識手順がされているさまざまな方法と一緒に、議論されています研究目的の多種多様に合うように適合されます。
Introduction
節足動物害虫、天敵（寄生蜂と捕食者）、そして自然の中で花粉媒介の動きを追跡することは、生態系サービスを改善するための方法をより良く理解するために不可欠です。分散研究のほとんどのタイプのための重要な構成要素は、関心の節足動物（複数可）をタグ付けするための信頼できる方法を有しています。様々な材料（例えば、塗料、染料、着色粉剤、タグ、希少元素、タンパク質）は、それらの個体群動態、分散能力、摂食行動、及び他の生態系の相互作用を評価するために、1,2-節足動物をマークするために使用されています。
任意の分散研究のために使用されるマーカーの妥当性は、行われている研究の種類に依存することになります。 （1）マーク・リリース・再捕獲（MRR）、（2）マーク・キャプチャー、および（3）自己マークキャプチャ：節足動物をマーキングするための3つの広範な分類があります。マーク・リリース・再捕獲調査のために、研究者は一般的にlaboratoに一括して節足動物をマークRYとフィールドの中心点でそれらを解放します。節足動物は、異なる収集装置（例えば、掃引ネット、真空、粘着トラップ）3,4,5を用いて様々な空間的および時間的間隔で再捕獲されています。奪還の標本は、その後ネイティブ個人から解放区別するために、特定のマークを調べます。マーク捕獲調査のために、研究者は通常、噴霧装置（例えば、バックパック噴霧器、ブーム及びノズル噴霧器）を使用して、フィールドに直接マークを適用します。マーク・キャプチャ研究のための最善のマーカーは、安価であり、容易に節足動物の生息地に適用されます。自己マーク捕獲調査のために、研究者は通常、節足動物の餌6,7または巣の入り口8にマークを適用します。ターンでは、節足動物は、巣を出るときにマークアップに対する「ブラッシング」でマークされた餌または外部をむさぼり食うことにより、内部で自身をマーク。
前述したように、マーカーの多くの種類は、私たちがしていますedは節足動物の種の多様性をタグ付けします。しかし、非常に少数のは、これらの分散の研究カテゴリーのすべての3のために有用です。タンパク質の免疫標識法の開発は、昆虫をマークするための主要なブレークスルーでした。免疫標識は、内部または外部節足動物にタンパク質標識を置くれ、次に、抗タンパク質特異的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって検出されます。使用された最初のようなタンパク質マーカーは、ウサギ免疫グロブリン（IgGの）およびニワトリのIgG / IgYの9,10ました。彼らは（説明を参照してください）MRRと自己マークキャプチャー・研究のための非常に有効なマークであることが判明しました。残念ながら、IgGの/ IgYのタンパク質は高価であり、したがって、マーク・キャプチャ・研究と自己マーク捕獲調査のほとんどのタイプのための実用的ではありません。続いて、第2世代のタンパク質検出ELISAは鶏卵の白身（アルブミン）、牛乳（カゼイン）と豆乳（トリプシンインヒビタータンパク質）に含まれるタンパク質のために開発されました。各アッセイは、特異的、高感度であり、そして、最も重要なのは、はるかに安価のIgG / IgYのタンパク質11よりもタンパク質を使用しています。これらのタンパク質は、（議論を参照）MRR、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャー・研究のための有効であることが判明しました。
この記事では、説明し、タンパク質マーク実験室での保持試験を実施する方法を示します。このような研究は、フィールド分散試験の任意のタイプのために必要な研究の第一段階です。具体的には、研究者はマークが前のフィールド分散の研究に着手をターゲットと節足動物の種に保持される時間の長さを知っていることが重要です。ここでは、説明し、内部と外部のMRRのための昆虫、マーク・キャプチャ、および自己マークキャプチャ型のフィールドスタディをマークする方法を示します。それから、間接的なサンドイッチELISA法でマークの存在を検出する方法を示します。
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Protocol
1.内部マーク、保存、および検出手順
- 内部マーキング手順
