Abstract
È spesso richiesto il monitoraggio movimento artropodi per meglio comprendere dinamiche relative popolazioni, i modelli di dispersione, preferenze pianta ospite, e altre interazioni ecologiche. Gli artropodi sono solitamente monitorati in natura da loro codifica con un segno unico e poi ri-raccogliere loro nel tempo e nello spazio di determinare le loro capacità di dispersione. Oltre ai tag fisici, come polvere o vernice colorata, vari tipi di proteine sono dimostrati molto efficaci per la marcatura per artropodi ricerca ecologica. Le proteine possono essere somministrati internamente e / o esternamente. Le proteine possono poi essere rilevate su artropodi ricatturati con un saggio di immunoassorbimento specifiche proteina enzimatica (ELISA). Qui si descrive protocolli per esternamente ed internamente la codifica artropodi con proteine. Due semplici esempi sperimentali sono dimostrati: (1) un marchio di proteine interno introdotto un insetto fornendo una dieta proteici e (2) un marchio proteina esterna topicamente unapplied di un insetto con un nebulizzatore medico. Abbiamo poi rapportiamo una guida passo-passo del panino e metodi ELISA indiretti impiegati per rilevare segni di proteine sugli insetti. In questa dimostrazione, vari aspetti della acquisizione e l'individuazione di marcatori proteici su artropodi per mark-release-ricattura, mark-cattura, e tipi di auto-mark-cattura di ricerca sono discussi, insieme con i vari modi in cui la procedura immunomarking è stato adattata per una vasta gamma di obiettivi di ricerca.
Introduction
Registrazione della movimentazione dei parassiti artropodi, nemici naturali (parassitoidi e predatori) e degli impollinatori in natura è essenziale per una migliore comprensione su come migliorare i servizi ecosistemici. La componente chiave per la maggior parte dei tipi di ricerca dispersione sta avendo un metodo affidabile per contrassegnare il artropodi (s) di interesse. Una varietà di materiali (ad esempio, vernici, coloranti, polveri colorate, etichette, elementi rari, proteine) sono stati utilizzati per marcare artropodi per valutare le loro dinamiche di popolazione, capacità di dispersione, l'alimentazione, i comportamenti e altre interazioni ecologiche 1,2.
L'adeguatezza di un marcatore utilizzato per una qualsiasi ricerca dispersione dipenderà dal tipo di studio condotto. Ci sono tre categorizzazioni di massima per marcatura artropodi: (1) mark-release-ricattura (MRR), (2) mark-capture, e (3) auto-mark-capture. Per ricerche mark-release-ricattura, l'investigatore segna in genere i artropodi collettivamente alla laboratory e li rilascia in un punto nel campo centrale. Gli artropodi sono poi ripresi a vari intervalli spaziali e temporali con diversi dispositivi di raccolta (ad esempio, al netto spazzata, il vuoto, appiccicoso trappola) 3,4,5. I campioni ricatturati vengono esaminate per il marchio specifico di distinguere la liberato da individui nativi. Per ricerche mark-cattura, l'investigatore di solito si applica il marchio direttamente nel spruzzo campo usando (per esempio, zaino spruzzatore, braccio e l'ugello spruzzatore). I migliori marcatori per la ricerca mark-cattura sono poco costosi e facilmente applicata al habitat della artropodi. Per la ricerca di auto-mark-capture, l'investigatore si applica di solito segni di un artropode esca 6,7 o nido ingresso 8. A sua volta, il artropodi si contraddistingue all'interno divorando l'esca marcata o esternamente da "spazzolatura" contro il marchio come esce il nido.
Come accennato in precedenza, molti tipi di marcatori ci sono statied al tag una varietà di specie di artropodi. Tuttavia, molto pochi sono utili per tutte e tre queste categorie di ricerca di dispersione. Lo sviluppo della procedura proteine immunomarking era un importante passo avanti per la marcatura insetti. Immunomarking mette un'etichetta di proteine su artropodi sia internamente che esternamente, che, a sua volta, viene rilevato da una specifica immunosorbent assay anti-proteina enzimatica (ELISA). I primi marcatori proteici come usati erano immunoglobulina coniglio (IgG) e IgG pollo / IgY 9,10. Hanno dimostrato di essere i marchi molto efficaci per la MRR e di ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione). Purtroppo, le proteine IgG / IGY sono costosi e non sono quindi pratico per la ricerca mark-cattura e la maggior parte dei tipi di ricerca auto-mark-capture. Successivamente, ELISA di rilevamento di proteine di seconda generazione sono stati sviluppati per le proteine contenute nel albumi pollo (albumina), latte vaccino (caseina) e latte di soia (tripsina proteina inibitrice). Ciascun test è altamente sensibile, specifico, e, piùimportante, utilizza proteine che sono molto meno costoso rispetto alle proteine IgG / IGY 11. Queste proteine si sono dimostrati efficaci per MRR, mark-cattura, e la ricerca di auto-mark-capture (vedi la discussione).
