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Administrando e Detecção de Marcas de proteína em artrópodes para a dispersão de Pesquisa

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

Monitoramento movimento artrópode é muitas vezes necessária para entender melhor a dinâmica da população, associados padrões de dispersão, preferências de planta hospedeira, e outras interações ecológicas. Artrópodes são geralmente acompanhados na natureza por marcá-los com uma marca única e, em seguida, re-coleta-los ao longo do tempo e espaço para determinar as suas capacidades de dispersão. Além de marcas físicas reais, tais como pó de cor ou tinta, vários tipos de proteínas têm se mostrado muito eficaz para a marcação de artrópodes para a investigação ecológica. As proteínas podem ser administrados internamente e / ou externamente. As proteínas podem então ser detectados em artrópodes recapturados com um enzyme-linked immunosorbent assay específico para a proteína (ELISA). Aqui nós descrevemos protocolos para marcação externa e internamente artrópodes com a proteína. Dois exemplos experimentais simples são demonstradas: (1) uma proteína de marca interna introduzida para um insecto, proporcionando uma dieta enriquecida em proteína e (2) uma marca de proteína externa um topicamentepplied para um insecto usando um nebulizador médico. Nós, então, relacionar um guia passo-a-passo do sanduíche e métodos indiretos de ELISA utilizados para detectar marcas de proteína sobre os insetos. Nesta demonstração, são discutidos vários aspectos da aquisição e detecção de marcadores de proteína em artrópodes para marca-release-recaptura, captura-marcação, e os tipos de auto de captura de marca-de investigação, juntamente com as várias maneiras que o procedimento imunomarcação tem sido adaptado para atender a uma ampla variedade de objectivos de investigação.

Introduction

Acompanhando o movimento de pragas de artrópodes, inimigos naturais (parasitóides e predadores), e polinizadores na natureza é essencial para compreender melhor como para melhorar os serviços ecossistêmicos. O componente-chave para a maioria dos tipos de pesquisa dispersão é ter um método confiável para marcar o artrópode (s) de interesse. Uma variedade de materiais (por exemplo, tintas, corantes, pós coloridos, tags, elementos raros, proteínas) têm sido utilizados para marcar os artrópodes para avaliar sua dinâmica populacional, capacidades de dispersão, alimentando comportamentos, e outras interações ecológicas 1,2.

A adequação de um marcador utilizado para qualquer dada pesquisa dispersão será dependente do tipo de estudo a ser conduzido. Há três grandes categorizações para a marcação artrópodes: (1) marca-release-recaptura (MRR), captura de marcação (2), e auto de captura-marcação-(3). Para a pesquisa marca de liberação e recaptura, o investigador normalmente marca os artrópodes coletivamente no laboratóry e libera-los em um ponto central no campo. Os artrópodes são então recapturado em vários intervalos espaciais e temporais, utilizando diferentes dispositivos de captação (por exemplo, rede de varredura, de vácuo, armadilha pegajosa) 3,4,5. Os espécimes recapturados são examinados para a marca específica para distinguir liberado de indivíduos nativos. Para a pesquisa de captura-marcação, o investigador geralmente se aplica a marca diretamente no campo usando equipamento de pulverização (por exemplo, pulverizador costal, lança e bico pulverizador). Os melhores marcadores para pesquisa captura-marcação são baratos e de fácil aplicação para o habitat do artrópode. Para a pesquisa de auto-captura marcação, o investigador geralmente se aplica a marcas de um artrópode bait 6,7 ou 8 ninho entrada. Por sua vez, o artrópode própria marca internamente por devorar a isca marcada ou externamente por "escovar" contra a marca à medida que sai do ninho.