- 人工飼料上またはフィールドから飼育実験室コロニーから（nは 100人を≈）関心の昆虫を集め、2きれいな飼育容器に分割します。
- コンテナのいずれかに、通常の20ミリリットルダイエットパケット（マークされていないネガティブコントロール治療）を配置します。 、1.0 mg / mlの鶏のIgG / IgYの溶液を1.0 mlの第20ミリリットル人工飼料パケットを補足完全に混合し、他の容器に入れてください。
注意：利息の昆虫が人工飼料を持っていない場合、マークは上または、それらは通常（ 例えば 、緑豆、蛾の卵、水、砂糖、蜂蜜）に維持されるどんな食事に配置することができます。 - 昆虫が24時間のために彼らの摂食活動を再開できるようにします。
- 内部マーク保持手順
- 各容器からダイエットパケットを削除し、wは昆虫を供給実験（ 例えば、緑色の豆）の期間にわたって、それらを維持するために別の食料源番目。
- 毎日（または任意の所望の時間間隔で）、各処理からの虫のコホートを（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。
- サンドイッチELISA法
- 1希釈したウサギ抗ニワトリIgYを一次抗体50μlの追加：トリス500は、クリーン、ELISAマイクロプレートの各ウェルに生理食塩水（TBS）をバッファリングし、RT（ノートで1時間の最小インキュベート：マイクロプレートもインキュベートすることができるO 4℃/ N）。
- プレートから抗体を捨て、30分間1.0％脱脂粉乳溶液を300μlの各ウェルをブロックします。
- 前のインキュベーションステップを待っている間、TBS 1.0mlの1.6 mlマイクロチューブに個別に凍結昆虫を置きます。
- 十分に均質化されるまでクリーン乳棒で各昆虫を挽くし、ELISAの個々のウェルにそれぞれ100μlの試料を追加プレート。サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。
- 各ELISAプレートの最初の列のウェルに100（TBS中卵白）負（TBSのみ）および陽性μlのコントロールを追加します。また、各プレートの最後の列の8ウェル（ 図1）に負の昆虫コントロール（マークされていない昆虫）の100μlを添加します。対照サンプルは、室温で1時間インキュベートすることを許可します。 図1に提供されるテンプレートは、私たちが標準化されたアッセイのために使用するテンプレートであることに注意してください。ウェル中の試料の配置は、研究者の裁量に任されています。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）-tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したウサギ抗ニワトリIgGを/のIgYを50μl加える：1％ミルクの溶液中で10,000、室温で1時間インキュベートします。
- PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにテトラメチルベンジジン（TMB）基質の50μlを添加します。
- 10分後、ウェルを読みます650nmの波長に設定したマイクロプレート分光光度計です。
典型的な96ウェルELISAマイクロプレートに使用される標準化された井戸の指定を示す図1の模式図は、各プレートは、トリス緩衝食塩水陰性対照（TBS）に捧げ7井戸、正のタンパク質制御（順位はCtrl）にも専用のが含まれています無印（負）昆虫コントロール専用の奪還虫（サンプル1 ... 80）、および8ウェルに専用の80個々のウェル（NegのCtrlキー1 ... 8）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2.外部マーク、保存、および検出手順
- 外部マーキング手順
- 興味の昆虫を集めて（nは ≈100実験室コロニーからか、フィールドと場所から個人）に直径2.5cmの穴を持つ2つの1.0リットルのプラスチック容器は、各容器の側面から打ち抜い。
- 医療噴霧器を使用してのdH 2 O（ネガティブコントロール治療）を1.0 mlの第一の容器内の昆虫をスプレーしてください。医療ネブライザーを用いて、ニワトリの卵白の5.0％の溶液1.0mlと第二の容器内の昆虫をスプレーしてください。
- 標準的な実験室の空気出口に噴霧器のホースを取り付け、その後、容器2.5cmの穴に噴霧器の口を挿入します。噴霧器は、蒸気を生成するまで、徐々に空気出口をオンにします。
