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प्रशासन और प्रकीर्णन अनुसंधान के लिए Arthropods पर प्रोटीन मार्क्स का पता लगाने के

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

निगरानी सन्धिपाद आंदोलन अक्सर बेहतर जुड़े जनसंख्या गतिशीलता, प्रसार पैटर्न, मेजबान संयंत्र प्राथमिकताएं, और अन्य पारिस्थितिक बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है। Arthropods आमतौर पर एक अनूठी छाप के साथ उन्हें टैगिंग द्वारा प्रकृति में लगाया और फिर पुन: एकत्रित उनके प्रसार क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए समय और स्थान पर उन्हें कर रहे हैं। इस तरह के रंगीन धूल या रंग के रूप में वास्तविक भौतिक टैग, के अलावा, प्रोटीन के विभिन्न प्रकार के पारिस्थितिक अनुसंधान के लिए arthropods अंकन के लिए बहुत कारगर साबित किया है। प्रोटीन आंतरिक और / या बाह्य रूप से प्रशासित किया जा सकता है। प्रोटीन तो एक प्रोटीन विशेष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) के साथ पुनः कब्जा arthropods पर पता लगाया जा सकता है। यहाँ हम बाह्य और आंतरिक प्रोटीन के साथ arthropods टैगिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। दो सरल प्रयोगात्मक उदाहरण प्रदर्शन कर रहे हैं: topically एक एक प्रोटीन समृद्ध आहार और (2) एक बाहरी प्रोटीन निशान प्रदान करके एक कीट के लिए शुरू की (1) एक आंतरिक प्रोटीन निशानएक मेडिकल छिटकानेवाला का उपयोग कर एक कीट को pplied। हम तो सैंडविच और कीड़ों पर प्रोटीन के निशान का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया अप्रत्यक्ष एलिसा तरीकों में से एक कदम-दर-कदम गाइड से संबंधित हैं। इस प्रदर्शन में, मार्क-रिहाई-पीछे हटा, मार्क-कब्जा, और अनुसंधान के आत्म-मार्क-कब्जा प्रकार के लिए arthropods पर अधिग्रहण और प्रोटीन मार्कर का पता लगाने के विभिन्न पहलुओं immunomarking प्रक्रिया किया गया है कि विभिन्न तरीकों के साथ-साथ चर्चा कर रहे हैं अनुसंधान उद्देश्यों की एक विस्तृत विविधता के अनुरूप रूपांतरित किया।

Introduction

प्रकृति में सन्धिपाद कीट, प्राकृतिक दुश्मन (parasitoids और शिकारियों), और परागण की आवाजाही पर नज़र रखने के पारिस्थितिकी तंत्र सेवाओं में सुधार करने के लिए कैसे बेहतर समझ के लिए आवश्यक है। प्रसार अनुसंधान के सबसे प्रकार के लिए प्रमुख घटक ब्याज की सन्धिपाद (एस) टैग करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका हो रही है। सामग्री की एक किस्म (जैसे, पेंट, रंग, रंग धूल, टैग, दुर्लभ तत्व, प्रोटीन) व्यवहार, और अन्य पारिस्थितिक बातचीत 1,2 खिला, उनकी जनसंख्या गतिशीलता, प्रसार क्षमताओं का आकलन करने के लिए arthropods चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

किसी भी प्रसार अनुसंधान के लिए इस्तेमाल एक मार्कर के औचित्य अध्ययन के प्रकार का आयोजन किया जा रहा है पर निर्भर हो जाएगा। (1) मार्क-रिहाई-पीछे हटाना (एमआरआर), (2) मार्क-कब्जा, और (3) आत्म-मार्क-कब्जा: arthropods अंकन के लिए मोटे तौर पर तीन वर्गीकरण कर रहे हैं। मार्क-रिहाई-पीछे हटा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आम तौर पर laborato में सामूहिक arthropods के निशानry और क्षेत्र में एक केंद्रीय बिंदु पर विज्ञप्ति उन्हें। arthropods तो अलग संग्रह उपकरणों (जैसे, झाडू शुद्ध, निर्वात, चिपचिपा जाल) 3,4,5 का उपयोग कर विभिन्न स्थानिक और लौकिक अंतराल पर पुनः कब्जा कर रहे हैं। विशिष्ट निशान मूल निवासी व्यक्तियों से रिहा भेद करने के लिए पुनः कब्जा नमूनों तो जांच कर रहे हैं। मार्क-कब्जा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आमतौर पर क्षेत्र का उपयोग स्प्रे उपकरण (जैसे, बैग स्प्रेयर, उछाल और नोक स्प्रेयर) में सीधे निशान लागू होता है। मार्क-कब्जा अनुसंधान के लिए सबसे अच्छा मार्कर सस्ती और आसानी से सन्धिपाद के निवास स्थान के लिए लागू होते हैं। आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान के लिए, अन्वेषक आमतौर पर एक सन्धिपाद चारा 6.7 या घोंसला प्रवेश द्वार से 8 के निशान लागू होता है। बदले में, सन्धिपाद यह घोंसला बाहर निकलता है के रूप में मार्क के खिलाफ "brushing" द्वारा बाह्य उल्लेखनीय चारा या भक्षण द्वारा आंतरिक रूप से खुद को चिह्नित करता है।

