JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Environment

Administrere og Detektering Protein Marks på Leddyr til Dispersal Forskning

Published: January 28, 2016
doi:
10.3791/53693
,
1USDA-ARS,Arid-Land Agricultural Research Center

Summary

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Abstract

Overvågning leddyr bevægelse er ofte nødvendigt for bedre at forstå tilknyttede populationsdynamik, spredning mønstre, host plante præferencer og andre økologiske interaktioner. Leddyr er normalt spores i naturen ved at mærke dem med en unik mark og derefter igen at indsamle dem over tid og rum til at bestemme deres spredning kapaciteter. Ud over egentlige fysiske mærker, såsom farvet støv eller maling, har forskellige typer af proteiner, vist sig meget effektivt til mærkning leddyr for økologisk forskning. Proteiner kan administreres internt og / eller eksternt. Proteinerne kan derefter påvises på genfangede leddyr med et protein-specifikt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Her beskriver vi protokoller til eksternt og internt tagging leddyr med protein. To enkle eksperimentelle eksempler er påvist: (1) en intern protein varemærke introduceret til et insekt ved at tilvejebringe en protein-beriget kost og (2) en ekstern protein mærket topisk enpplied til et insekt anvendelse af en medicinsk forstøver. Vi derefter relatere en trin-for-trin guide af sandwich og indirekte ELISA metoder, der anvendes til at påvise protein mærker på insekterne. I denne demonstration er forskellige aspekter af købet og detektion af proteinmarkører om leddyr for mark-release-generobringen, mark-opsamling, og selv-mark-capture typer forskning diskuteret, sammen med de forskellige måder at immunomarking procedure er blevet tilpasset til en lang række mål for forskning.

Introduction

Sporing af leddyr skadedyr, naturlige fjender (snyltehvepse og rovdyr), og bestøvere i naturen er afgørende for en bedre forståelse hvordan man kan forbedre økosystemtjenester. Det centrale element for de fleste typer af spredning forskningen er at have en pålidelig metode til at mærke den leddyr (r) af interesse. En række materialer (f.eks, maling, farvestoffer, farvede støv, tags, sjældne elementer, proteiner) er blevet anvendt til at markere leddyr at vurdere deres populationsdynamik, spredning kapaciteter, fodring adfærd og andre økologiske interaktioner 1,2.

Hensigtsmæssigheden af ​​en markør, der anvendes til en given spredning forskning vil være afhængig af, hvilken type undersøgelse, der skal foretages. Der er tre brede kategoriseringer til mærkning leddyr: (1) mark-release-genbeskatning (MRR), (2) mark-capture, og (3) selv-mark-capture. Varemærke-release-genbeskatning forskning, investigator typisk markerer leddyr kollektivt i laboratory og frigiver dem på et centralt punkt i marken. De leddyr derefter generobret på forskellige rumlige og tidsmæssige intervaller ved hjælp af forskellige strømaftagere (f.eks feje netto, vakuum, klæbrig fælde) 3,4,5. De genfangede prøver undersøges derefter for den specifikke mærke til at skelne frigivet fra indfødte individer. Varemærke-capture forskning, investigator normalt anvender mærket direkte i marken ved hjælp af sprøjteudstyr (fx rygsæk sprøjte, bom og dyse sprøjte). De bedste markører for mark-capture forskning er billige og let anvendes på leddyr levested. Til selv-mark-capture forskning, investigator regel gælder mærker til et leddyr agn 6,7 eller reden indgang 8. Til gengæld leddyr markerer sig internt ved at fortære den markerede lokkemad eller eksternt ved "børstning" op mod mærket, da det kommer ud af reden.

Som nævnt ovenfor har mange typer af markører været osed at mærke en række leddyrarter. Men meget få er nyttige for alle disse tre spredning forskning kategorier. Udviklingen af ​​proteinet immunomarking procedure var et stort gennembrud for mærkning insekter. Immunomarking sætter et protein etiket på leddyr enten internt eller eksternt, hvilket igen, detekteres af et anti-protein specifikt enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Den første af disse proteinmarkører anvendte var kanin immunoglobulin (IgG) og kylling IgG / IgY 9,10. De viste sig at være meget effektive karakterer for MRR og selv-mark-capture forskning (se diskussionen). Desværre, IgG / IgY proteiner er dyre og er derfor ikke praktisk for mark-capture forskning og de fleste typer af selv-mark-capture forskning. Efterfølgende blev andengenerations protein afsløring ELISA'er udviklet til proteiner i kylling æggehvider (albumin), komælk (kasein) og sojamælk (trypsininhibitor protein). Hvert assay er meget følsomt, specifikke og mestvigtigere, anvender proteiner, som er meget billigere end de IgG / IgY proteiner 11. Disse proteiner har vist sig effektive til MRR, mark-opsamling, og selv-mark-capture forskning (se diskussionen).

I denne artikel beskriver vi og demonstrere hvordan man fører protein mark laboratorium fastholdelse studier. Sådanne undersøgelser er den første fase af forskning er nødvendig for enhver form for felt spredning undersøgelse. Konkret er det afgørende, at efterforskerne ved, hvor længe mærket vil blive tilbageholdt på de målrettede leddyrarter før går i gang med undersøgelser felt spredning. Her vil vi beskrive og vise, hvordan man internt og eksternt markere insekter til MRR, mark-capture, og selvstændige mark-capture typen feltstudier. Vi derefter vise, hvordan til at påvise tilstedeværelsen af ​​mærkerne med indirekte og sandwich ELISA.