- 卵白溶液は（約2-5分）に分配されるまで（マーキング）を噴霧し続けます。
- 噴霧器を取り外し、プラスチック容器の穴にコルクを配置します。ソリューションが完全に乾くまで昆虫は室温で放置します。
- 外部マーク保持手順
- マークへのさらなる露出を避けるために、別々の清潔な飼育容器に乾燥昆虫のそれぞれの処理を配置します。
- 研究の期間にわたって昆虫を維持するために清潔な容器に食料と水を追加します。
- 毎日、各処理から昆虫のコホート（N = 20）を収集し、-20℃で直ちに凍結します。
- 間接ELISA法
- 1.6ミリリットルのマイクロチューブに個別に凍結した昆虫を置き、TBSの1.0ミリリットルを追加します。
- 120 rpmでオービタルシェーカーセットで1時間サンプルを浸します。
- ステップ1.3.5で説明したようにネガティブとポジティブコントロールを追加します。
- 図1に示すように浸漬した後、新しい96ウェルELISAプレート上の80の指定サンプルウェルの一つに、各試料からの100μlのアリコートをピペットでサンプルを室温で1時間インキュベートすることを許可する（注：マイクロプレートにもすることができます4℃でO / N）インキュベートしました。
- でウェルを3回洗浄しその後、PBS-Tweenで、各ウェルに1％ウシ血清アルブミン（PBS-BSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水300μLを加えます。
- 室温で30分後、PBS-Tweenで二回洗浄します。
- 各ウェルにPBS-BSA-シルウェット（0.05％）で8,000、室温で1時間インキュベート：1に希釈したウサギ抗卵アルブミン一次抗体50μlのを追加します。
- PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、その後1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを50μl加える。室温で1時間、PBS-BSA-のSilwet（0.05％）で2,000。
- PBS-Tweenで各ウェルを3回洗浄し、各ウェルにTMB基質の50μlを添加します。
- 10分後、650nmの波長で設定したマイクロプレート分光光度計を用いて井戸をお読みください。
3.データ分析
- 各ELISAプレート上の8陰性対照虫の平均吸光度値を計算して、あちこちにプールされた陰性対照に基づいて標準偏差を計算M与えられた研究12のELISAプレートのすべて。
- ELISA正の閾値を得るために、各ELISAプレートについて得られた平均値に6回プール標準偏差を加えます。この値以上の吸光度値を生じる任意の昆虫タンパク質サンプルはマークの存在について陽性であるとみなされます。
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Representative Results
内部マーキング：
内部マーク保持試験の結果を図2Aに示されています。計算されたELISAクリティカルのしきい値は0.054でした。総合（すべての4つのサンプルの日付を合わせ）、タンパク質なしで処理された昆虫は一貫して低いELISA値（X = 0.038±0.002、N = 80）を得ました。逆に、昆虫のすべては、一貫して強いELISA値（X = 0.475±0.221、N = 80）を得た蛋白質に富む食餌を与え。
外部マーキング：
外部マークの保持試験の結果を、 図2Bに示されています。計算されたELISAクリティカルのしきい値は0.082でした。全体的に、局所的に水だけでマークされた昆虫は、一貫して低いELIをもたらしましたSAの値（x = 0.048±0.007、N = 80）。逆に、局所的に卵白液が付い昆虫の全てが常に強いELISA値（X = 0.746±0.232、N = 80）を得ました。
図 2は、 ニワトリIgYと内部にマーク（A）昆虫や鶏卵の白身（アルブミン）と外部とマーク（B）昆虫のELISA光学濃度値平均（±SD）。黒いバーはによって生成されたSD ELISA光学濃度値±平均値でありますマークされていない昆虫。毎日のタンパク質の治療のための昆虫標本の大きさが20人だった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