जैसा कि ऊपर कहा, मार्कर के कई प्रकार हमें दिया गया हैएड सन्धिपाद प्रजाति की एक किस्म टैग करने के लिए। हालांकि, बहुत कुछ इन प्रसार अनुसंधान श्रेणियों के सभी तीन के लिए उपयोगी होते हैं। प्रोटीन immunomarking प्रक्रिया के विकास के कीड़ों को चिह्नित करने के लिए एक बड़ी सफलता थी। Immunomarking arthropods पर एक प्रोटीन लेबल डालता है या तो आंतरिक या बाह्य जो, बारी में, एक विरोधी प्रोटीन विशेष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) द्वारा पता चला है। इस्तेमाल पहली ऐसी प्रोटीन मार्कर खरगोश इम्युनोग्लोबुलिन (आईजीजी) और चिकन आईजीजी / IgY 9,10 थे। वे एमआरआर और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान (चर्चा देखें) के लिए बहुत प्रभावी निशान साबित हुई। दुर्भाग्य से, आईजीजी / IgY प्रोटीन महंगा कर रहे हैं और इसलिए निशान पर कब्जा अनुसंधान और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान के सबसे प्रकार के लिए व्यावहारिक नहीं हैं। इसके बाद दूसरी पीढ़ी के प्रोटीन का पता लगाने ELISAs चिकन अंडे का सफेद (एल्बुमिन), गाय के दूध (कैसिइन) और सोया दूध (trypsin अवरोध प्रोटीन) में निहित प्रोटीन के लिए विकसित किए गए। प्रत्येक परख, अत्यधिक संवेदनशील विशिष्ट है, और सबसे अधिकमहत्वपूर्ण बात है, बहुत कम खर्चीला आईजीजी / IgY प्रोटीन 11 से कर रहे हैं कि प्रोटीन का उपयोग करता है। ये प्रोटीन एमआरआर, मार्क कब्जा है, और आत्म-निशान पर कब्जा अनुसंधान (चर्चा देखें) के लिए प्रभावी सिद्ध कर दिया है।

इस अनुच्छेद में, हम का वर्णन है और प्रोटीन निशान प्रयोगशाला प्रतिधारण अध्ययन का संचालन करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। इस तरह के अध्ययन क्षेत्र प्रसार अध्ययन के किसी भी प्रकार के लिए आवश्यक अनुसंधान के पहले चरण में हैं। जांचकर्ताओं के निशान से पहले क्षेत्र प्रसार के अध्ययन पर तैयार करने का लक्ष्य रखा सन्धिपाद प्रजातियों पर बनाए रखा जाएगा कि कितनी देर तक पता है कि विशेष रूप से, यह महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम का वर्णन है और आंतरिक और बाह्य एमआरआर के लिए कीड़े, मार्क-कब्जा, और आत्म-मार्क-कब्जा प्रकार के अध्ययन के क्षेत्र चिह्नित करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है। हम तो अप्रत्यक्ष और सैंडविच ELISAs साथ निशान की उपस्थिति का पता लगाने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।

