Abstract
Overvågning leddyr bevægelse er ofte nødvendigt for bedre at forstå tilknyttede populationsdynamik, spredning mønstre, host plante præferencer og andre økologiske interaktioner. Leddyr er normalt spores i naturen ved at mærke dem med en unik mark og derefter igen at indsamle dem over tid og rum til at bestemme deres spredning kapaciteter. Ud over egentlige fysiske mærker, såsom farvet støv eller maling, har forskellige typer af proteiner, vist sig meget effektivt til mærkning leddyr for økologisk forskning. Proteiner kan administreres internt og / eller eksternt. Proteinerne kan derefter påvises på genfangede leddyr med et protein-specifikt enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). Her beskriver vi protokoller til eksternt og internt tagging leddyr med protein. To enkle eksperimentelle eksempler er påvist: (1) en intern protein varemærke introduceret til et insekt ved at tilvejebringe en protein-beriget kost og (2) en ekstern protein mærket topisk enpplied til et insekt anvendelse af en medicinsk forstøver. Vi derefter relatere en trin-for-trin guide af sandwich og indirekte ELISA metoder, der anvendes til at påvise protein mærker på insekterne. I denne demonstration er forskellige aspekter af købet og detektion af proteinmarkører om leddyr for mark-release-generobringen, mark-opsamling, og selv-mark-capture typer forskning diskuteret, sammen med de forskellige måder at immunomarking procedure er blevet tilpasset til en lang række mål for forskning.
Introduction
Sporing af leddyr skadedyr, naturlige fjender (snyltehvepse og rovdyr), og bestøvere i naturen er afgørende for en bedre forståelse hvordan man kan forbedre økosystemtjenester. Det centrale element for de fleste typer af spredning forskningen er at have en pålidelig metode til at mærke den leddyr (r) af interesse. En række materialer (f.eks, maling, farvestoffer, farvede støv, tags, sjældne elementer, proteiner) er blevet anvendt til at markere leddyr at vurdere deres populationsdynamik, spredning kapaciteter, fodring adfærd og andre økologiske interaktioner 1,2.
Hensigtsmæssigheden af en markør, der anvendes til en given spredning forskning vil være afhængig af, hvilken type undersøgelse, der skal foretages. Der er tre brede kategoriseringer til mærkning leddyr: (1) mark-release-genbeskatning (MRR), (2) mark-capture, og (3) selv-mark-capture. Varemærke-release-genbeskatning forskning, investigator typisk markerer leddyr kollektivt i laboratory og frigiver dem på et centralt punkt i marken. De leddyr derefter generobret på forskellige rumlige og tidsmæssige intervaller ved hjælp af forskellige strømaftagere (f.eks feje netto, vakuum, klæbrig fælde) 3,4,5. De genfangede prøver undersøges derefter for den specifikke mærke til at skelne frigivet fra indfødte individer. Varemærke-capture forskning, investigator normalt anvender mærket direkte i marken ved hjælp af sprøjteudstyr (fx rygsæk sprøjte, bom og dyse sprøjte). De bedste markører for mark-capture forskning er billige og let anvendes på leddyr levested. Til selv-mark-capture forskning, investigator regel gælder mærker til et leddyr agn 6,7 eller reden indgang 8. Til gengæld leddyr markerer sig internt ved at fortære den markerede lokkemad eller eksternt ved "børstning" op mod mærket, da det kommer ud af reden.