節足動物タンパク質の免疫標識手順は、最初の世紀前9のほぼ4分の1を説明しました。それ以来、手順が内部と外部の両方投与のIgG / IgYsを使用して、節足動物の多様な分散パターンを研究するために適応されています。これらのタンパク質は、これまでテストした昆虫種の多種多様な不動のマーカーを証明されています。しかしながら、上述したように、IgGの/ IgYsを使用するための主な制限は、それらが非常に高価であることです。その結果、IgGを/ IgYsのみ昆虫の大きなバッチが小さなスペースにマークすることができるか、マークが食事や餌に配合することができるMRRと自己マーキングタイプの研究に有用です。ここでは、内部のマークが鶏のIgG / IgYので強化された人工飼料昆虫ターゲットを供給することにより投与することができる方法の簡単なデモを提供しました。ターンでは、IgG / IgYを、サンドイッチELISAを用いて検出しました。このシステムは、すでに使用していることを研究者に特に有利であるかもしれませんアッセイは当然のIgG /のIgYを検出しますので、鶏の卵が含まれている食事は卵で見つかりました。さらに、IgGの/のIgYのタンパク質の少量（ 図3A）上述した医療用噴霧器を使用して、昆虫に局所的に投与することができます。噴霧器は、最初のMRR型研究3用のウサギIgGとマスマーク非常に繊細で小さな寄生するために使用されました。それ以来、他の方法は、分散研究のための節足動物に対するIgG / IgYのマークを管理するために使用されています。例えば、香水噴霧器は、他の寄生種13,14上のIgG / IgYのマークを適用するために使用されています。その他内部的にそれらを供給することにより、様々な昆虫をマークしている（ すなわち 、自己マーキング）ウサギIgG標識された蜂蜜14,15や砂糖水16（ 図3B）。最後に、ウサギのIgG（ 図3C）を含浸させたシロアリのベーカーら 7給餌段ボール。これらのシロアリは、容易に自己マークされ、彼らは餌食物を摂取として詰め込みます。
図 3。様々な方法がタンパク質マークを管理するために使用される：（A）繊細な寄生がウサギIgGに富む段ボールを餌に医療ネブライザーを用いて、ニワトリIgY、（B）ウサギIgGに富む蜂蜜液を餌に寄生、（C）シロアリでマークされています餌、（D）ミツバチの自己マーキングドライミルクと、彼らはハイブ、（E）の入り口に置かれた散布装置を介して行くように、ネイティブの昆虫を従来のトラクタースプレーリグを使用して、綿のフィールドにミルクでマークされ、（F ）ネイティブの昆虫は、アルファルファのストリップでATV、（G）は、ネイティブの昆虫がバックで鶏卵の白身でマークされている上に取り付けブームとノズルスプレー装置と鶏の卵白でマークされていますアルファルファでパック噴霧装置、及び（H、I）は、ネイティブの昆虫が空中アプリケーターを用いて、ニワトリの卵白でマークされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IgG / IgYのタンパク質がちょうど昆虫分散を研究するために使用されていません。彼らはまた、節足動物食物連鎖における栄養リンクを追跡するために使用されてきました。ハグラーとデュラン17は、第1のIgG / IgYを持つ獲物をマークし、今度は、マークされた獲物を捕食者に消費のIgG / IgYの固有のサンドイッチ腸内容ELISAを行うという概念を提案しました。それは獲物特異的ELISAまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施するよりも少ない手間とコストがかかるため、この技術は、最近、腸の分析研究者の間で人気を得ている分子腸の内容分析を入力します（目のレビューをハグラー18とフルニエら 19を参照してください。様々な腸のアッセイ技術のeは長所と短所）。過去十年間の中で、技術を免疫標識獲物はgranivory、ウサギIgG-にマーク害虫18,20,21、栄養交換およびウサギIgG-処理された紙の食料源22を使用して、シロアリのコロニーで送り関係の綿の捕食者の摂食活動を識別するために使用されていますウサギIgGを23でマークされた侵襲タンポポの雑草種子の節足動物の集合体で、各種の情報化学物質の処理24を施したプロットに収集したIgGマーク付きトマトhornwormsのバグ捕食率、およびIgG / IgYのマークの付いた腐肉25の捕食者捕捉活性を悪臭を放ちます。