Como mencionado acima, muitos tipos de marcadores têm sido nósed para marcar uma variedade de espécies de artrópodes. No entanto, muito poucos são úteis para todos os três destas categorias de investigação de dispersão. O desenvolvimento do processo de imunomarcação de proteínas foi um grande avanço para a marcação de insetos. Imunomarcação de proteínas coloca um rótulo em artrópodes interna ou externamente, que, por sua vez, é detectado através de um ensaio anti-proteína específica imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Os primeiros marcadores de proteínas utilizadas foram tais imunoglobulina de coelho (IgG) e IgG de galinha / IgY 9,10. Eles provaram ser muito eficazes para marcas MRR e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão). Infelizmente, as proteínas IgG / IgY são caros e não são, portanto, prático para a investigação captura-marcação ea maioria dos tipos de pesquisa de auto-captura marcação. Subsequentemente, os testes ELISA de detecção de proteína de segunda geração foram desenvolvidos para proteínas contidas na clara do ovo de galinha (albumina), leite de vaca (caseína) e leite de soja (inibidor de tripsina de proteína). Cada ensaio é altamente sensível, específico, e, maisimportante, utiliza proteínas que são muito menos caros do que as proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas têm se mostrado eficazes para MRR, captura-marcação e pesquisa de auto-captura marcação (ver discussão).

Neste artigo, nós descrevemos e demonstrar como conduzir marca proteína estudos de retenção de laboratório. Tais estudos são a primeira fase da pesquisa necessária para qualquer tipo de estudo de campo de dispersão. Especificamente, é fundamental que os investigadores sabem quanto tempo a marca será mantida nas espécies de artrópodes segmentados antes de embarcar em estudos de dispersão de campo. Aqui, descrevemos e demonstrar como interna e externamente marcar insetos para MRR, captura-marcação e estudos tipo de campo auto-captura marca. Nós, então, demonstrar como detectar a presença das marcas com ELISAs indiretos e de sanduíche.

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Protocol

1. Mark Interno, retenção e procedimento de detecção

  1. Procedimento de marcação interna
    1. Coletar insetos de interesse (n ≈ 100 indivíduos) de uma colônia de laboratório criados em dieta artificial ou a partir do campo e dividir em dois recipientes de criação limpas.
    2. Colocar 20 ml de uma dieta regular de pacotes (tratamento de controlo negativo não marcado) para um dos recipientes. Completar um segundo pacote de 20 ml de dieta artificial com 1,0 ml de uma solução / 1,0 mg ml IgG frango / IgY, misture bem, e colocá-lo em outro recipiente.
      Nota: Se o inseto de interesse não tem uma dieta artificial, a marca pode ser colocado sobre ou em qualquer dieta que eles são normalmente sustentada em (por exemplo, feijão verde, ovos da traça, água, açúcar, mel).
    3. Permitir que os insetos para retomar sua atividade alimentar durante 24 h.
  2. Procedimento de retenção de marca Interno
    1. Remova os pacotes de dieta de cada recipiente e fornecer os insetos wom outra fonte de alimento para mantê-las ao longo da duração da experiência (por exemplo, feijão verde).
    2. Recolha uma coorte (n = 20) de insectos por dia (ou em qualquer intervalo de tempo desejado) a partir de cada tratamento e congelar imediatamente a -20 ° C.
  3. Sanduíche procedimento ELISA
    1. Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-galinha IgY anticorpo primário diluído 1: 500 em tampão salino Tris (TBS) a cada poço de uma microplaca de ELISA limpo e incubar durante um mínimo de 1 hora à TA (nota: as microplacas também podem ser incubadas ó / N a 4 ° C).
    2. Descartar o anticorpo a partir da placa e bloquear cada cavidade com 300 uL de uma solução não gorda de leite seco a 1,0% durante 30 min.
    3. Enquanto espera para as etapas de incubação anteriores, colocar insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga com 1,0 ml de TBS.
    4. Moer cada insecto com um pilão limpa até completamente homogeneizada e adicionar 100 ul de cada amostra para um poço individual do ELISAprato. Deixar as amostras a incubar à TA durante 1 h.
    5. Adicionar 100 ul de negativo (TBS apenas) e positivos (clara de ovo em TBS) a poços de controlo na primeira coluna de cada placa de ELISA. Além disso, adicionar 100 ul de controlos negativos (insectos insectos não marcado) para os 8 poços na última coluna de cada placa (Figura 1). Permitir que as amostras de controlo a incubar à TA durante 1 h. Note-se que o molde fornecido na Figura 1 é o modelo que usamos para os nossos ensaios padronizados. A colocação das amostras nos poços é a critério do investigador.
    6. Lavar cada poço três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida, adicionar Tween 50 ul de anticorpo de coelho anti-IgG de galinha / IgY conjugado com peroxidase diluído a 1: 10000 em solução de leite a 1% e incubar durante 1 h à TA.
    7. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço.
    8. Após 10 min, ler os poçoscom um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm.

