As proteínas são frequentemente usadas para marcar artrópodes para pesquisa de dispersão. Métodos para administrar marcas de proteínas internas e externas em artrópodes são demonstrados. Técnicas de detecção de marcas de proteínas, por meio de ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) indiretos ou sanduíche, também são ilustradas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.
Introdução
Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2.
....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção
- Procedimento de marcação interna
- Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas.
- Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 mg ml IgG frango / IgY, misture bem, e colocá-lo em outro recipiente.
Nota: Se o inseto de interesse não tem uma dieta artificial, a marca pode ser colocado so....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Marcação interna:
Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com a dieta.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de IgG / IgYs é que ele.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Recipiente de armazenamento de alimentos (para criação de insetos) | Rubbermaid / Tupperware | Vários tamanhos | Vários fabricantes e fornecedores. O tecido de malha é colado em uma janela |
| Nebulizador de pequeno volume (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Disponível online e em lojas de suprimentos médicos. Outras marcas também funcionarão. |
| Tubos de microcentrífuga, 1.6 ml com tampa | Produtos de Laboratório Continental | 4445.X | Qualquer tipo semelhante funcionará. Preferimos marcas que tenham tampas fáceis de abrir. |
| Caixa de armazenamento de isopor para tubos de microcentrífuga (grade 5x20) | RPI Corp. | 145746 | Este design é bom porque não sobrecarrega os tubos. |
| Dispensador, repetidor | Eppendorf | 4982000322 | Qualquer coisa semelhante ajudará a acelerar a dispensação. |
| Pilões, moedores de lenços descartáveis de plástico, 1,5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Disponível com vários fornecedores. Os pilões podem ser limpos e autoclavados para reutilização. |
| Placas BD Falcon ELISA, 96 poços (fundo plano) | Pipeta BD | 351172 | |
| Ovation, manual (20-200 µ l) | VistaLab | 1057-0200 ou 1070-0200 | Qualquer tipo semelhante funcionará. Este modelo é ergonômico. |
| Reservatórios, reagente estéril | VistaLab | 4054-1000 | Qualquer coisa semelhante funcionará. |
| Pipeta eletrônica, 8 canais (50-1.200 µ l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | Se você tivesse que escolher um modelo eletrônico, esse tamanho é mais útil. |
| Pipeta eletrônica, 8 canais (10-300 µ l) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Qualquer coisa semelhante funcionará. |
| Arruela de placa múltipla (8 posições, reta) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Qualquer coisa semelhante funcionará para a lavagem manual de pratos. |
| Leitor de microplacas com detecção de absorbância | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Qualquer coisa semelhante funcionará. |
| Frango IgG/IgY | Estados Unidos Biológico | I1903-15R | Também disponível de outras fontes |
| Claras de ovo | Mercearia | " Todos os brancos", " Batedores de ovos", etc. | Misture 5 ml com 95 ml de dH2O para solução a 5% |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L para fazer TBS |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L para fazer TBS e 8.0 g/ L para PBS |
| Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1,14 g/L para PBS |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0,2 g/L para PBS |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0,2 g/L para PBS |
| Tween 20, Grau EIA | Sigma-Aldrich | P1379 | Adicionar 0,5 ml por L ao PBS após a dissolução dos sais. |
| PBS com 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Misture 1 pacote em 1 L dH2O |
| Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira) anticorpo produzido em coelho (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µ l em 50 ml de Leite |
| Pó, Leite em Pó ou Fresco (1%) | Mercearia | Misture 10 g com 1 L dH2O para solução a 1% | |
| Anticorpo Anti-Frango IgY (IgG) (molécula inteira)-Peroxidase produzido em coelho (1:10.000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µ l em 1 L de leite a 1% |
| Anti-Ovo de Galinha Albumina anticorpo produzido em coelho (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µ l em 1 L PBS-BSA |
| Conjugado de Peroxidase IgG Anti-Coelho de Cabra (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Diluir 0,5 ml em 1 L PBS-BSA, depois adicionar 1,3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) copolímero de silício-poliéter | Lehle Seeds | VIS-01 | Adicionar como último ingrediente |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
Referências
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