タンパク質検出間接ELISAの第二世代は、10年近く前に開発されました。これらのELISAは、ニワトリの卵白中の卵アルブミンタンパク質、豆乳中の大豆トリプシンインヒビタータンパク質、カゼインタンパク質のような「既製の」食品、に含まれるタンパク質を検出するために特別に設計されました牛乳インチ第二世代のタンパク質immunomarkersはMRR、マーク・キャプチャと自己マーク型の研究に有用であることが分かっています。例えば、アービンら 26は、局所的に、これらの既製のタンパク質と繊細な寄生をマークすることが可能であることを示しました。また、ハグラーら 8,27は、ミツバチは、彼らの出口として卵白と牛乳乾燥粉末と自己マークすることができますハイブ（ 図3D）の入り口に置かれたタンパク質ディスペンサーを介していることを示しました。おそらく、タンパク質の最も創造的な使用は、ジェット噴霧器28を使用して卵白と牛のパットをターゲットに関与マーキング。彼らは蛹から出現し、牛のパットを出たとしてターンでは、顔フライ大人自己マークを取得しました。
第二世代のタンパク質immunomarkersの最も重要な特徴は、大量の量でおよびIgG / IgYのタンパク質11のコストのほんの一部で容易に入手可能であるということです。この機能は、回転していますエリア全体のマーク・キャプチャ型の研究が行われている方法をolutionized。具体的には、研究者らは現在、従来のスプレーリグ機器（ 図3E）の多種多様なを使用してフィールド内の広大な地域で急速にかつ均一にタグ節足動物への信頼性の高い方法があります。例えば、害虫は、携帯ハンドガンタイプ噴霧器29,30、トラクター主導のエアブラスト噴霧器31,32、およびスキッド噴霧器33を使用して果樹園やフィールドに直接マークされています。ホートンら 34は、梨の果樹園（ 図3F）に埋め込 まれたカバークロップを占有する昆虫に卵の白身のアプリケーションを特定するために全地形車両に搭載された電気スプレー装置を使用していました。同様に、Swezey ら 5,35は （害虫とその天敵をマークするために有機栽培のイチゴフィールドに埋め込 まアルファルファトラップ作物（好ましい宿主植物）の行に鶏卵の白身の正確なアプリケーションを適用するためにバックパック噴霧器を使用しました
第二世代のマークキャプチャ手順の一部のユーザーは、お客様の特定の研究ニーズを満たすために多少元のプロシージャを変更しました。トンのボディタイプとサイズ彼は、その行動特性と一緒に、昆虫を標的に必要なマークの量と濃度を決定し、どのようにマークが37を投与されます。また、フィールド内の昆虫を奪還するために使用される方法は、これらの要因に左右されるだろう。現在までに、使用され、ほぼすべての方法（例えば、粘着トラップ、ネット、掃除をスイープ）昆虫を収集するためには、マークされた昆虫3,5,8,11,29,31,32,35,38を収集するために成功裏に使用されてきました。しかし、タンパク質検出ELISAの極端な感度のために、我々は細心の注意がマークされていない検体を収集またはソート処理38中に汚染にならないように注意しなければならないことを強調しています。
タンパク質マーキングシステム（ すなわち 、卵アルブミン、ミルクカゼイン、および大豆トリプシン阻害剤）の第二世代を説明した最初の研究11は、マーカーの種類によって異なる可能性があり、アッセイ感度に影響を与える要因を報告しました。具体的には、DIFを示しferentの水源、添加剤（界面活性剤）、およびELISAプレートであっても種類は、アッセイ（正または負のいずれかに）影響を受けるを使用していました。また、その研究とその後の研究37,39,40は、3つのタンパク質マーク検出アッセイは有効性が変化することを示しました。卵白マーカーが長く豆乳マーカーよりも長く保持されたミルクのマーカー、より保持されました。これらの結果は、前のフィールド調査に着手する任意の昆虫でのテストタンパク質マーク保持の重要性を強調しています。また、これらの第二世代の間接ELISAは、時には昆虫の特定のタイプ（例えば、草食動物）（PERS。OBS）とバックグラウンドノイズの低レベルを示しました。このバックグラウンドノイズは、上記の手順のステップ2.3.4および2.3.5ステップの間に30分間、ELISAプレートの各ウェルに（unpubl。データ）過酸化水素100μlを加えることによって減少させることができます。