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Protocol

1. आंतरिक मार्क, प्रतिधारण, और जांच प्रक्रिया

  1. आंतरिक अंकन प्रक्रिया
    1. एक कृत्रिम आहार पर या क्षेत्र से पाला एक प्रयोगशाला कॉलोनी से (एन 100 व्यक्तियों ≈) ब्याज की कीड़ों लीजिए और दो ​​स्वच्छ पालन कंटेनरों में विभाजित करते हैं।
    2. कंटेनरों में से एक में एक नियमित रूप से 20 मिलीलीटर आहार पैकेट (अगोचर नकारात्मक नियंत्रण उपचार) रखें। एक 1.0 मिलीग्राम / एमएल चिकन आईजीजी / IgY समाधान के 1.0 मिलीलीटर के साथ एक दूसरे 20 मिलीलीटर कृत्रिम आहार पैकेट अनुपूरक मिश्रण अच्छी तरह से, और अन्य कंटेनर में जगह है।
      नोट: ब्याज की कीट एक कृत्रिम आहार की जरूरत नहीं होती है, तो निशान पर या वे सामान्य रूप से (उदाहरण के लिए, हरी फलियों, कीट अंडे, पानी, चीनी, शहद) पर निरंतर कर रहे हैं जो कुछ भी भोजन में रखा जा सकता है।
    3. कीड़ों 24 घंटे के लिए उनके खिला गतिविधि फिर से शुरू करने की अनुमति दें।
  2. आंतरिक निशान प्रतिधारण प्रक्रिया
    1. प्रत्येक कंटेनर से आहार के पैकेट निकालें और डब्ल्यू कीड़ों की आपूर्तिएक और खाद्य स्रोत ith प्रयोग (जैसे, हरी बीन्स) की अवधि से अधिक उन्हें बनाए रखने के लिए।
    2. दैनिक (या किसी भी वांछित समय अंतराल पर) प्रत्येक उपचार से कीड़े की एक पलटन (एन = 20) लीजिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत फ्रीज।
  3. सैंडविच एलिसा प्रक्रिया
    1. एक पतला खरगोश विरोधी चिकन IgY प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें: Tris में 500 एक साफ एलिसा microplate के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए खारा (टीबीएस) बफर और आर टी (नोट पर 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए सेते हैं: microplates भी incubated किया जा सकता हे / एन) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. थाली से एंटीबॉडी त्यागें और 30 मिनट के लिए एक 1.0% गैर वसा शुष्क दूध समाधान के 300 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक ब्लॉक।
    3. पिछले ऊष्मायन कदम के लिए इंतजार करते हुए, टीबीएस के 1.0 मिलीलीटर के साथ व्यक्तिगत रूप से 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जमे हुए कीड़े जगह है।
    4. अच्छी तरह से homogenized तक एक साफ मूसल के साथ प्रत्येक कीट पीस लें और एलिसा के एक व्यक्ति को अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक नमूने की एक 100 μl जोड़नेथाली। नमूने 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते दें।
    5. प्रत्येक एलिसा थाली के पहले कॉलम में कुओं के लिए 100 (टीबीएस में अंडे का सफेद) नकारात्मक (टीबीएस केवल) और सकारात्मक का μl नियंत्रण जोड़ें। इसके अलावा, प्रत्येक प्लेट (चित्रा 1) के अंतिम स्तंभ में 8 कुओं के लिए नकारात्मक कीट नियंत्रण (अगोचर कीड़े) के 100 μl जोड़ें। नियंत्रण के नमूने 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते दें। चित्रा 1 में प्रदान टेम्पलेट हम हमारे मानकीकृत assays के लिए उपयोग टेम्पलेट है कि ध्यान दें। कुओं में नमूने के स्थान के शोधकर्ता के विवेक पर निर्भर है।
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) -tween के साथ तीन बार धो लें और फिर खरगोश विरोधी चिकन आईजीजी / IgY हॉर्सरैडिश peroxidase एक पतला साथ संयुग्मित के 50 μl जोड़ें: 10,000 1 में% दूध समाधान और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    7. पीबीएस के बीच के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक तीन बार धो लें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें।
    8. 10 मिनट के बाद, कुओं पढ़ा650 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर सेट एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ।

आकृति 1
चित्रा 1. एक ठेठ 96 के लिए इस्तेमाल किया मानकीकृत अच्छी तरह पदनाम दिखा एक योजनाबद्ध आरेख अच्छी तरह एलिसा microplate। प्रत्येक प्लेट एक सकारात्मक प्रोटीन नियंत्रण (पीओएस Ctrl) के लिए एक अच्छी तरह से समर्पित Tris बफर खारा नकारात्मक नियंत्रण के लिए समर्पित 7 कुओं (टीबीएस), शामिल हैं, अगोचर (नकारात्मक) कीट नियंत्रण के लिए समर्पित पुनः कब्जा कीड़े (नमूना 1 ... 80), और 8 कुओं को समर्पित 80 अलग-अलग कुओं (Neg Ctrl 1 ... 8)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. बाहरी मार्क, प्रतिधारण, और जांच प्रक्रिया

