Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Administrere og Oppdager Protein Marks på Leddyr for Spredning Forskning

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

Overvåking arthropod bevegelse er ofte nødvendig for å bedre forstå forbundet populasjonsdynamikk, spredningsmønster, vertsplanten preferanser, og andre økologiske interaksjoner. Leddyr er vanligvis spores i naturen ved å merke dem med en unik mark og deretter samle dem over tid og rom til å bestemme deres spredningstakt. I tillegg til faktiske fysiske koder, slik som farget støv eller maling, ulike typer proteiner vist seg svært effektivt for merking leddyr for økologisk forskning. Proteiner kan administreres internt og / eller eksternt. Proteinene kan deretter bli detektert på inndekning av artropoder med et protein-spesifikke enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Her beskriver vi protokoller for eksternt og internt tagging leddyr med protein. To enkle eksperimentelle eksempler er vist: (1) en innvendig protein merket introdusert til et insekt ved å tilveiebringe et protein-anriket diett og (2) en ytre protein mark en topiskpplied til et insekt ved hjelp av en medisinsk forstøver. Vi forholder en steg-for-steg guide av sandwich og indirekte ELISA metoder som brukes til å påvise protein merker på insekter. I denne demonstrasjonen, er ulike aspekter av oppkjøpet og påvisning av protein markører på leddyr for mark-release-gjenfangst, mark-fangst, og selv-mark-fangst typer forskning diskutert, sammen med de ulike måter som immunomarking prosedyren har vært tilpasses et bredt spekter av forskningsmålene.

Introduction

Sporing bevegelsen av leddyr skadedyr, naturlige fiender (parasitter og predatorer) og pollinatorer i naturen er viktig for bedre forståelse hvordan du kan forbedre økosystemtjenester. Nøkkelen komponent for de fleste typer spredning forskning er å ha en pålitelig metode for å tagge leddyr (r) av interesse. En rekke materialer (f.eks, maling, fargestoffer, farget støv, tags, sjeldne elementer, proteiner) har blitt brukt til å markere leddyr for å vurdere deres populasjonsdynamikk, spredningstakt, fôring atferd, og andre økologiske interaksjoner 1,2.

Hensiktsmessigheten av en markør som brukes for en gitt sprednings forskning vil være avhengig av type studie blir utført. Det er tre store kategoriseringer for merking leddyr: (1) mark-release-gjenfangst (MRR), (2) mark-fangst, og (3) selv mark-fangst. For mark-release-gjenfangst forskning, undersøkeren vanligvis markerer leddyr kollektivt i laboratoriumry og frigjør dem på et sentralt punkt i feltet. Leddyr deretter gjenerobret på ulike romlige og tidsmessige intervaller ved hjelp av ulike innsamlings enheter (f.eks feie netto, vakuum, klebrig felle) 3,4,5. De gjenerobret prøvene blir deretter undersøkt for den spesifikke mark for å skille løslatt fra innfødte individer. For mark-fangst forskning, gjelder etterforsker vanligvis merket direkte i feltet med sprøyteutstyr (f.eks ryggsekk sprøyta, bom og dysen sprøyter). De beste markører for mark-fangst forskning er billig og lett brukes på leddyr habitat. For selv mark-fangst forskning, gjelder etterforsker vanligvis merker til en leddyr agn 6,7 eller reir inngang 8. I sin tur, arthropod markerer seg internt av fortærende merket agn eller eksternt ved "pusse" opp mot mark som det kommer ut av redet.