Som nævnt ovenfor har mange typer af markører været osed at mærke en række leddyrarter. Men meget få er nyttige for alle disse tre spredning forskning kategorier. Udviklingen af proteinet immunomarking procedure var et stort gennembrud for mærkning insekter. Immunomarking sætter et protein etiket på leddyr enten internt eller eksternt, hvilket igen, detekteres af et anti-protein specifikt enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Den første af disse proteinmarkører anvendte var kanin immunoglobulin (IgG) og kylling IgG / IgY 9,10. De viste sig at være meget effektive karakterer for MRR og selv-mark-capture forskning (se diskussionen). Desværre, IgG / IgY proteiner er dyre og er derfor ikke praktisk for mark-capture forskning og de fleste typer af selv-mark-capture forskning. Efterfølgende blev andengenerations protein afsløring ELISA'er udviklet til proteiner i kylling æggehvider (albumin), komælk (kasein) og sojamælk (trypsininhibitor protein). Hvert assay er meget følsomt, specifikke og mestvigtigere, anvender proteiner, som er meget billigere end de IgG / IgY proteiner 11. Disse proteiner har vist sig effektive til MRR, mark-opsamling, og selv-mark-capture forskning (se diskussionen).
I denne artikel beskriver vi og demonstrere hvordan man fører protein mark laboratorium fastholdelse studier. Sådanne undersøgelser er den første fase af forskning er nødvendig for enhver form for felt spredning undersøgelse. Konkret er det afgørende, at efterforskerne ved, hvor længe mærket vil blive tilbageholdt på de målrettede leddyrarter før går i gang med undersøgelser felt spredning. Her vil vi beskrive og vise, hvordan man internt og eksternt markere insekter til MRR, mark-capture, og selvstændige mark-capture typen feltstudier. Vi derefter vise, hvordan til at påvise tilstedeværelsen af mærkerne med indirekte og sandwich ELISA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Intern Mark, Retention, og Procedure Detection
- Intern censur procedure
- Saml insekter af interesse (n ≈ 100 personer) fra et laboratorium koloni opdrættet på en kunstig diæt eller fra marken og deler sig i to rene beholdere opdrætsmetoder.
- Placer en almindelig 20 ml kost pakken (umærket negativ kontrol behandling) i en af beholderne. Supplement til en anden 20 ml kunstig kost pakke med 1,0 ml af en 1,0 mg / ml kylling IgG / IgY løsning, blandes grundigt, og læg den i den anden beholder.
Bemærk: Hvis insekt af interesse ikke har en kunstig kost, kan mærket anbringes på eller i uanset kost de normalt opretholdt på (f.eks grønne bønner, møl æg, vand, sukker, honning). - Lad insekter til at genoptage deres fodring aktivitet i 24 timer.
- Intern mark fastholdelse procedure
- Fjern kost pakker fra hver beholder, og levere de insekter wed en anden fødekilde til at opretholde dem over hele forsøget (f.eks grønne bønner).
- Saml en kohorte (n = 20) af insekter dagligt (eller på ethvert ønsket tidsinterval) fra hver behandling og fryse omgående ved -20 ° C.
- Sandwich ELISA-procedure
- Der tilsættes 50 pi kanin-anti-kylling IgY primært antistof fortyndet 1: 500 i Tris-bufret saltvand (TBS) til hver brønd i en ren ELISA mikroplade og inkuberes i mindst 1 time ved stuetemperatur (note: mikropladerne kan også inkuberet O / N ved 4 ° C).
- Kassér antistoffet fra pladen og blokere hver brønd med 300 pi af en 1,0% fedtfri tørmælk opløsning i 30 minutter.
- Mens vi venter på de tidligere inkubationstrin, sted frosne insekter individuelt i 1,6 ml mikrocentrifugerør med 1,0 ml TBS.
- Grind hver insekt med en ren pistil indtil grundigt homogeniseret og tilsættes 100 pi af hver prøve til en individuel brønd i ELISAplade. Tillad prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
- Tilføj 100 ul negativ (kun TBS) og positive (æggehvider i TBS) kontrol til brønde i den første kolonne af hver ELISA-plade. Også, tilsættes 100 ul negative insekt kontroller (umarkerede insekter) til de 8 brønde i den sidste kolonne i hver plade (figur 1). Tillad kontrolprøverne at inkubere ved stuetemperatur i 1 time. Bemærk, at skabelonen tilvejebragt i figur 1 er den skabelon, vi bruger til vores standardiserede assays. Placeringen af prøverne i brøndene er op til skøn forskeren.