  1. बाहरी अंकन प्रक्रिया
    1. ब्याज की कीड़ों लीजिए (एन 100 ≈एक 2.5 सेमी व्यास छेद के साथ एक प्रयोगशाला कॉलोनी से या दो 1.0 एल प्लास्टिक के कंटेनर में क्षेत्र और जगह से व्यक्तियों) प्रत्येक कंटेनर की ओर से बाहर मुक्का मारा।
    2. एक मेडिकल छिटकानेवाला का उपयोग कर DH 2 ओ (नकारात्मक नियंत्रण उपचार) के 1.0 मिलीलीटर के साथ पहले कंटेनर में कीड़ों का छिड़काव करें। एक मेडिकल छिटकानेवाला का उपयोग करते हुए चिकन अंडे का सफेद का एक 5.0% समाधान के 1.0 मिलीलीटर के साथ दूसरे कंटेनर में कीड़ों का छिड़काव करें।
    3. एक मानक प्रयोगशाला हवा आउटलेट के लिए छिटकानेवाला की नली देते हैं और फिर कंटेनर की 2.5 सेमी होल में छिटकानेवाला के मुंह डालें। छिटकानेवाला एक भाप पैदा करता है तो जब तक, धीरे-धीरे हवा आउटलेट पर बारी।
    4. अंडे का सफेद समाधान (लगभग। 2-5 मिनट) तिरस्कृत कर दिया गया है जब तक (अंकन) छिड़काव जारी रखें।
    5. छिटकानेवाला निकालें और प्लास्टिक के कंटेनर के छेद में एक काग जगह है। समाधान पूरी तरह से सूख गया है, जब तक कीड़े आरटी पर खड़े करने की अनुमति दें।
  2. बाहरी निशान प्रतिधारण प्रक्रिया
    1. चिह्नित करने के लिए और अधिक जोखिम से बचने के लिए एक अलग से साफ पालन कंटेनर में शुष्क कीड़ों के प्रत्येक उपचार रखें।
    2. अध्ययन की अवधि से अधिक कीड़े को बनाए रखने के लिए स्वच्छ कंटेनर के लिए भोजन और पानी जोड़ें।
    3. दैनिक प्रत्येक उपचार से कीड़े की एक पलटन (एन = 20) लीजिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत फ्रीज।
  3. अप्रत्यक्ष एलिसा प्रक्रिया
    1. व्यक्तिगत रूप से 1.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जमे हुए कीड़ों की जगह और टीबीएस के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें।
    2. 120 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन सेट पर 1 घंटे के लिए नमूने लेना।
    3. चरण 1.3.5 में वर्णित के रूप में नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण जोड़ें।
    4. चित्रा 1 में दिखाया गया है भिगोने के बाद, एक नया 96 एलिसा प्लेट पर 80 नामित नमूना कुओं में से एक में प्रत्येक नमूने से एक 100 μl विभाज्य पिपेट नमूने आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते दें (नोट:। Microplates भी हो सकता है incubated हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर)।
    5. साथ कुओं तीन बार धोएंपीबीएस के बीच और फिर अच्छी तरह से 1% से प्रत्येक के लिए गोजातीय सीरम albumin (पीबीएस बीएसए) युक्त फॉस्फेट खारा बफर के 300 μl जोड़ें।
    6. आरटी पर 30 मिनट के बाद पीबीएस के बीच के साथ दो बार धो लें।
    7. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस बीएसए Silwet (0.05%) में 8000 और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं: 1 पतला खरगोश विरोधी अंडा एल्बुमिन प्राथमिक एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें।
    8. पीबीएस के बीच के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक तीन बार धो लें और फिर 1 पतला हॉर्सरैडिश peroxidase के साथ संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के 50 μl जोड़ें: आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस बीएसए Silwet (0.05%) में 2,000।
    9. पीबीएस के बीच के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक तीन बार धो लें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए TMB सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें।
    10. 10 मिनट के बाद, 650 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर सेट एक microplate स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कुओं पढ़ा।

3. डेटा विश्लेषण

  1. Fro जमा नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर मानक विचलन प्रत्येक एलिसा प्लेट पर 8 नकारात्मक नियंत्रण कीड़ों का मतलब absorbance के मूल्य की गणना और उसके बाद की गणनामीटर दिए गए अध्ययन में 12 की एलिसा प्लेटों के सभी।
  2. एक एलिसा सकारात्मक दहलीज मूल्य प्राप्त करने के लिए प्रत्येक एलिसा प्लेट के लिए प्राप्त मतलब करने के लिए छह बार जमा मानक विचलन जोड़ें। इस मूल्य के बराबर या अधिक से अधिक एक absorbance मूल्य उपज किसी भी कीट नमूना प्रोटीन निशान की उपस्थिति के लिए सकारात्मक माना जाता है।

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Representative Results

आंतरिक अंकन:

आंतरिक निशान प्रतिधारण परीक्षण के परिणामों चित्रा 2A में दिखाया जाता है। गणना एलिसा महत्वपूर्ण दहलीज मूल्य 0.054 था। कुल मिलाकर (सभी चार नमूना तिथियाँ संयुक्त), प्रोटीन के बिना इलाज कीड़े लगातार कम एलिसा मूल्यों (एक्स = 0.038 ± 0.002, एन = 80) मिले। इसके विपरीत, कीड़े के सभी प्रोटीन समृद्ध आहार लगातार मजबूत एलिसा मूल्यों (एक्स = 0.475 ± 0.221, एन = 80) झुकेंगे खिलाया।

बाहरी अंकन:

बाहरी निशान प्रतिधारण परीक्षण के परिणामों चित्रा 2 बी में दिखाया जाता है। गणना एलिसा महत्वपूर्ण दहलीज मूल्य 0.082 था। कुल मिलाकर, topically केवल पानी के साथ चिह्नित कीड़े लगातार कम एली झुकेंगेएसए मूल्यों (एक्स = 0.048 ± 0.007, एन = 80)। इसके विपरीत, topically अंडे का सफेद समाधान के साथ चिह्नित कीड़े के सभी लगातार मजबूत एलिसा मूल्यों (एक्स = 0.746 ± 0.232, एन = 80) मिले।