Som nevnt ovenfor, har mange typer av markører vært ossed å merke en rekke leddyr arter. Men svært få er nyttig for alle disse tre spredningsforsknings kategorier. Utviklingen av proteinet immunomarking prosedyren var et stort gjennombrudd for merking insekter. Immunomarking setter et protein merket med leddyr, enten internt eller eksternt, som, i sin tur, blir detektert ved hjelp av en anti-protein bestemt enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA). Den første slike proteinmarkører som ble brukt var kanin-immunoglobulin (IgG) og kylling IgG / IgY 9,10. De viste seg å være svært effektive karakterer for MRR og selv mark-fangst forskning (se omtale). Dessverre, IgG / IGY proteiner er kostbart og er derfor ikke praktisk for mark-fangst forskning og de fleste typer selv mark-fangst forskning. Deretter ble andre generasjon protein deteksjon ELISAer utviklet for proteiner som finnes i kylling eggehviter (albumin), kumelk (kasein) og soyamelk (trypsin inhibitor protein). Hver analyse er svært sensitive, spesifikke og de flesteviktigere, benytter proteiner som er mye rimeligere enn IgG / IgY proteiner 11. Disse proteinene har vist seg effektive for MRR, mark-fangst, og selv-mark-fangst forskning (se omtale).

I denne artikkelen vil vi beskrive og demonstrere hvordan gjennomføre protein mark laboratorium oppbevaring studier. Slike studier er den første fasen av forskning er nødvendig for alle typer felt spredning studien. Spesielt er det viktig at etterforskerne vet hvor lenge mark vil bli beholdt på målrettede leddyr arter før du tar fatt på feltet spredningsstudier. Her beskriver vi og demonstrere hvordan man internt og eksternt markere insekter for MRR, mark-fangst og selv-mark-fangst typen feltstudier. Vi viser hvordan du kan oppdage tilstedeværelsen av merkene med indirekte og sandwich ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Intern Mark, oppbevaring og Detection Prosedyre

  1. Intern merking prosedyre
    1. Samle insekter av interesse (n ≈ 100 personer) fra et laboratorium koloni oppdratt på en kunstig diett eller fra feltet og dele inn i to rene oppdretts beholdere.
    2. Plasser en vanlig 20 ml diett pakke (umerket negative kontrollbehandling) i en av beholderne. Supplere en andre 20 ml kunstig diett pakke med 1,0 ml av en 1,0 mg / ml kylling IgG / IgY løsning, bland godt, og legg den i en annen beholder.
      Merk: Hvis insekt interesse ikke har en kunstig diett, kan merket plasseres på eller i hvilken diett de normalt vedvarende på (for eksempel, grønne bønner, møll egg, vann, sukker, honning).
    3. Tillat insekter til å gjenoppta sine fôring aktivitet i 24 timer.
  2. Intern mark oppbevaring prosedyre
    1. Fjern slanke pakker fra hver container og leverer insekter wed en annen matkilde for å opprettholde dem i løpet av varigheten av forsøket (f.eks grønne bønner).
    2. Samle en kohort (n = 20) av insekter daglig (eller i en hvilken som helst ønsket tidsintervall) fra hver behandling og fryses umiddelbart ved -20 ° C.
  3. Sandwich ELISA prosedyren
    1. Tilsett 50 ul kanin-anti-kylling IgY primære antistoff fortynnet 1: 500 i Tris-bufret saltvann (TBS) til hver brønn i en ren ELISA mikroplate og inkuberes i minst 1 time ved romtemperatur (merk: mikroplatene kan også inkubert O / N ved 4 ° C).
    2. Kast antistoff fra platen og blokkere hver brønn med 300 ul av en 1,0% ikke-fet tørrmelk-løsning i 30 minutter.
    3. Mens du venter på de forrige ruge trinnene, plassere frosset insekter individuelt i 1,6 ml mikrosentrifugerør med 1,0 ml TBS.
    4. Grind hvert insekt med en ren stampe inntil grundig homogenisert og legge en 100 mL av hver prøve til en individuell godt av ELISAtallerken. La prøvene inkubert ved romtemperatur i 1 time.
    5. Tilsett 100 ul av negativ (bare TBS) og positive (eggehviter i TBS) kontroll til brønner i den første kolonnen av hver ELISA-plate. Også, tilsett 100 ul av insekt negative kontroller (umerkede insekter) til de 8 brønnene i den siste kolonnen i hver plate (figur 1). La kontrollprøver inkubert ved romtemperatur i 1 time. Legg merke til at malen gitt i figur 1 er malen vi bruker for våre standardiserte analyser. Plassering av prøvene i brønnene er opp til skjønn av forskeren.
    6. Vask hver brønn tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) Tween og deretter legge til 50 ul av kanin-anti-kylling-IgG / IgY konjugert med pepperrot-peroksidase fortynnet 1: 10000 i 1% melk-løsning og inkuberes i 1 time ved RT.
    7. Vask hver brønn tre ganger med PBS-tween og tilsett 50 ul av tetrametylbenzidin (TMB) substrat til hver brønn.
    8. Etter 10 min, lese brønnenemed en mikroplate-spektrofotometer innstilt på en bølgelengde på 650 nm.