- Vask hver brønd tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) -tween, derefter tilsættes 50 pi kanin-anti-kylling IgG / IgY konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet 1: 10.000 i 1% mælk-opløsning og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask hver brønd tre gange med PBS-Tween, og der tilsættes 50 pi tetramethylbenzidin (TMB) -substrat til hver brønd.
- Efter 10 min, læse brøndemed en mikroplade spektrofotometer indstillet på en bølgelængde på 650 nm.
Figur 1. Et skematisk diagram, der viser de standardiserede såvel benævnelserne for en typisk 96-brønds ELISA mikroplade. Hver plade indeholder 7 brønde dedikeret til Tris-bufret saltvand negative kontroller (TBS), en brønd dedikeret til en positiv protein kontrol (Pos Ctrl), 80 individuelle brønde dedikeret til genfangede insekter (prøve 1 ... 80), og 8 brønde dedikeret til umarkerede (negative) insekt kontroller (Neg Ctrl 1 ... 8). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Ekstern Mark, Retention, og Procedure Detection
- Ekstern censur procedure
- Saml insekter af interesse (n ≈ 100individer) fra et laboratorium koloni eller fra marken og sted i to 1,0 L plastbeholdere med en 2,5 cm i diameter hul udstanset af den side af hver beholder.
- Spray insekterne i den første beholder med 1,0 ml dH2O (negativ kontrolbehandling) ved anvendelse af en medicinsk forstøver. Spray insekter i den anden beholder med 1,0 ml af en 5,0% opløsning af kylling æggehvider anvendelse af en medicinsk forstøver.
- Fastgør slangen af forstøveren til en standard laboratorie luftudgang og derefter indsætte mundingen af forstøveren i 2,5 cm hul i beholderen. Tænd derefter luftudtaget gradvist, indtil forstøveren producerer en damp.
- Fortsæt med at sprøjte (mærkning), indtil æggehvider løsning er dispenseret (cirka. 2-5 min).
- Fjern forstøver og placere en prop i hullet i plastbeholder. Tillad insekterne til at stå ved stuetemperatur, indtil opløsningen er tørret helt.
- Ekstern mark fastholdelse procedure
- Placer hver behandling af de tørre insekter i en separat beholder ren opdræt for at undgå yderligere eksponering til mærket.
- Tilføj mad og vand til rene beholdere til at opretholde insekterne over varigheden af undersøgelsen.
- Saml en kohorte (n = 20) af insekter fra hver behandling dagligt og fryse omgående ved -20 ° C.
- Indirekte ELISA-procedure
- Placer de frosne insekter individuelt i 1,6 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes 1,0 ml TBS.
- Soak prøverne for 1 time på en orbitalryster sæt ved 120 omdrejninger i minuttet.
- Tilføj negative og positive kontroller som beskrevet i trin 1.3.5.
- Efter iblødsætning, afpipetteres en 100 ul aliquot fra hver prøve til en af de 80 udpegede prøvebrønde på en ny 96-brønds ELISA-plade som vist i figur 1 Lad prøverne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur (note:. Mikropladerne kan også være inkuberet O / N ved 4 ° C).
- Brøndene vaskes tre gange medPBS-Tween, og derefter tilsættes 300 pi phosphatpufret saltvand indeholdende 1% bovint serumalbumin (PBS-BSA) til hver brønd.
- Efter 30 minutter ved stuetemperatur vaskes to gange med PBS-Tween.
- Der tilsættes 50 pi kanin-anti-ægalbumin primære antistof fortyndet 1: 8.000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) til hver brønd og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask hver brønd tre gange med PBS-Tween, derefter tilsættes 50 pi gede-anti-kanin-IgG konjugeret med peberrodsperoxidase fortyndet 1: 2.000 i PBS-BSA-Silwet (0,05%) i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask hver brønd tre gange med PBS-Tween, og der tilsættes 50 pi TMB-substrat til hver brønd.