चित्र 2
चित्रा 2। मीन (± एसडी) एलिसा चिकन IgY और चिकन अंडे का सफेद (एल्बुमिन) के साथ बाहर से चिह्नित (बी) के कीड़ों के साथ आंतरिक रूप से चिह्नित (ए) कीड़ों के ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों। काले सलाखों मतलब ± एसडी एलिसा ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों से मिले रहे हैं अगोचर कीड़ों। प्रत्येक दैनिक प्रोटीन उपचार के लिए कीट नमूने का आकार 20 व्यक्तियों था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सन्धिपाद प्रोटीन immunomarking प्रक्रिया पहले एक सदी पहले 9 के लगभग एक चौथाई वर्णित किया गया था। तब से, प्रक्रिया दोनों आंतरिक और बाह्य प्रशासित आईजीजी / IgYs का उपयोग कर arthropods की एक विस्तृत विविधता का प्रसार पैटर्न का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। ये प्रोटीन इस प्रकार अब तक का परीक्षण कीट प्रजातियों की व्यापक विविधता के लिए दृढ़ मार्कर को साबित किया है। उपरोक्त के रूप में हालांकि, आईजीजी / IgYs प्रयोग करने के लिए प्रमुख सीमा वे बहुत महंगा हो रहा है। नतीजतन, आईजीजी / IgYs एमआरआर और कीड़ों के बड़े समूहों के लिए एक छोटी सी जगह में चिह्नित किया जा सकता है या निशान एक आहार या प्रलोभन में शामिल किया जा सकता है, जहां आत्म अंकन प्रकार के अध्ययन के लिए ही उपयोगी हैं। यहाँ, हम एक आंतरिक निशान चिकन आईजीजी / IgY के साथ समृद्ध एक कृत्रिम आहार कीट लक्ष्य खिला द्वारा प्रशासित किया जा सकता है कि कैसे एक साधारण प्रदर्शन प्रदान की है। बदले में, आईजीजी / IgY एक सैंडविच एलिसा का उपयोग करते हुए पाया गया। यह प्रणाली पहले से ही एक का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से फायदेमंद हो सकता हैस्वाभाविक रूप से अंडे में पाया आईजीजी / IgY का पता लगाने जाएगा परख के बाद से चिकन अंडे होता है कि आहार। इसके अलावा, आईजीजी / IgY प्रोटीन की छोटी मात्रा में (चित्रा 3) ऊपर वर्णित चिकित्सा छिटकानेवाला का उपयोग कर कीड़ों के लिए topically दिलाई जा सकती है। एक छिटकानेवाला पहले एमआरआर प्रकार अनुसंधान 3 के लिए खरगोश आईजीजी के साथ बड़े पैमाने पर निशान बहुत ही नाजुक और छोटे parasitoids करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तब से, अन्य तरीकों प्रसार अनुसंधान के लिए आर्थ्रोपोडा के आईजीजी / IgY निशान प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण के लिए, एक परफ्यूम की पिचकारी अन्य परजीवी प्रजाति 13,14 पर आईजीजी / IgY निशान लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। दूसरों को आंतरिक रूप से उन्हें खिलाने से विभिन्न कीटों में चिह्नित किया है (यानी, आत्म अंकन) खरगोश आईजीजी लेबल शहद 14,15 या चीनी पानी 16 (3B चित्रा)। अंत में, खरगोश आईजीजी (चित्रा 3 सी) के साथ गर्भवती थी कि दीमक को बेकर एट अल। 7 फेड गत्ता। वे baited भोजन किया जाता है के रूप में ये दीमक आसानी से स्वयं को चिह्नितसामान।

चित्र तीन
चित्रा 3। विभिन्न तरीकों से एक प्रोटीन निशान प्रशासन के लिए प्रयोग किया जाता है: (ए) नाजुक parasitoids एक खरगोश आईजीजी समृद्ध गत्ता पर खिला एक मेडिकल छिटकानेवाला का उपयोग करते हुए चिकन IgY, (बी) खरगोश आईजीजी समृद्ध शहद समाधान पर खिला एक परजीवी, (सी) दीमक के साथ चिह्नित किया जा रहा वे देशी कीड़े एक पारंपरिक ट्रैक्टर स्प्रे रिग, का उपयोग कर एक कपास क्षेत्र में दूध के साथ चिह्नित किया जा रहा एक छत्ता के प्रवेश द्वार, (ई) पर रखा एक ठोकरें डिवाइस (एफ के माध्यम से जाने के रूप में चारा, (डी) मधु मक्खियों सूखे दूध के साथ आत्म अंकन ) देशी कीड़े एक एटीवी, (जी) अल्फला की एक पट्टी में देशी कीड़ों पर मुहिम शुरू की एक बूम और नोजल स्प्रे डिवाइस के साथ चिकन अंडे गोरों के साथ चिह्नित किया जा रहा एक पीठ के साथ चिकन अंडे गोरों के साथ चिह्नित किया जा रहाअल्फला में पैक स्प्रे उपकरण, और (एच, आई) के मूल निवासी कीड़ों हवाई applicators का उपयोग करते हुए चिकन अंडे गोरों के साथ चिह्नित किया जा रहा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आईजीजी / IgY प्रोटीन सिर्फ कीट प्रसार के अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया। उन्होंने यह भी सन्धिपाद खाद्य श्रृंखला में पौष्टिकता लिंक पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Hagler और डूरंड 17 पहले चिह्नित शिकार भस्म कि शिकारियों पर एक आईजीजी / IgY विशेष सैंडविच पेट सामग्री एलिसा का आयोजन, बारी में, आईजीजी / IgY साथ शिकार अंकन की अवधारणा का प्रस्ताव है। यह शिकार-विशिष्ट एलिसा या पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का आयोजन तुलना में कम थकाऊ और महंगा है, क्योंकि इस तकनीक को हाल ही में पेट विश्लेषण शोधकर्ताओं के बीच लोकप्रियता हासिल की है आणविक पेट सामग्री का विश्लेषण टाइप (ध की समीक्षा के लिए Hagler 18 और Fournier एट अल। 19 देखनाई पेशेवरों और विभिन्न पेट परख तकनीक के विपक्ष)। पिछले एक दशक के भीतर, शिकार immunomarking तकनीक खरगोश आईजीजी चिह्नित कीट 18,20,21, कागज खाद्य स्रोत 22 आईजीजी इलाज एक खरगोश का उपयोग कर trophallaxis और दीमक कालोनियों में खिला रिश्ते, granivory पर कपास शिकारियों के खिला गतिविधि की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है खरगोश आईजीजी 23 के साथ चिह्नित आक्रामक सिंहपर्णी घास के बीज पर एक सन्धिपाद जमावड़ा के विभिन्न semiochemical उपचार 24 के अधीन भूखंडों में एकत्र आईजीजी चिह्नित टमाटर hornworms पर बग शिकार दरों, और आईजीजी / IgY चिह्नित सड़ा 25 पर शिकारी सफाई गतिविधि बदबू आ रही है।