Figur 1
Figur 1. Et skjematisk diagram som viser de standardiserte brønn betegnelser som benyttes for en vanlig 96-brønns mikroplate ELISA. Hver plate inneholder 7 brønner dedikert til Tris-bufret saltvann (TBS negative kontroller), en brønn som er dedikert til en positiv kontroll protein (Pos Ctrl), 80 individuelle brønner dedikert til inndekning av insekter (Eksempel 1 ... 80), og 8 brønner dedikert til umarkerte (negative) insekt kontroller (Neg Ctrl 1 ... 8). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Ekstern Mark, oppbevaring og Detection Prosedyre

  1. Ekstern merking prosedyre
    1. Samle insekter av interesse (n ≈ 100individer) fra en laboratoriekoloni eller fra feltet og sted i to 1,0 l plastbeholdere med et 2,5 cm diameter hull stanset ut av den side av hver beholder.
    2. Spray insekter i den første beholder med 1,0 ml dH 2 O (negativ kontroll behandling) ved hjelp av et medisinsk forstøvningsapparat. Spray insekter i den andre beholder sammen med 1,0 ml av en 5,0% løsning av kylling eggehviter ved hjelp av et medisinsk forstøvningsapparat.
    3. Fest slangen til forstøveren til en standard laboratorium luftuttaket og deretter sette munningen av forstøver inn i 2,5 cm hull i beholderen. Deretter slår du på luftuttaket gradvis inntil forstøver produserer en damp.
    4. Fortsett sprøyting (merking) til eggehvitene løsningen er utlevert (ca. 2-5 min).
    5. Fjern forstøver og plassere en kork i hullet i plastbeholder. Tillat insekter til å stå ved RT inntil oppløsningen har tørket helt.
  2. Ekstern mark oppbevaring prosedyre
    1. Plasser hver behandling av tørre insekter inn i en egen ren oppdretts beholder for å unngå ytterligere eksponering til merket.
    2. Legg til mat og vann til de rene beholdere for å opprettholde insekter over varigheten av studien.
    3. Samle en kohort (n = 20) av insekter fra hver behandling daglig og fryses umiddelbart ved -20 ° C.
  3. Indirekte ELISA prosedyren
    1. Plasser den frosne insekter individuelt i 1,6 ml mikrosentrifugerør og tilsett 1,0 ml TBS.
    2. Sug prøvene for en time på en orbital shaker sett ved 120 rpm.
    3. Legg negative og positive kontroller som beskrevet i trinn 1.3.5.
    4. Etter bløtlegging, pipette en 100 ul alikvot fra hver prøve til en av de 80 angitte prøvebrønner på en ny 96-brønners ELISA-plate som vist på figur 1 tillater prøvene inkuberes i 1 time ved RT (merk:. Mikroplatene kan også bli inkubert O / N ved 4 ° C).
    5. Vask brønnene tre ganger medPBS-tween og tilsett 300 ul av fosfatbufret saltvann inneholdende 1% bovint serumalbumin (PBS-BSA) til hver brønn.
    6. Etter 30 minutter ved romtemperatur vaskes to ganger med PBS-tween.
    7. Tilsett 50 ul kanin-anti-eggalbumin primære antistoff fortynnet 1: 8000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) til hver brønn og inkuberes i 1 time ved RT.
    8. Vask hver brønn tre ganger med PBS-tween og tilsett 50 ul av geit-anti-kanin-IgG konjugert med pepperrot-peroksidase fortynnet 1: 2000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) i 1 time ved RT.
    9. Vask hver brønn tre ganger med PBS-tween og tilsett 50 pl av TMB substrat til hver brønn.
    10. Etter 10 min, lese brønnene med en mikroplate-spektrofotometer innstilt på en bølgelengde på 650 nm.