figura 1
Figura 1. Um diagrama esquemático que mostra as designações bem padronizados usados ​​para um típico de 96 cavidades de microplacas ELISA. Cada placa contém 7 poços dedicados a controlos negativos de solução salina tamponada com Tris (TBS), uma bem dedicados a um controlo positivo proteína (Pos Ctrl), 80 poços individuais dedicados a insetos recapturados (Amostra 1 ... 80), e 8 poços dedicados a não marcados (negativos) controles de insetos (Ctrl Neg 1 ... 8). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Mark Externo, Retenção, e procedimento de detecção

  1. Procedimento de marcação externo
    1. Coletar insetos de interesse (n ≈ 100indivíduos) de uma colônia de laboratório ou de campo e local em dois recipientes de plástico 1,0 L com um buraco de diâmetro 2,5 centímetros socou para fora do lado de cada recipiente.
    2. Pulverizar os insectos no primeiro recipiente com 1,0 ml de dH 2 O (tratamento de controlo negativo), utilizando um nebulizador médico. Pulverizar os insectos no segundo recipiente com 1,0 ml de uma solução 5.0% de clara de ovo de galinha utilizando um nebulizador médico.
    3. Prenda a mangueira do nebulizador a uma tomada de ar do laboratório padrão e, em seguida, inserir a boca do nebulizador para o 2,5 centímetros buraco do recipiente. Em seguida, ligue a saída de ar gradualmente até o nebulizador produz um vapor.
    4. Continue a pulverização (marcação) até a solução clara de ovo foi dispensado (aprox. 2-5 min).
    5. Remover o nebulizador e colocar uma rolha no orifício do recipiente de plástico. Permitir que os insetos para se situar em temperatura ambiente, até a solução secar completamente.
  2. Procedimento de retenção de marca externa
    1. Coloque cada tratamento dos insetos secos em um recipiente limpo criação separado para evitar mais exposição para a marca.
    2. Adicionar água e comida para os recipientes limpos para sustentar os insectos ao longo da duração do estudo.
    3. Recolha uma coorte (n = 20) de insectos a partir de cada tratamento diariamente e congelar imediatamente a -20 ° C.
  3. Procedimento ELISA indireto
    1. Coloque os insetos congelados individualmente em 1,6 mL tubos de microcentrífuga e adicionar 1,0 ml de TBS.
    2. Mergulhe as amostras para 1 hora em um conjunto agitador orbital a 120 rpm.
    3. Adicionar controlos negativos e positivos, tal como descrito no Passo 1.3.5.
    4. Após a imersão, pipetar uma aliquota de 100 ul de cada amostra para um dos 80 poços de amostra designado numa nova placa de 96 poços de ELISA tal como mostrado na Figura 1 Permitir que as amostras a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente. (Nota: as microplacas também pode ser incubadas O / N a 4 ° C).
    5. Lavar os poços três vezes comPBS-Tween e depois adicionar 300 ul de solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de albumina de soro bovino (PBS-BSA) a cada poço.
    6. Após 30 min à TA, lavar duas vezes com PBS-Tween.
    7. Adicionar 50 ul de anticorpo de coelho anti-albumina de ovo anticorpo primário diluído 1: 8000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada poço e incubar durante 1 h à TA.
    8. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e em seguida adicionar 50 uL de IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano diluído a 1: 2000 em PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 h à TA.
    9. Lavar cada poço três vezes com PBS-Tween e adicionar 50 ul de substrato TMB a cada poço.
    10. Após 10 min, ler os poços com um espectrofotómetro de microplacas fixado a um comprimento de onda de 650 nm.