これは、間接的ELISAは、第二世代のタンパク質マークを検出するために使用されることに留意すべきです試料緩衝液に浸した昆虫でタンパク質を検出するのに非常に効果的です。しかし、間接的なELISAは、昆虫に内部タンパク質マークや獲物タンパク質の検出にサンドイッチELISAと同様に有効ではありません。研究は、間接ELISA法をホモジナイズ昆虫試料34,41中のタンパク質を検出することで、サンドイッチELISA法ほど効率的ではないことを示しています。
いずれのELISAで考慮すべき重要な要因は、手順は、多くの場合、プレート間の変動42,43（検定実行の日々の効果に主に起因する）を示すことです。したがって、すべてのELISAプレートを含むことが必須である：（1）1種以上のTBSのみを陰性対照、（2）1つまたは複数のTBS +純粋なタンパク質陽性対照、および（3）少なくとも8個の陰性昆虫コントロール（ すなわち 、個人の既知のタンパク質マークを含みません）。 TBSのみ、TBS +タンパク質、および昆虫ネガティブコントロールはバッファがエラーの原因ではないことを保証する、試薬は、正常に動作していますndはそれぞれ、ELISA試薬と交差反応昆虫の任意のタンパク質が存在しないこと。また、昆虫ネガティブコントロールはELISA閾値（下記参照）を計算するために必須です。このデモに示すプレートのデザインは、各ELISAプレート（ 図1）上の7 TBSブランク、1タンパク質+（最初の列の）TBSポジティブコントロールと（最後の列）8ネガティブコントロールが含まれています。
ELISAデータを処理する際に考慮すべきもう一つの重要な因子は、タンパク質マークの有無を昆虫を獲得するために閾値を決定することです。もともとルビジウムでマークされた昆虫を採点するためStimmann 44によって提案された方法は、マークされていない昆虫プラスマークされていない個人の標準偏差の3倍のプール内のマーカーの平均レベルと定義しました。この方法はまた、タンパク質マーク9,17の存在について昆虫をスコアリングするための従来の方法として使用されています。しかし、いくつかのCASでES、研究者は直感的に偽陽性を得る可能性を減らすために、より保守的な閾値を選択しました。最も簡単な方法は、だけではなく、3 18,34の負の対照の平均に4〜6の標準偏差を追加することです。さらに、偽陽性を得る可能性を低減するためのより洗練された方法は、Sivakoff らによって提案された。12。この方法は、各ELISAプレート上の8つの負の制御昆虫の平均吸光度値を計算して、与えられた研究のELISAプレートの全てからプール陰性対照に基づいて標準偏差を計算することを伴います。
要約すると、節足動物をタグ付けするための信頼できる方法が最も分散の研究の成功に不可欠です。様々な方法は、過去20年間のタンパク質との節足動物をマークするために使用されています。タンパク質の免疫標識およびマークの検出は、複数の無数の比較的容易かつ安価であり、非常に適応可能ですtudies。免疫標識技術の将来のユーザは自分の方法論は、彼らの研究の詳細に適していることを確認する必要があります。マークが適用される濃度とマークのボリュームに必要とどのように標的種40の行動、ボディタイプやサイズなどの要因に依存します。
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Disclosures
本書の商号または市販製品の言及は、特定の情報を提供する目的のためだけであり、米国農務省による推薦または保証を意味するものではありません。 USDAは機会均等プロバイダーおよび雇用主です。
Acknowledgments
資金は、農業・食品産業技術総合研究イニシアティブ競争グラントノーにより、部分的には、米国農務省CRIS 5347-22620-021-00Dによって提供されました。食糧農業のUSDA国立研究所から2011-67009-30141。私たちは、ジョアンナナシフの技術サポートのために感謝しています。また、 図3で使用される写真のいくつかを提供するためのポール・ベイカー、デビッド・ホートン、ディエゴ・ニエト、とフランシスSivakoffに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
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