प्रोटीन का पता लगाने अप्रत्यक्ष ELISAs की एक दूसरी पीढ़ी में एक दशक पहले लगभग विकसित किए गए। ये ELISAs ऐसे चिकन अंडे का सफेद में अंडा एल्बुमिन प्रोटीन, सोया दूध में सोया trypsin अवरोध प्रोटीन, और कैसिइन प्रोटीन के रूप में "मुस्तैद" खाद्य उत्पादों, में निहित प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए थेगोजातीय दूध में। दूसरी पीढ़ी के प्रोटीन immunomarkers एमआरआर, मार्क-कब्जा है और आत्म-निशान प्रकार के अनुसंधान के लिए उपयोगी सिद्ध कर दिया है। उदाहरण के लिए, इरविन एट अल। 26 यह संभव था कि इन मुस्तैद प्रोटीन के साथ नाजुक parasitoids topically चिह्नित करने के लिए कि पता चला है। इसके अलावा, Hagler एट अल। 8,27 से पता चला है कि मधु मक्खियों कर सकते हैं अंडे का सफेद और गोजातीय दूध सूखे पाउडर के साथ स्वयं का आंकड़ा एक छत्ता (चित्रा 3 डी) के प्रवेश द्वार पर रखा एक प्रोटीन निकालने की मशीन के माध्यम से वे बाहर निकलने के रूप में। शायद प्रोटीन का सबसे रचनात्मक इस्तेमाल के लिए एक विमान स्प्रेयर 28 का उपयोग करते हुए अंडे का सफेद के साथ गाय pats को निशाना शामिल अंकन। वे अपने पोटा संबंधी मंच से उभरा है और गाय पैट से बाहर निकल गया के रूप में बारी में, चेहरे मक्खी वयस्कों के एक स्व-मार्क हासिल कर ली।

दूसरी पीढ़ी के प्रोटीन immunomarkers की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता है कि वे जन मात्रा में और आईजीजी / IgY प्रोटीन 11 की लागत का एक अंश में आसानी से उपलब्ध हो जाता है। यह सुविधा फिरना पड़ता हैक्षेत्र में व्यापक निशान पर कब्जा प्रकार अनुसंधान का आयोजन किया जाता है जिस तरह olutionized। विशेष रूप से, जांचकर्ताओं को अब एक विश्वसनीय तरीका है पारंपरिक स्प्रे रिग उपकरण (3E चित्रा) की एक विस्तृत विविधता का उपयोग क्षेत्र में बहुत बड़े क्षेत्र में तेजी से और समान टैग आर्थ्रोपोडा के। उदाहरण के लिए, कीट कीड़े पोर्टेबल हाथ बंदूक प्रकार स्प्रेयर 29,30, ट्रैक्टर चालित Airblast स्प्रेयर 31,32, और स्किड स्प्रेयर 33 का उपयोग कर बगीचों और खेतों में सीधे चिह्नित किया गया है। होर्टन एट अल। 34 एक नाशपाती के बाग (चित्रा 3F) में एम्बेडेड कवर फसलों को कब्जे में कीड़ों के अंडे का सफेद के आवेदनों इंगित करने के लिए एक पूरे इलाके वाहन पर घुड़सवार एक बिजली स्प्रे डिवाइस का इस्तेमाल किया। इसी तरह, Swezey एट अल। 5,35 (एक कीट और उसके प्राकृतिक दुश्मनों को चिह्नित करने के लिए एक बवाल हो स्ट्राबेरी फील्ड में एम्बेडेड एक अल्फला जाल फसल (एक वरीय मेजबान संयंत्र) की पंक्तियों के लिए चिकन अंडे का सफेद की सटीक आवेदन पत्र लागू करने के लिए एक बैग स्प्रेयर का इस्तेमाल किया एट अल। 36 खिल अल्फला के 29 और 16 हेक्टेयर, क्रमशः (चित्रा 3H, मैं) को गोजातीय दूध और सफेद अंडे की एक प्रसारण आवेदन आवेदन किया। कि अध्ययन का उद्देश्य अल्फला में निवासी arthropods चिह्नित करने के लिए किया गया था, और उसके बाद, अल्फला (करने के लिए अतिसंवेदनशील एक फसल आसन्न कपास के खेतों में arthropods के प्रसार पैटर्न को ट्रैक करने के लिए, (एक प्रसार घटना स्पार्किंग) घास काटने के द्वारा काटा गया था के बाद कीट प्रजातियों)।