3. Data Analysis

  1. Beregn middelverdien absorbansverdien av de 8 negative kontroll insekter på hver ELISA-plate og deretter beregne standardavviket basert på den samlede negative kontroller from alle ELISA-plater i en gitt studie 12.
  2. Legg seks ganger den samlede standardavviket til middelverdien oppnådd for hver ELISA-plate for å oppnå en ELISA positiv terskelverdi. Enhver insekt prøven som ga en absorbans-verdi lik eller større enn denne verdien antas å være positiv for nærvær av proteinet merket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intern merking:

Resultatene av den indre merket retensjonen test er vist i figur 2A. Den beregnede ELISA kritiske terskelverdi var 0,054. Totalt (alle fire eksempeldatoer kombinert), insekter behandlet uten protein ga konsekvent lave ELISA-verdier (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omvendt, alle insekter matet protein anriket diett ga gående sterke ELISA-verdier (X = 0,475 ± 0,221, n = 80).

Ekstern merking:

Resultatene av den ytre merket retensjonen test er vist i figur 2B. Den beregnede ELISA kritiske terskelverdi var 0,082. Totalt sett insekter lokalt merket med bare vann ga gjennomgående lav ELISA verdier (X = 0,048 ± 0,007, n = 80). Omvendt, alle insektene topisk merket med eggehviter løsningen ga gående sterke ELISA-verdier (X = 0,746 ± 0,232, n = 80).

Figur 2
Figur 2. Mean (± SD) ELISA optiske verdier tetthet av (A) insekter merket internt med kylling IgY og (B) insekter merket utvendig med kylling eggehviter (albumin). Svarte striper blir gjennomsnitt ± SD ELISA optisk tetthet verdier gitt av umerkede insekter. Insect utvalgsstørrelse for hver daglige protein behandling var 20 personer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den arthropod protein immunomarking prosedyren ble først beskrevet nesten et kvart århundre siden 9. Siden den gang har prosedyren blitt tilpasset til å studere spredningsmønstre et bredt utvalg av leddyr som bruker både internt og eksternt administreres IgG / IgYs. Disse proteinene har vist seg urokkelige markører for det brede spekter av insektarter som ble testet hittil. Imidlertid, som nevnt ovenfor, er den viktigste begrensning for bruk av IgG / IgYs at de er svært kostbart. Følgelig IgG / IgYs er bare nyttig for MRR og selv merking typen studier hvor store grupper av insekter kan merkes i en liten plass eller merkene kan bli innlemmet i en diett eller agn. Her, forutsatt at vi en enkel demonstrasjon av hvordan en indre merke kan bli administrert ved å mate målet insekt en kunstig diett anriket med kylling IgG / IgY. I sin tur, ble IgG / IgY detektert ved anvendelse av en sandwich ELISA. Dette systemet kan være spesielt fordelaktig for forskere som allerede bruker endiett som inneholder kylling egg siden analysen vil naturlig påvise IgG / IgY finnes i egg. I tillegg kan små mengder av IgG / IgY-protein administreres topisk til insektene ved hjelp av den medisinske forstøveren beskrevet ovenfor (figur 3A). En forstøver ble først brukt til masse mark svært delikat og små parasitoider med kanin IgG for MRR typen forskning tre. Siden da har andre metoder blitt brukt til å administrere IgG / IGY merkene til leddyr for spredning forskning. For eksempel har en parfyme atomizer blitt brukt til å søke IgG / IGY merker på andre parasitoid arter 13,14. Andre har internt preget ulike insekter ved å mate dem (dvs. selv merking) kanin IgG merket honning 14,15 eller sukkervann 16 (Figur 3B). Til slutt, Baker et al. 7 matet papp mot termitter som ble impregnert med kanin-IgG (figur 3C). Disse termitter lett selv merket som de inntatt agnet matstuffs.