Protocol

1. Intern Mark, Retention, og Procedure Detection Intern censur procedure Saml insekter af interesse (n ≈ 100 personer) fra et laboratorium koloni opdrættet på en kunstig diæt eller fra marken og deler sig i to rene beholdere opdrætsmetoder. Placer en almindelig 20 ml kost pakken (umærket negativ kontrol behandling) i en af ​​beholderne. Supplement til en anden 20 ml kunstig kost pakke med 1,0 ml af en 1,0 mg / ml kylling IgG / IgY løsning, blandes grundigt, og læg den…

Representative Results

Intern censur: Resultaterne af det indre varemærke retentionstesten er vist i figur 2A. Den beregnede ELISA kritiske tærskelværdi var 0,054. Samlet (alle fire eksempeldatoer kombineret), insekter behandlet uden protein gav konsekvent lave ELISA-værdier (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omvendt har alle de insekter fodret med protein beriget kost gav konsekvent stærke…

Discussion

Den leddyr protein immunomarking procedure blev først beskrevet næsten et kvart århundrede siden 9. Siden da har den procedure, blevet tilpasset for at studere spredning mønstre af en bred vifte af leddyr hjælp både internt og eksternt administrerede IgG / IgYs. Disse proteiner har vist sig standhaftige markører for den brede vifte af testede hidtil insektarter. Som nævnt ovenfor, den største begrænsning for anvendelse af IgG / IgYs er imidlertid, at de er meget dyre. Derfor IgG / IgYs er kun nyttig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansieringen blev leveret af USDA CRIS 5347-22620-021-00D og til dels af Landbrug og Fødevarer Research Initiative Konkurrencedygtige Grant nej. 2011-67009-30141 fra USDA National Institute of Fødevarer og Jordbrug. Vi er taknemmelige for den tekniske support af Johanna Nassif. Vi takker også Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, og Frances Sivakoff for at levere nogle af billederne, der anvendes i figur 3.

Materials

Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window `
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876  1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH20
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 ul in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J.R., & Jackson, C.G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543, (2001).
  2. Lavandero, B.I., Wratten, S.E., Hagler, J.R., & Jervis, M.A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151, (2004).
  3. Hagler, J.R., Jackson, C.G., Henneberry, T.J., & Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675, (2002).
  4. Blackmer, J.L., Hagler, J.R., Simmons, G.S., & Henneberry, T.J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625, (2006).
  5. Swezey, S.L., Nieto, D.J., Hagler, J.R., Pickett, C.H., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778, (2013).
  6. Hagler, J.R., Baker, P.B., Marchosky, R., Machtley, S.A., Bellamy, D.E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220, (2009).
  7. Baker, P.B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Snyder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155, (2010).
  8. Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Machtley, S.A., & Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12, (2011).
  9. Hagler, J.R., Cohen, A.C., Bradley-Dunlop, D., & Enriquez, F.J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25, (1992).
  10. Hagler, J.R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086, (1997).
  11. Jones, V.P., Hagler, J.R., Brunner, J., Baker, C., & Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836, (2006).
  12. Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85, (2011).
  13. Hagler, J.R., & Jackson, C.G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016, (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53, (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., & Hagler J.R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306, (2000).
  16. Peck, S.L., & McQuate, G.T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731, (2004).
  17. Hagler, J.R., & Durand, C.M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265, (1994).
  18. Hagler, J.R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345, (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J.R., Daane, K., de Leòn, J., & Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640, (2008).
  20. Hagler, J.R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator–prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165, (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J.R., & Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206, (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., & Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182, (2007).
  23. Lundgren, J.G., Saska, P., & Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6) 1642-1652, (2013).
  24. Kelly, J.L., Hagler, J.R., & Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77, (2014).
  25. Zilnik, G. and Hagler, J.R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814, (2013).
  26. Irvin, N.A., Hagler, J.R., & Hoddle, M.S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12, (2011).
  27. Hagler, J.R., Mueller, S., Teuber, L.R., Van Deynze, A., & Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14, (2011).
  28. Peck, G.W., Ferguson, H.J., Jones, V.P., O'Neal, S.D., & Walsh, D.B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122, (2014).
  29. Boina, D.R., Meyer, W.L., Onagbola, E.O., & Stelinski, L.L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258, (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X.M.S., & Stelinski, L.L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10, (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J.R., Groves, R.L., Sisterson, M.S., Morse, J.G., & Johnson, M.W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289, (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. J. Appl. Entomol. (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A.L., & Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408, (2010).
  34. Horton, D.R., Jones, V.P., & Unruh, T.R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56, (2009).
  35. Swezey, S.L., Nieto, D.J., Pickett, C.H., Hagler, J.R., Bryer, J.A., & Machtley, S.A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369, (2014).
  36. Sivakoff, F.S., Rosenheim, J.A., & Hagler, J.R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303, (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., & Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171, (2012).
  38. Hagler, J.R., Machtley, S.A., & Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34, (2015).
  39. Hagler, J.R., & Jones, V.P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192, (2010).
  40. Hagler, J.R., Naranjo, S.E., Machtley, S.A., & Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782, (2014).
  41. Hagler, J.R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32, (1998).
  42. Clark, M.F., & Adams, A.N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483, (1977).
  43. Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press. Totowa, NJ, (2001).
  44. Stimmann, M.W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328, (1974).

Tags

Mark InsectsProtein MarkingDispersal ResearchInsect MigrationEnzyme-linked Immunosorbent AssayInsect Host Plant PreferencesInvasive Species SpreadDetection MethodNatural Habitat MarkingField ResearchersBig-eyed Bug PredatorsLygus Bug PestMarking MethodsELISA ProcedurePredator Gut Content
check_url/53693?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image