दूसरी पीढ़ी के निशान पर कब्जा प्रक्रिया के कुछ उपयोगकर्ताओं को कुछ हद तक उनकी विशिष्ट अनुसंधान की जरूरतों को पूरा करने के लिए मूल प्रक्रिया को संशोधित किया है। शरीर के प्रकार और टी के आकारउन्होंने कहा, कीट लक्षित अपने व्यवहार विशेषताओं के साथ-साथ, मात्रा और मार्क की एकाग्रता की जरूरत है और कैसे मार्क 37 प्रशासित किया जाता है हुक्म चलाना होगा। इसके अलावा, क्षेत्र में कीड़े हटा देना करने के लिए इस्तेमाल विधि इन कारकों पर आकस्मिक हो जाएगा। तिथि करने के लिए, लगभग हर विधि (जैसे, चिपचिपा जाल, झाडू जाल, वैक्युम) कीड़े इकट्ठा करने के लिए चिह्नित कीड़ों 3,5,8,11,29,31,32,35,38 इकट्ठा करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया प्रयोग किया जाता है। हालांकि, प्रोटीन का पता लगाने ELISAs के चरम संवेदनशीलता के कारण, हम महान देखभाल अगोचर नमूनों के संग्रह या छँटाई प्रक्रियाओं 38 के दौरान दूषित नहीं हो जाते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि जोर।

प्रोटीन का अंकन सिस्टम (यानी, अंडा एल्बुमिन, दूध कैसिइन, और सोया trypsin अवरोध) की दूसरी पीढ़ी में वर्णित है कि मूल अध्ययन 11 मार्कर के प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं परख संवेदनशीलता प्रभावित करने वाले कारकों की सूचना दी। विशेष रूप से, वे कहते हैं कि अलग से पता चलाअलग जल स्रोतों, योजक (surfactants), और एलिसा प्लेट का भी प्रकार के (या तो सकारात्मक या नकारात्मक) परख प्रभावित करते थे। इसके अलावा, कि अध्ययन और बाद में पढ़ाई 37,39,40 तीन प्रोटीन निशान का पता लगाने assays के प्रभावकारिता में भिन्न है कि पता चला है। अंडे का सफेद मार्कर अब सोया दूध मार्कर की तुलना में लंबे समय तक अपने पास रखा गया था, जो दूध मार्कर, की तुलना में बनाए रखा गया था। इन परिणामों से पहले क्षेत्र में अनुसंधान पर तैयार करने के लिए किसी भी कीट पर परीक्षण प्रोटीन निशान प्रतिधारण के महत्व पर प्रकाश डाला। इसके अलावा, इन दूसरी पीढ़ी के अप्रत्यक्ष ELISAs कभी कभी कुछ कीड़े के प्रकार (उदाहरण के लिए, शाकाहारी) के साथ पृष्ठभूमि शोर (pers। OBS) का स्तर कम दिखा। इस पृष्ठभूमि शोर ऊपर प्रोटोकॉल में कदम 2.3.4 और 2.3.5 चरण के बीच 30 मिनट के लिए एलिसा थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (unpubl। डेटा) हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 100 μl जोड़कर कम किया जा सकता है।

यह प्रयोग किया जाता अप्रत्यक्ष ELISAs दूसरी पीढ़ी के प्रोटीन के निशान का पता लगाने के लिए कि ध्यान दिया जाना चाहिएनमूना बफर में भिगो कीड़ों पर प्रोटीन का पता लगाने में बहुत प्रभावी रहे हैं। हालांकि, अप्रत्यक्ष ELISAs कीड़ों पर आंतरिक प्रोटीन के निशान या शिकार प्रोटीन का पता लगाने में सैंडविच एलिसा के रूप में प्रभावी नहीं हैं। अध्ययन अप्रत्यक्ष ELISAs homogenized कीट नमूने 34,41 में प्रोटीन का पता लगाने में सैंडविच ELISAs के रूप में कुशल नहीं हैं कि पता चला है।