Figur 3
Figur 3. Forskjellige metoder anvendes for å administrere et protein merket: (A) delikat parasitoider merkes med kylling IgY ved hjelp av et medisinsk forstøver, (B) en parasitoid mater på kanin-IgG-anriket honning oppløsning, (C) termitt mating på en kanin-IgG-anriket papp agn, (D) honningbier selv merking med tørrmelk som de går gjennom en dusting enhet plassert ved inngangen til en bikube, (E) innfødte insekter blir merket med melk i en bomull felt ved hjelp av en konvensjonell traktor spray riggen, (F ) innfødte insekter blir merket med kylling eggehvitene med en bom og munnstykke spray enhet montert på en ATV, (G) innfødte insekter i en stripe av alfalfa blir merket med kylling eggehvitene med en backpakke spray enhet, og (H, I) innfødte insekter i alfalfa merkes med kylling eggehviter bruker antenne applikatorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

IgG / IgY-proteiner har ikke bare vært anvendt for å studere insekt spredning. De har også blitt anvendt for å spore trofiske ledd i næringskjeden leddyr. Hagler og Durand 17 først foreslo begrepet merking byttedyr med IgG / IgY og i sin tur fører en IgG / IgY spesifikke sandwich-gut innhold ELISA på rovdyr som forbrukes det markerte byttedyr. Denne teknikken har nylig vunnet popularitet blant gut analyse forskere fordi det er mindre kjedelig og kostbart enn å gjennomføre byttedyr-spesifikke ELISA eller polymerase chain reaction (PCR) type molekylære gut innholdsanalyser (se Hagler 18 og Fournier et al. 19 for vurderinger av the fordeler og ulemper med de ulike gut analyseteknikker). Innenfor det siste tiåret, har byttet immunomarking teknikken blitt brukt til å identifisere fôring aktivitet av bomull rovdyr på kanin IgG-merket skadedyr 18,20,21, trophallaxis og fôringsforhold i termitt kolonier med en kanin IgG-behandlet papir matkilde 22 granivory av et leddyr samling på invasive løvetann ugressfrø merket med kanin IgG 23, stinker bug predasjonsrater på IgG-merkede tomat hornworms samlet i tomter som er utsatt for ulike semiochemical behandlinger 24, og predator scavenging aktivitet på IgG / IgY-merket åtsel 25.

En annen generasjon av protein gjenkjenning indirekte ELISA ble utviklet nesten et tiår siden. Disse ELISA ble utviklet spesielt for å detektere proteiner som finnes i "off-the-sokkel" matvarer, for eksempel egg albumin protein i kylling eggehviter, soya trypsininhibitor protein i soya melk og kasein proteini kumelk. Andre generasjon protein immunomarkers har vist seg nyttig for MRR, mark-fangst og selv mark typen forskning. For eksempel, Irvin 26 mfl. Viste at det var mulig å topically markere delikat parasitoider med disse off-the-sokkel proteiner. Videre Hagler et al. 8,27 viste at honningbier kan self-mark med eggehvite og storfe melke tørt pulver når de kommer ut gjennom et protein dispenseren plassert ved inngangen til en bikube (Figur 3D). Kanskje den mest kreative bruk av proteinet merkingen involvert målretting ku klapper med eggehvitene med en jet sprøyta 28. I sin tur, ansikt flue voksne kjøpte en selv mark som de dukket opp fra sin pupal scenen og avsluttet kua pat.