Análise 3. Dados

  1. Calcular o valor da absorvância média dos insectos 8 de controlo negativo em cada placa de ELISA e, em seguida, calcular o desvio padrão com base nos controlos negativos reunidas from todas as placas de ELISA de um dado estudo 12.
  2. Adicionar seis vezes o desvio padrão combinado para a média obtida para cada placa de ELISA para se obter um valor limite positivo de ELISA. Qualquer amostra de insectos originando um valor de absorvância igual a ou maior do que este valor é considerado positivo para a presença da marca proteína.

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Representative Results

Marcação interna:

Os resultados do teste de retenção marca interna são mostrados na Figura 2A. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,054. No geral (todos os quatro tempos do estudo combinado), os insectos tratados sem proteína originou consistentemente valores baixos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por outro lado, todos os insectos alimentados com a dieta enriquecida proteína rendeu de forma consistente valores de ELISA fortes (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).

Marcação externa:

Os resultados do teste de retenção marca externa são apresentados na Figura 2B. O ELISA valor limiar crítico calculada foi 0,082. No geral, os insetos topicamente marcados com apenas água produziu consistentemente baixa ELISA (valores x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Por outro lado, todos os insectos topicamente marcados com a solução clara de ovo produziu consistentemente valores de ELISA fortes (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).

Figura 2
Figura 2. Média (± SD) ELISA valores de densidade óptica de (a) insetos marcados internamente com IgY frango e (B) insetos marcadas externamente com claras de ovo de galinha (albumina). As barras pretas são os valores médios ± SD ELISA densidade óptica gerados pelo insetos não marcados. Tamanho da amostra inseto para cada tratamento proteína diária foi de 20 indivíduos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O procedimento de imunomarcação de proteínas artrópode foi descrita pela primeira vez quase um quarto de século atrás 9. Desde então, o procedimento foi adaptado para estudar os padrões de dispersão de uma ampla variedade de artrópodes, usando administrados internamente e externamente de IgG / IgYs. Estas proteínas têm provado marcadores firmes para a grande variedade de espécies de insectos testadas até à data. No entanto, como mencionado acima, a principal limitação para a utilização de IgG / IgYs é que eles são muito caros. Consequentemente, IgG / IgYs são úteis apenas para MRR e estudos do tipo auto-marcando onde grandes lotes de insetos podem ser marcados em um espaço pequeno ou as marcas podem ser incorporados em uma dieta ou isca. Aqui, nós fornecemos uma simples demonstração de como uma marca interna pode ser administrada por alimentação do insecto alvo uma dieta artificial enriquecido com IgG de galinha / IgY. Por sua vez, os anticorpos IgG / IgY foi detectada utilizando um ELISA de sanduíche. Este sistema pode ser especialmente vantajoso para os pesquisadores que já usam umdieta que contém ovos de galinha, desde o ensaio irá naturalmente detectar a IgG / IgY encontrados em ovos. Além disso, pequenas quantidades de proteína IgG / IgY podem ser administrados por via tópica para insectos usando o nebulizador médico descrito acima (Figura 3A). Um nebulizador foi usado pela primeira vez a marca de parasitóides massa muito delicadas e pequenas com IgG de coelho para o tipo MRR investigação 3. Desde então, outros métodos têm sido utilizados para administrar marcas de IgG / IgY para artrópodes para pesquisa dispersão. Por exemplo, um atomizador de perfume foi usado para aplicar marcas de IgG / IgY em outras espécies de parasitóides 13,14. Outros têm marcado internamente vários insetos, alimentando-lhes (ou seja, auto-marcação) IgG de coelho marcado com mel ou açúcar 14,15 água 16 (Figura 3B). Finalmente, Baker et al. 7 papelão alimentados às térmitas que foi impregnado com IgG de coelho (Figura 3C). Estes cupins prontamente auto-marcado como eles ingeriram o alimento iscascoisas.