किसी भी एलिसा के साथ विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक प्रक्रिया अक्सर प्लेट से प्लेट परिवर्तनशीलता 42,43 (एक परख चलाने के दिन के लिए दिन प्रभाव के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार ठहराया) से पता चलता है। इसलिए, यह हर एलिसा प्लेट भी शामिल है कि आवश्यक है: (1) एक या एक से अधिक टीबीएस केवल नकारात्मक नियंत्रण, (2) एक या एक से अधिक टीबीएस + शुद्ध प्रोटीन सकारात्मक नियंत्रण, और (3) कम से कम आठ नकारात्मक कीट नियंत्रण (यानी, व्यक्तियों ज्ञात ) एक प्रोटीन के निशान को रोकने के लिए नहीं। टीबीएस ही, टीबीएस + प्रोटीन, और कीट नकारात्मक नियंत्रण बफर त्रुटि के एक स्रोत नहीं है विश्वास दिलाता हूं कि, अभिकर्मकों, एक ठीक से काम कर रहे हैंएन डी क्रमश: एलिसा अभिकर्मकों के साथ प्रतिक्रिया पार कि कीट में किसी भी प्रोटीन वहाँ नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, कीट नकारात्मक नियंत्रण एलिसा दहलीज मूल्यों (देखें नीचे) की गणना के लिए आवश्यक हैं। इस प्रदर्शन में दिखाया प्लेट डिजाइन प्रत्येक एलिसा प्लेट पर 7 टीबीएस कारतूस, (पहले कॉलम में) 1 प्रोटीन + टीबीएस सकारात्मक नियंत्रण और (पिछले कॉलम में) आठ नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1) शामिल हैं।

एलिसा डेटा से निपटने के लिए एक प्रोटीन के निशान की उपस्थिति या अनुपस्थिति के लिए एक कीट स्कोर करने के लिए एक मूल्य सीमा निर्धारित करने के लिए है जब एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए। मूल रूप से रूबिडीयाम चिह्नित कीड़ों स्कोरिंग के लिए Stimmann 44 द्वारा प्रस्तावित विधि अगोचर कीड़ों प्लस अगोचर व्यक्तियों की तीन बार मानक विचलन का एक पूल में मार्कर का मतलब स्तर के रूप में परिभाषित किया गया था। इस विधि को भी प्रोटीन के निशान 9,17 की उपस्थिति के लिए कीड़ों स्कोरिंग के लिए पारंपरिक विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, कुछ कैस मेंतों, शोधकर्ताओं intuitively झूठी सकारात्मक प्राप्त करने की संभावना को कम करने के लिए और अधिक रूढ़िवादी दहलीज मूल्यों का चयन किया है। सबसे आसान तरीका बस के बजाय तीन 18,34 के नकारात्मक नियंत्रण का मतलब करने के लिए 4-6 मानक विचलन जोड़ने के लिए है। आगे झूठी सकारात्मक प्राप्त करने की संभावना को कम करने के लिए एक और अधिक परिष्कृत विधि Sivakoff एट अल। 12 द्वारा प्रस्तावित किया गया था। इस विधि प्रत्येक एलिसा प्लेट पर आठ नकारात्मक नियंत्रण कीड़ों का मतलब absorbance के मूल्य की गणना और फिर एक दिए गए अध्ययन की एलिसा प्लेटों के सभी से जमा नकारात्मक नियंत्रण के आधार पर मानक विचलन की गणना पर जोर देता।

सारांश में, arthropods टैग करने के लिए एक विश्वसनीय विधि सबसे प्रसार के अध्ययन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न तरीकों पिछले दो दशकों में प्रोटीन के साथ arthropods चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रोटीन immunomarking और निशान का पता लगाने के एस की एक बहुत बड़ी संख्या के लिए अपेक्षाकृत आसान है और सस्ती है और बहुत से निभा रहे हैंtudies। Immunomarking तकनीक का भविष्य उपयोगकर्ताओं को अपने कार्यप्रणाली उनके अनुसंधान की बारीकियों के लिए उपयुक्त है कि यह सुनिश्चित करना चाहिए। मार्क लागू किया जाता है एकाग्रता और मार्क की मात्रा की जरूरत है और कैसे लक्ष्य प्रजातियों 40 के व्यवहार, शरीर के प्रकार और आकार जैसे कारकों पर निर्भर करेगा।

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Disclosures

इस प्रकाशन में व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों का उल्लेख विशेष जानकारी उपलब्ध कराने के उद्देश्य के लिए पूरी तरह से है और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा सिफारिश या बेचान संकेत नहीं करता है। यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है।

Acknowledgments

अनुदान के कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान कोई द्वारा, भाग में, यूएसडीए क्रिस 5347-22620-021-00D द्वारा प्रदान किया गया था। खाद्य और कृषि के यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट से 2011-67009-30141। हम जोहन्ना Nassif के तकनीकी समर्थन के लिए आभारी हैं। हम यह भी चित्रा 3 में उपयोग किए गए चित्रों में से कुछ को उपलब्ध कराने के लिए पॉल बेकर, डेविड होर्टन, डिएगो Nieto, और फ्रांसिस Sivakoff धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

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प्रशासन और प्रकीर्णन अनुसंधान के लिए Arthropods पर प्रोटीन मार्क्स का पता लगाने के
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Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

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