Den viktigste egenskap av andre generasjon protein immunomarkers er at de er lett tilgjengelige i masse mengder og til en brøkdel av kostnaden for IgG / IgY proteiner 11. Denne funksjonen har revolutionized veien området hele mark-Program forskningen er utført. Spesielt etterforskere har nå en pålitelig metode for å raskt og jevnt tag leddyr over store områder på feltet med et bredt utvalg av konvensjonell sprøyte riggutstyr (Figur 3E). For eksempel har skadeinsekter er merket direkte i frukthager og felt ved hjelp av bærbare hånd pistol sprøyte 29,30, traktor-drevet airblast sprøyter 31,32, og skli sprøyter 33. Horton et al. 34 brukes en elektrisk spray enhet montert på en all-terrain vehicle å finne anvendelser av eggehviter til insekter opptar dekkvekster innebygd i en pære frukthage (Figur 3F). Tilsvarende Swezey et al. 5,35 brukt en ryggsekk sprøyter for å bruke presise anvendelser av kylling eggehviter til rader med en alfalfa felle crop (en foretrukket vertsplanten) innebygd i en økologisk dyrket jordbær feltet for å markere en pest og dens naturlige fiender ( et al., 36 påført en kringkasting anvendelse av bovin melk og eggehvite til 29 og 16 ha av blomstringen alfalfa, henholdsvis (figur 3 H, I). Målet med denne studien var å markere bosatt leddyr i alfalfa, og deretter, etter at alfalfa ble høstet ved å klippe (sparking en spredning hendelse), for å spore spredningsmønstre leddyr i tilstøtende bomull felt (en avling utsatt for skadedyr).

Noen brukere av andregenerasjons mark-innfangingsprosedyren har endret den opprinnelige prosedyren noe for å møte deres spesifikke forskningsbehov. Kroppen type og størrelse på tHan målinsekt som, sammen med sine atferdsmessige kjennetegn, vil diktere mengden og konsentrasjonen av merket er nødvendig, og hvor merket administreres 37. Videre vil fremgangsmåten som brukes til å gjenskape insekter på området være avhengig av disse faktorene. Til dags dato, nesten hver metode som brukes (f.eks klebrige feller, feie garn, støvsugere) for å samle insekter har blitt brukt med hell til å samle merket insekter 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Men på grunn av de ekstreme sensitiviteten av proteindeteksjons ELISA, legger vi vekt på at stor forsiktighet må tas for å sikre at umerkede prøvene ikke blir forurenset under samlingen eller sorteringsprosesser 38.

Den opprinnelige studien 11 det som er beskrevet andre generasjon av proteinmerkesystemer (dvs. egg-albumin, melkekasein og soya-trypsininhibitor) rapporterte faktorer som påvirker analysesensitivitet kan variere blant de typene markør. Nærmere bestemt, viste de at diflige vannkilder, tilsetningsstoffer (tensider), og selv den type ELISA plate brukte påvirket (enten positivt eller negativt) analysen. Videre at studiet og senere studier 37,39,40 viste at de tre proteindeteksjons mark analyser varierer i effekt. Eggehviten markør ble holdt tilbake lenger enn melk markør, som ble opprettholdt i mer enn soyamelk markør. Disse resultatene markere betydningen av testing protein mark oppbevaring på en gitt insekt før du tar fatt på feltarbeid. Også disse andregenerasjons indirekte ELISA noen ganger viser et lavt nivå av bakgrunnsstøy med visse typer insekter (f.eks planteetere) (pers. Obs). Denne bakgrunnsstøy kan reduseres ved tilsetning av 100 ul av hydrogenperoksid til hver brønn av ELISA-platen i 30 minutter mellom trinn 2.3.4 og 2.3.5 trinn i protokollen ovenfor (unpubl. Data).

Det bør bemerkes at de indirekte ELISA anvendes for å påvise andre generasjons proteinmerkerer svært effektiv ved deteksjon av proteinet på insekter dyppet i prøvebufferen. Men de indirekte ELISA er ikke så effektiv som sandwich ELISA på å oppdage interne protein merker eller byttedyr proteiner på insekter. Studier har vist at indirekte ELISA er ikke så effektiv som sandwich-ELISA på å oppdage protein i homogenisinsektprøver 34,41.