- Efter 10 minutter, læse brøndene med en mikroplade spektrofotometer indstillet på en bølgelængde på 650 nm.
3. Data Analysis
- Beregn den gennemsnitlige absorbans værdi af de 8 negativ kontrol insekter på hver ELISA-plade og derefter beregne standardafvigelsen baseret på de samlede negative kontroller from alle ELISA-pladerne af en given undersøgelse 12.
- Tilføj seks gange den poolede standardafvigelse på middelværdien opnået for hver ELISA-plade til opnåelse af en ELISA positiv tærskelværdi. Alle insekt prøve gav en absorbansværdi lig med eller større end denne værdi anses for at være positive for tilstedeværelsen af proteinet mærket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intern censur:
Resultaterne af det indre varemærke retentionstesten er vist i figur 2A. Den beregnede ELISA kritiske tærskelværdi var 0,054. Samlet (alle fire eksempeldatoer kombineret), insekter behandlet uden protein gav konsekvent lave ELISA-værdier (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omvendt har alle de insekter fodret med protein beriget kost gav konsekvent stærke ELISA-værdier (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).
Ekstern censur:
Resultaterne af den eksterne varemærke retentionstesten er vist i figur 2B. Den beregnede ELISA kritiske tærskelværdi var 0,082. Samlet set insekterne topisk markeret med kun vand gav konsekvent lavt ELISA-værdier (x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Omvendt har alle insekterne topisk mærket med æggehvider opløsning gav konsekvent stærke ELISA-værdier (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).
Figur 2. Middel (± SD) ELISA-optiske densitet værdier af (A) insekter mærket internt med kylling IgY og (B) insekter mærket udvendigt med kylling æggehvider (albumin). Sorte bjælker er middelværdi ± SD ELISA-optisk densitetsværdier givet ved umarkerede insekter. Insekt stikprøvestørrelse for hver daglige protein behandling var 20 personer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den leddyr protein immunomarking procedure blev først beskrevet næsten et kvart århundrede siden 9. Siden da har den procedure, blevet tilpasset for at studere spredning mønstre af en bred vifte af leddyr hjælp både internt og eksternt administrerede IgG / IgYs. Disse proteiner har vist sig standhaftige markører for den brede vifte af testede hidtil insektarter. Som nævnt ovenfor, den største begrænsning for anvendelse af IgG / IgYs er imidlertid, at de er meget dyre. Derfor IgG / IgYs er kun nyttig for MRR og selvstændige mærkning typen undersøgelser, hvor store partier af insekter kan markeret i et lille rum eller mærkerne kan inkorporeres i en diæt eller agn. Her har vi tilvejebragt en simpel demonstration af, hvordan et internt mærke kan indgives ved at tilføre målinsektet en kunstig kost beriget med kylling IgG / IgY. Til gengæld blev IgG / IgY påvist under anvendelse af en sandwich ELISA. Dette system kan være særligt fordelagtigt at forskere, der allerede bruger enkost, der indeholder hønseæg, da assayet vil naturligvis detektere IgG / IgY findes i æg. Desuden kan små mængder af IgG / IgY-protein administreres topisk til insekter ved hjælp af den medicinske forstøver beskrevet ovenfor (figur 3A). En forstøver blev første gang brugt til masse-mærket meget sarte og små snyltehvepse med kanin-IgG til MRR typen forskning 3. Siden da har andre metoder blevet anvendt til at administrere IgG / IgY mærker til leddyr for spredning forskning. For eksempel har en parfume forstøver henblik på at anvende IgG / IgY mærker på andre parasitoid arter 13,14. Andre har markeret internt forskellige insekter ved at fodre dem (dvs., self-mærkning) kanin-IgG mærket honning 14,15 eller sukkervand 16 (figur 3B). Endelig Baker et al. 7 fodret pap termitter, der blev imprægneret med kanin-IgG (figur 3C). Disse termitter let selvstændig markeret som de indtages agn fødevarerfoderstoffer.