Figura 3
Figura 3. Vários métodos utilizados para administrar uma marca de proteína: (A) parasitóides delicadas sendo marcado com IgY frango usando um nebulizador médico, (B) um parasitóide se alimentando de solução de mel enriquecido com IgG de coelho, (C) térmitas alimenta em um papelão enriquecido-IgG de coelho isca, (D) as abelhas auto-marcação com leite seco como eles passam por um dispositivo de varredura colocado na entrada de uma colméia, (E) insetos nativos sendo marcado com leite em um campo de algodão usando um equipamento de pulverização trator convencional, (F ) insetos nativos sendo marcado com claras de ovos de galinha, com um dispositivo de lança e bico pulverizador montado sobre um ATV, (G) insetos nativos em uma faixa de alfafa sendo marcado com claras de ovos de galinha, com uma voltadispositivo de pulverização pack, e (H, I) insetos nativos na alfafa sendo marcado com claras de ovo de galinha usando aplicadores aéreos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Proteínas IgG / IgY simplesmente não têm sido utilizados para estudar a dispersão do inseto. Eles também têm sido usados ​​para rastrear ligações tróficos na cadeia alimentar artrópode. Hagler e Durand 17 proposto pela primeira vez o conceito de marcação presas com IgG / IgY e, por sua vez, a realização de um conteúdo de IgG / IgY específicas do intestino sanduíche ELISA em predadores que consumiram a presa marcado. Esta técnica recentemente ganhou popularidade entre os pesquisadores de análise de intestino, porque é menos tedioso e dispendioso do que a realização de reação em cadeia da polimerase ELISA ou presas-específica (PCR) digite análises moleculares de conteúdo do intestino (ver Hagler 18 e Fournier et al. 19 para avaliações de the prós e contras das várias técnicas de ensaio intestino). Na última década, a técnica imunomarcação rapina tem sido usada para identificar a atividade de alimentação de predadores de algodão sobre pragas marcado-IgG de coelho 18,20,21, trofilaxia e relacionamentos alimentação em colônias de cupins usando um coelho IgG-tratados fonte de alimento de papel 22, granivory de um conjunto de artrópodes em dente de leão sementes de ervas daninhas invasoras marcadas com IgG de coelho 23, fedor taxas de erros de predação sobre hornworms tomate IgG marcadas coletados em parcelas submetidas a vários tratamentos de semioquímicos 24 e atividade sequestradora predador na carniça IgG / IgY-25 marcado.

Uma segunda geração de detecção de proteína ELISAs indiretos foram desenvolvidos há quase uma década. Esses ELISAs foram projetados especificamente para detectar as proteínas contidas no "off-the-shelf" produtos alimentares, tais como a proteína albumina de ovo em claras de ovos de galinha, soja proteína inibidora de tripsina em leite de soja e proteína caseínano leite bovino. Os imunomarcadores proteína de segunda geração provaram úteis para,-captura marca MRR e auto-mark tipo de investigação. Por exemplo, Irvin et ai. 26 mostraram que era viável para marcar topicamente parasitóides delicadas com estas proteínas off-the-shelf. Além disso, Hagler et al. 8,27 mostraram que as abelhas podem se auto-marca com clara de ovo e leite bovino pós secos à medida que saem através de um distribuidor de proteína colocada na entrada de uma colméia (Figura 3D). Talvez o uso mais criativo da proteína marcação envolvido segmentação pancadinhas vaca com claras de ovo usando um pulverizador de jacto 28. Por sua vez, os adultos da mosca rosto adquiriu uma auto-marca como eles saíram do estágio de pupa e saiu do pat vaca.