En viktig faktor å vurdere med noen ELISA er at prosedyren viser ofte plate-til-plate (tilskrives hovedsakelig til dag-til-dag effektene av å kjøre en analyse) variabilitet 42,43. Derfor er det viktig at alle ELISA-plate omfatter: (1) en eller flere TBS bare negative kontroller, (2) en eller flere TBS + ren protein positive kontroller, og (3) minst åtte negative insekt kontroller (dvs. individer kjente ikke å inneholde et protein-merket). Den eneste TBS, TBS + protein, og insekt negative kontroller sikre at bufferen ikke er en kilde til feil, blir reagensene fungerer på riktig måte, ennd på at det ikke er noen proteiner i insekt som kryssreagerer med ELISA-reagenser, respektivt. Videre insekt negative kontroller er avgjørende for beregning av terskelverdier ELISA (se nedenfor). Den plate som er vist i denne demonstrasjonen inkluderte 7 TBS emner, en protein + TBS positiv kontroll (i den første kolonnen) og åtte negative kontroller (i siste kolonne) på hver ELISA-plate (figur 1).

En annen viktig faktor å vurdere ved håndtering av ELISA-data for å bestemme en terskelverdi for å score et insekt for tilstedeværelse eller fravær av et protein mark. Metoden opprinnelig foreslått av Stimmann 44 for å utføre rubidium-merket insekter ble definert som middelnivået markør i en pool av umerkede insekter pluss tre ganger standardavviket for de umerkede individer. Denne metoden har også blitt brukt som den konvensjonelle metode for å utføre insekter for nærværet av proteinmerker 9,17. Men i noen cases, har forskere intuitivt valgt flere konservative terskelverdier for å redusere sannsynligheten for å få falske positiver. Den enkleste metoden er å bare legge fire til seks standardavvik til gjennomsnittet av de negative kontroller i stedet for tre 18,34. En mer avansert metode for å ytterligere redusere sjansen for å få falske positiver ble foreslått av Sivakoff et al., 12. Denne metoden innebærer å beregne den midlere absorbansverdi for de åtte negative kontroll insekter på hver ELISA-plate og deretter beregne standardavviket basert på de samlede negative kontroller fra alle ELISA-plater i en gitt undersøkelse.

Oppsummert er en pålitelig metode for å tagge leddyr avgjørende for å lykkes i de fleste spredningsstudier. Forskjellige fremgangsmåter har vært brukt til å merke artropoder med proteiner i løpet av de siste to tiårene. Protein immunomarking og påvisning av merkene er relativt enkelt og billig og meget tilpasningsdyktige til en myriade av studies. Fremtidige brukere av immunomarking teknikken bør sørge for at deres metode er egnet til detaljene i sin forskning. Konsentrasjonen og volumet av merket nødvendig og hvordan merket er brukt vil avhenge av faktorer som atferd, kroppstype og størrelse på målarten 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Omtale av varemerker eller kommersielle produkter i denne publikasjonen er utelukkende for det formål å gi spesifikk informasjon og innebærer ikke en anbefaling eller godkjenning av US Department of Agriculture. USDA er en lik mulighet leverandør og arbeidsgiver.

Acknowledgments

Finansieringen ble levert av USDA CRIS 5347-22620-021-00D og dels ved Landbruks- og matdepartementet Forskningsinitiativet Competitive Grant no. 2011-67009-30141 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Vi er takknemlige for den tekniske støtten fra Johanna Nassif. Vi takker også Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, og Frances Sivakoff for å gi noen av bildene som brukes i Figur 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Tags

Environmental Sciences Immunomarking insekt ELISA mark-fangst mark-release-gjenfangst self-mark
Administrere og Oppdager Protein Marks på Leddyr for Spredning Forskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter