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Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Published: January 28, 2016
doi:
10.3791/53693
,
1USDA-ARS,Arid-Land Agricultural Research Center

Summary

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Abstract

Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.

Introduction

Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2.

A adequação de um marcador utilizado para qualquer dada pesquisa dispersão será dependente do tipo de estudo a ser conduzido. Há três grandes categorizações para a marcação artrópodes: (1) marca-release-recaptura (MRR), captura de marcação (2), e auto de captura-marcação-(3). Para a pesquisa marca de liberação e recaptura, o investigador normalmente marca os artrópodes coletivamente no laboratóry e libera-los em um ponto central no campo. Os artrópodes são então recapturado em vários intervalos espaciais e temporais, utilizando diferentes dispositivos de captação (por exemplo, rede de varredura, de vácuo, armadilha pegajosa) 3,4,5. Os espécimes recapturados são examinados para a marca específica para distinguir liberado de indivíduos nativos. Para a pesquisa de captura-marcação, o investigador geralmente se aplica a marca diretamente no campo usando equipamento de pulverização (por exemplo, pulverizador costal, lança e bico pulverizador). Os melhores marcadores para pesquisa captura-marcação são baratos e de fácil aplicação para o habitat do artrópode. Para a pesquisa de auto-captura marcação, o investigador geralmente se aplica a marcas de um artrópode bait 6,7 ou 8 ninho entrada. Por sua vez, o artrópode própria marca internamente por devorar a isca marcada ou externamente por "escovar" contra a marca à medida que sai do ninho.

Como mencionado acima, muitos tipos de marcadores têm sido nósed para marcar uma variedade de espécies de artrópodes. No entanto, muito poucos são úteis para todos os três destas categorias de investigação de dispersão. O desenvolvimento do processo de imunomarcação de proteínas foi um grande avanço para a marcação de insetos. Imunomarcação de proteínas coloca um rótulo em artrópodes interna ou externamente, que, por sua vez, é detectado através de um ensaio anti-proteína específica imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os primeiros marcadores de proteínas utilizadas foram tais imunoglobulina de coelho (IgG) e IgG de galinha / IgY 9,10. Eles provaram ser muito eficazes para marcas MRR e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Infelizmente, as proteínas IgG / IgY são caros e não são, portanto, prático para a investigação captura-marcação ea maioria dos tipos de pesquisa de auto-captura marcação. Subsequentemente, os testes ELISA de detecção de proteína de segunda geração foram desenvolvidos para proteínas contidas na clara do ovo de galinha (albumina), leite de vaca (caseína) e leite de soja (inibidor de tripsina de proteína). Cada ensaio é altamente sensível, específico, e, maisimportante, utiliza proteínas que são muito menos caros do que as proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas têm se mostrado eficazes para MRR, captura-marcação e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão).

Neste artigo, nós descrevemos e demonstrar como conduzir marca proteína estudos de retenção de laboratório. Tais estudos são a primeira fase da pesquisa necessária para qualquer tipo de estudo de campo de dispersão. Especificamente, é fundamental que os investigadores sabem quanto tempo a marca será mantida nas espécies de artrópodes segmentados antes de embarcar em estudos de dispersão de campo. Aqui, descrevemos e demonstrar como interna e externamente marcar insetos para MRR, captura-marcação e estudos tipo de campo auto-captura marca. Nós, então, demonstrar como detectar a presença das marcas com ELISAs indiretos e de sanduíche.

Protocol

1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção Procedimento de marcação interna Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas. Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 …

Representative Results

Marcação interna: Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com…

Discussion

O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de I…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.

Materials

Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window `
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876  1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH20
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 ul in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01
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Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).
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