A característica mais importante dos imunomarcadores proteína de segunda geração é que elas estão facilmente disponíveis em grandes quantidades e a uma fracção do custo das proteínas de IgG / 11 IgY. Esse recurso tem revolutionized a forma como a pesquisa tipo captura-marcação de toda a área é conduzida. Especificamente, os investigadores têm agora um método confiável para rápida e uniformemente artrópodes tag mais de vastas áreas no campo, utilizando uma ampla variedade de equipamentos equipamento de pulverização convencional (Figura 3E). Por exemplo, insetos-praga foram marcadas diretamente em pomares e campos usando um tipo de arma de mão portátil pulverizadores 29,30, Airblast pulverizadores de accionamento por tractor 31,32, e pulverizadores de derrapagem 33. Horton et al. 34 utilizaram um dispositivo de pulverização elétrico montado em um veículo todo-o-terreno para identificar aplicações de claras de ovos para insetos que ocupam culturas de cobertura incorporados em um pomar de pêra (Figura 3F). Da mesma forma, Swezey et al. 5,35 utilizado um pulverizador costal para aplicar aplicações precisas de claras de ovos de galinha para linhas de uma cultura da alfafa armadilha (uma planta hospedeira preferida) incorporado em um campo da morango cultivado organicamente para marcar uma praga e seus inimigos naturais ( et al. 36 aplicaram uma aplicação de transmissão de leite bovino e clara de ovo para 29 e 16 ha de flores de alfafa, respectivamente (Figura 3H, I). O objetivo desse estudo foi marcar os artrópodes residentes na alfafa e, em seguida, após a alfafa foi colhida por roçada (provocando um evento de dispersão), para rastrear os padrões de dispersão dos artrópodes em campos de algodão adjacentes (uma cultura suscetível à espécies de pragas).

Alguns usuários do processo de captura-marcação de segunda geração têm modificado o procedimento original um pouco para satisfazer as suas necessidades de investigação específicas. O tipo eo tamanho do corpo tele alvejado inseto, juntamente com suas características comportamentais, irá ditar o volume e concentração de marca necessário e como a marca é administrada 37. Além disso, o método utilizado para recapturar insetos no campo estará condicionada à esses fatores. Até o momento, quase todo método utilizado (por exemplo, armadilhas adesivas, redes de varredura, aspiradores) para coletar insetos tem sido usado com sucesso para coletar insetos marcados 3,5,8,11,29,31,32,35,38. No entanto, devido às sensibilidades extremas dos ELISAs de detecção de proteínas, enfatizamos que deve ser tomado muito cuidado para assegurar que as amostras não marcadas não forem contaminados durante os processos de recolha e triagem 38.

O estudo original 11, que descreveu a segunda geração de sistemas de marcação de proteínas (ou seja, albumina de ovo, caseína de leite, e inibidor de tripsina de soja) relataram fatores que afetam a sensibilidade do ensaio pode variar entre os tipos de marcador. Especificamente, eles mostraram que DIFrentes fontes de água, aditivos (surfactantes), e até mesmo o tipo de placa de ELISA utilizado afetados (positiva ou negativamente) o ensaio. Além disso, esse estudo e os estudos subseqüentes 37,39,40 mostraram que os ensaios de detecção de marca de três proteínas variam em eficácia. O marcador de clara de ovo foi retida mais tempo do que o marcador de leite, que foi retida mais tempo do que o marcador de leite de soja. Estes resultados destacam a importância da proteína testes de retenção de marca em um determinado inseto antes de iniciar a pesquisa de campo. Além disso, essas segunda geração ELISAs indiretos às vezes mostram um baixo nível de ruído de fundo com certos tipos de insetos (por exemplo, herbívoros) (Pers.) Obs. Este ruído de fundo pode ser reduzida pela adição de 100 ul de peróxido de hidrogénio a cada poço da placa de ELISA durante 30 min entre Passo 2.3.4 e 2.3.5 no Passo o protocolo acima (não publ. De dados).

Deve notar-se que os testes ELISA indirectos utilizados para detectar as marcas de proteínas de segunda geraçãosão muito eficazes na detecção da proteína de insetos embebidos no tampão de amostra. No entanto, os ELISAs indiretos não são tão eficazes como o sanduíche de ELISA na detecção de marcas de proteínas internas ou proteínas presas em insetos. Estudos têm mostrado que os testes ELISA indirecta não são tão eficientes quanto os testes ELISA de sanduíche para detectar proteína em amostras homogeneizadas de insectos 34,41.

Um fator importante a considerar com qualquer ELISA é que o procedimento muitas vezes mostra placa-a-placa (atribuído, principalmente, aos efeitos no dia-a-dia de funcionamento de um ensaio) 42,43 variabilidade. Portanto, é essencial que cada placa de ELISA inclui: (1) um ou mais TBS controlos apenas negativos, (2) um ou mais TBS + puros controlos positivos de proteína, e (3) pelo menos oito controlos insectos negativa (isto é, indivíduos conhecidos não conter uma marca de proteína). A única TBS, TBS + proteína, e controlos negativos de insectos assegurar que a memória intermédia não é uma fonte de erro, os reagentes estão a funcionar correctamente, umaND que não existem quaisquer proteínas no insecto que reagiram de forma cruzada com os reagentes de ELISA, respectivamente. Além disso, os controlos negativos insectos são essenciais para calcular os valores de limiar de ELISA (ver abaixo). O design da placa mostrada nesta demonstração incluiu 7 vazios TBS, 1 + proteína de controlo positivo em TBS (na primeira coluna) e oito controlos negativos (na última coluna) em cada placa de ELISA (Figura 1).

Outro factor importante a considerar quando se lidar com dados de ELISA é o de determinar um valor limiar para marcar um insecto para a presença ou ausência de uma marca de proteína. O método proposto originalmente por Stimmann 44 por conseguir insetos marcado-rubídio foi definido como o nível médio de marcador em uma piscina de insetos não marcados mais três vezes o desvio padrão dos indivíduos marcados. Este método também tem sido usado como o método convencional para conseguir os insectos para a presença de marcas de proteínas 9,17. No entanto, em alguns CASES, os investigadores têm intuitivamente seleccionado limiares mais conservadora para reduzir a probabilidade de obtenção de falsos positivos. O método mais fácil é adicionar apenas quatro a seis desvios padrão para a média dos controlos negativos, em vez de três 18,34. Um método mais sofisticado para reduzir ainda mais a possibilidade de obtenção de falsos positivos foi proposto por Sivakoff et ai. 12. Este método envolve calcular o valor da absorvância média dos oito insectos de controlo negativo em cada placa de ELISA e em seguida o cálculo do desvio padrão com base nos controlos negativos obtidos a partir de todas as placas de ELISA de um determinado estudo.

Em resumo, um método fiável para marcar artrópodes é crítica para o sucesso da maior parte dos estudos de dispersão. Vários métodos têm sido utilizados para marcar os artrópodes com proteínas ao longo das últimas duas décadas. Imunomarcação de proteínas e a detecção das marcas são relativamente fácil e pouco dispendioso e muito adaptável a uma miríade de studies. Os futuros usuários da técnica imunomarcação deve assegurar que a sua metodologia é adequado às especificidades de suas pesquisas. A concentração e volume da marca necessária e como a marca é aplicada dependerá de fatores como comportamento, tipo de corpo e tamanho das espécies-alvo 40.

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Disclosures

A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.

Acknowledgments

O financiamento foi fornecido pelo USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, em parte, pela Agricultura e Alimentação Research Initiative Competitive Grant não. 2011-67009-30141 do Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura USDA. Somos gratos pelo apoio técnico de Johanna Nassif. Agradecemos também a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff por fornecer algumas das imagens utilizadas na Figura 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

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References

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Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

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