Figur 3. Forskellige metoder anvendes til at indgive et protein mærket: (A) sarte snyltehvepse markeres med kylling IgY anvendelse af en medicinsk forstøver, (B) en snyltehveps fodring på kanin-IgG-beriget honning opløsning, (C) termitter fodring på en kanin IgG-beriget pap agn, (D) honningbier selv-mærkning med tørmælk, da de går igennem en afstøvning anordning placeret ved indgangen til et bistade, (E) indfødte insekter bliver markeret med mælk i en bomulds felt ved hjælp af en konventionel traktor spray rig, (F ) indfødte insekter markeres med kylling æggehvider med en bom og dyse spray enhed monteret på en ATV, (G) indfødte insekter i en stribe af lucerne markeres med kylling æggehvider med en backpack spray enhed, og (H, I) indfødte insekter i lucerne markeres med kylling æggehvider hjælp luftfotos applikatorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
IgG / IgY proteiner er ikke kun blevet brugt til at studere insekt spredning. De er også blevet anvendt til at spore trofiske led i leddyr fødekæden. Hagler og Durand 17 først foreslået begrebet mærkning bytte med IgG / IgY og til gengæld gennemføre en IgG / IgY-specifik sandwich-tarmindhold ELISA om rovdyr, der forbruges den markante bytte. Denne teknik har for nylig vundet popularitet blandt gut analyse forskere, fordi det er mindre trættende og dyrt end at foretage bytte-specifik ELISA eller polymerasekædereaktion (PCR) type molekylære tarmindhold analyser (se Hagler 18 og Fournier et al. 19 til anmeldelser af the fordele og ulemper ved de forskellige tarm analyseteknikker). Inden for det seneste årti har byttet immunomarking teknik blevet brugt til at identificere fodring aktivitet af bomuld rovdyr på kanin IgG-mærket skadedyr 18,20,21, trophallaxis og fodring relationer i termit kolonier ved hjælp af en kanin IgG-behandlet papir fødekilde 22, granivory af en leddyr samling på invasive mælkebøtte ukrudtsfrø markeret med kanin-IgG 23, stinke bug prædation satser på IgG-mærket tomat hornworms indsamlet i parceller, der udsættes for forskellige semiochemical behandlinger 24 og rovdyr latrintømning aktivitet på IgG / IgY-mærket ådsler 25.
En anden generation af protein afsløring indirekte ELISA blev udviklet næsten et årti siden. Disse ELISA'er blev designet specielt til at detektere proteiner i "off-the-shelf" fødevarer, såsom ægalbumin protein i kylling æggehvider, soja trypsin inhibitor protein i sojamælk og kaseinproteini komælk. Den anden generation af protein immunomarkers har vist sig nyttig til MRR, mark-opsamling og selv-mark typen forskning. For eksempel, Irvin et al. 26 viste, at det var muligt at markere topisk sarte snyltehvepse med disse off-the-shelf proteiner. Desuden Hagler et al. 8,27 viste, at honningbier kan self-mærket med æggehvide og kvæg mælk tørre pulvere, da de ud gennem et protein dispenser placeret ved indgangen til en hive (figur 3D). Måske den mest kreative brug af proteinet mærkning involveret målrettet ko klap med æggehvider ved hjælp af en jet sprøjte 28. Til gengæld erhvervede ansigt flyve voksne en selvstændig mark, da de kom ud af deres puppestadiet og forladt ko pat.
Den vigtigste egenskab ved de andengenerations protein immunomarkers er, at de er let tilgængelige i masse mængder og til en brøkdel af prisen for IgG / IgY proteiner 11. Denne funktion har revolutionized den måde hele euroområdet mark-Optagelsestype forskning udføres. Konkret efterforskere har nu en pålidelig metode til hurtigt og ensartet tag leddyr end store områder i marken ved hjælp af en bred vifte af konventionel sprøjtning rig udstyr (Figur 3E). For eksempel har skadedyr er mærket direkte i frugtplantager og marker ved hjælp af bærbare hånd pistol typen sprøjter 29,30, traktor-drevne Airblast sprøjter 31,32 og udskridning sprøjter 33. Horton et al. 34 brugt en elektrisk spray monteret på en terrængående køretøj til at lokalisere anvendelser af æggehvider til insekter besætter efterafgrøder indlejret i en pære frugthave (figur 3F). Tilsvarende Swezey et al. 5,35 brugt en rygsæk sprøjte til at anvende præcise anvendelser af kylling æggehvider til rækker af en lucerne fælde afgrøde (et foretrukket værtsplante) indlejret i et økologisk dyrkede jordbær felt for at markere et skadedyr og dens naturlige fjender (
Nogle brugere af anden generation af mark-capture procedure har ændret den oprindelige procedure noget at opfylde deres specifikke forskningsbehov. Kroppen type og størrelse af than målrettet insekt, sammen med sine adfærdsmæssige karakteristika, vil diktere mængden og koncentrationen af mark brug for, og hvordan mærket administreres 37. Desuden vil den anvendte metode til at genvinde insekter på området være betinget af disse faktorer. Til dato, anvendes næsten hver metode (f.eks, klæbrige fælder, sweep redskaber, tomrum) til opsamling insekter har været anvendt med succes til at indsamle markeret insekter 3,5,8,11,29,31,32,35,38. På grund af de ekstreme følsomhed af proteinet afsløring ELISA, understreger vi dog, at der skal tages stor omhu for at sikre, at umarkerede prøver ikke forurenes under indsamlingen eller sorteringsprocesser 38.
Den oprindelige undersøgelse 11, der er beskrevet den anden generation af protein mærkning systemer (dvs. ægalbumin, mælk kasein og soja trypsininhibitor) rapporterede faktorer, der påvirker assayfølsomhed kan variere blandt de typer af markør. Specifikt viste de, at difskellige vandkilder, tilsætningsstoffer (tensider), og selv den type ELISA plade, der anvendes påvirket (enten positivt eller negativt) assayet. Desuden, at undersøgelsen og efterfølgende undersøgelser 37,39,40 viste, at de tre protein afsløring mærke analyser varierer i effektivitet. Æggehvide markør blev tilbageholdt længere end mælk markering, som blev tilbageholdt længere end sojamælk markør. Disse resultater understreger vigtigheden af test protein mark opbevaring om en given insekt før går i gang med forskning i marken. Også disse andengenerations indirekte ELISA'er undertiden viser et lavt niveau af baggrundsstøj med visse typer af insekter (f.eks planteædere) (pers. OBS). Denne baggrundsstøj kan reduceres ved tilsætning af 100 pi af hydrogenperoxid til hver brønd i ELISA-pladen i 30 minutter mellem trin 2.3.4 og 2.3.5 Trin i protokollen ovenfor (upubl. Data).
Det skal bemærkes, at de indirekte ELISA'er anvendes til påvisning af andengenerations protein mærkerer meget effektive til at detektere proteinet på insekter gennemvædet i prøvepuffer. Men de indirekte ELISA-test er ikke så effektive som sandwich ELISA til at opdage interne protein mærker eller prey-proteiner af insekter. Undersøgelser har vist, at de indirekte ELISA er ikke så effektive som sandwich ELISA til at opdage protein i homogeniserede insekt prøver 34,41.
En vigtig faktor til at overveje med nogen ELISA, er, at den procedure, der ofte viser plade-til-plade (tilskrives hovedsageligt til dag-til-dag effekter af at køre en assay) variabilitet 42,43. Derfor er det vigtigt, at hver ELISA-plade omfatter: (1) en eller flere TBS kun negative kontroller, (2) en eller flere TBS + rent protein positive kontroller og (3) mindst otte negative insekt kontroller (dvs. individer kendte ikke at indeholde et protein varemærke). Kun TBS, TBS + protein og insekt negative kontroller sikre, at bufferen ikke er en fejlkilde, er reagenserne fungerer korrekt, ennd, at der ikke er nogen proteiner i insekt, der krydsreagerer med ELISA reagenser, hhv. Desuden er de insekt negative kontroller er afgørende for beregningen af ELISA tærskelværdier (se nedenfor). Pladen design vist i denne demonstration omfattede 7 TBS blanks, 1 protein + TBS positiv kontrol (i første kolonne) og otte negative kontroller (i den sidste kolonne) på hver ELISA-plade (figur 1).
En anden vigtig faktor at overveje ved håndtering ELISA data er at bestemme en tærskelværdi for at score et insekt for tilstedeværelse eller fravær af et protein mærket. Metoden oprindeligt foreslået af Stimmann 44 for at lave rubidium-mærket insekter blev defineret som det gennemsnitlige niveau af markør i en pulje af umarkerede insekter plus tre gange standardafvigelsen af de umarkerede individer. Denne fremgangsmåde er også blevet anvendt som den konventionelle metode til at lave insekter for tilstedeværelsen af protein varemærker 9,17. Men i nogle cases, har forskere intuitivt valgt flere konservative tærskelværdier for at reducere sandsynligheden for at opnå falske positive. Den nemmeste metode er at bare tilføje fire til seks standardafvigelser til gennemsnittet af de negative kontroller i stedet for tre 18,34. En mere avanceret metode til yderligere at reducere risikoen for at få falske positiver blev foreslået af Sivakoff et al. 12. Denne metode indebærer beregning af en gennemsnitlig ekstinktionværdi af de otte negative kontrolprøver insekter på hver ELISA-plade og derefter beregne standardafvigelsen på grundlag af de poolede negative kontroller fra alle de ELISA-plader i en given undersøgelse.
Sammenfattende en pålidelig metode til at mærke leddyr er afgørende for succes i de fleste undersøgelser spredningsmuligheder. Forskellige fremgangsmåder er blevet anvendt til at markere leddyr med proteiner i løbet af de seneste to årtier. Protein immunomarking og påvisning af mærkerne er relativt nemt og billigt og meget tilpasningsdygtige til et utal af studies. Fremtidige brugere af immunomarking teknik bør sikre, at deres metode er egnet til at detaljerne i deres forskning. Koncentrationen og mængden af varemærket er nødvendig, og hvordan mærket påføres, vil afhænge af faktorer som adfærd, kropsbygning og størrelse af målarter 40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale af handelsnavne eller kommercielle produkter i denne publikation er udelukkende til det formål at give specifikke oplysninger og betyder ikke anbefaling eller godkendelse af det amerikanske Department of Agriculture. USDA er en lige muligheder udbyder og arbejdsgiver.
Acknowledgments
Finansieringen blev leveret af USDA CRIS 5347-22620-021-00D og til dels af Landbrug og Fødevarer Research Initiative Konkurrencedygtige Grant nej. 2011-67009-30141 fra USDA National Institute of Fødevarer og Jordbrug. Vi er taknemmelige for den tekniske support af Johanna Nassif. Vi takker også Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, og Frances Sivakoff for at levere nogle af billederne, der anvendes i figur 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
References
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
- Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
- Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
- Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
- Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
- Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
- Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
- DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
- Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
- Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
- Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
- Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
- Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
- Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
- Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
- Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
- Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
- Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
- Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
- Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
- Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
- Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
- Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
- Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
- Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
- Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
- Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
- Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
- Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
- Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
- Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
- Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
- Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
- Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
- Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
- Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
- Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).