In questo articolo, si descrive e dimostrare come condurre marchio proteina studi di ritenzione di laboratorio. Tali studi sono la prima fase di ricerca necessaria per ogni tipo di studio sul campo dispersione. In particolare, è fondamentale che gli investigatori sanno quanto tempo il marchio sarà mantenuto sulle specie di artropodi bersaglio prima di intraprendere gli studi di campo di dispersione. Qui, descriviamo e dimostrare come contrassegnare internamente ed esternamente insetti per MRR, mark-cattura, e studi di settore di tipo auto-mark-capture. Abbiamo poi dimostrare come rilevare la presenza dei marchi con ELISA indiretta e sandwich.
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Protocol
1. Mark interno, di conservazione, e procedura di rilevazione
- Procedura marcatura interna
- Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100 individui) da una colonia di laboratorio allevati con una dieta artificiale o dal campo e dividere in due contenitori di allevamento puliti.
- Collocare un normale pacchetto di dieta 20 ml (trattamento di controllo negativo non marcato) in uno dei contenitori. Supplemento un secondo 20 ml pacchetto dieta artificiale con 1,0 ml di una / IgG pollo ml di soluzione 1,0 mg / IgY, mescolare accuratamente, e inserirlo in un altro contenitore.
Nota: se l'insetto di interesse non ha una dieta artificiale, il marchio può essere posizionato su o in qualunque dieta sono normalmente sostenuti su (ad esempio, fagiolini, uova falena, acqua, zucchero, miele). - Consentire agli insetti di riprendere la loro attività di alimentazione per 24 ore.
- Marchio interno Procedura ritenzione
- Rimuovere i pacchetti di dieta di ogni contenitore e fornire gli insetti with un'altra fonte di cibo per sostenerli tutta la durata dell'esperimento (ad esempio, fagiolini).
- Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti giornaliera (o in qualsiasi intervallo di tempo desiderato) da ciascun trattamento e congelare immediatamente a -20 ° C.
- Sandwich procedura ELISA
- Aggiungere 50 ml di coniglio anti-pollo IgY anticorpo primario diluito 1: 500 in Tris Buffered Saline (TBS) a ciascun pozzetto di una micropiastre ELISA pulito e incubare per un minimo di 1 ora a temperatura ambiente (nota: i micropiastre può anche essere incubate O / N a 4 ° C).
- Scartare l'anticorpo dalla piastra e bloccare ogni pozzetto con 300 ml di una soluzione non grasso secco 1,0% per 30 min.
- In attesa che le fasi di incubazione precedenti, posizionare insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette con 1,0 ml di TBS.
- Grind ogni insetto con un pestello pulito fino al completo omogeneizzato e aggiungere 100 ml di ciascun campione di un bene individuale del ELISApiatto. Lasciare i campioni incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Aggiungere 100 pl di negativo (solo TBS) e positivi (albumi in TBS) controlli nei pozzetti nella prima colonna di ciascuna piastra ELISA. Inoltre, aggiungere 100 ml di controlli negativi insetti (insetti non marcati) per le 8 pozzetti nell'ultima colonna di ciascuna piastra (Figura 1). Lasciare i campioni di controllo per incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Si noti che il modello fornito nella figura 1 è il modello che utilizziamo per i nostri test standardizzati. Il posizionamento dei campioni nei pozzetti è a discrezione del ricercatore.
- Lavare i pozzetti tre volte con tampone fosfato salino (PBS) -tween e poi aggiungere 50 ml di IgG di coniglio anti-pollo / IgY coniugato con perossidasi diluito 1: 10.000 in 1% soluzione di latte e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di tetrametilbenzidina (TMB) substrato in ogni pozzetto.
- Dopo 10 min, leggere i pozzetticon uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d'onda di 650 nm.
Figura 1. Un diagramma schematico che illustra le denominazioni e standardizzati utilizzati per un tipico 96 ben ELISA micropiastra. Ciascuna piastra contiene 7 pozzetti dedicate ai controlli negativi salina tamponata con Tris (TBS), un pozzo dedicato a un controllo positivo proteine (Pos Ctrl), 80 singoli pozzetti dedicati agli insetti ricatturati (campione 1 ... 80), e 8 pozzetti dedicati alla non marcati (negativi) di controllo degli insetti (Neg Ctrl 1 ... 8). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Mark esterno, di conservazione, e procedura di rilevazione
- Procedura marcatura esterna
- Raccogliere insetti di interesse (n ≈ 100individui) da una colonia laboratorio o dal campo e posto in due contenitori di plastica 1.0 L con un foro di diametro 2.5 cm perforato del lato di ciascun contenitore.
- Spray insetti nel primo contenitore con 1,0 ml di dH 2 O (trattamento di controllo negativo) utilizzando un nebulizzatore medico. Spray insetti nel secondo contenitore con 1,0 ml di una soluzione 5,0% di albumi pollo usando un nebulizzatore medico.
- Attaccare il tubo del nebulizzatore ad una presa d'aria di laboratorio standard e quindi inserire la bocca del nebulizzatore nel foro 2.5 cm del contenitore. Quindi, accendere l'uscita dell'aria gradualmente fino il nebulizzatore produce un vapore.
- Continuare a spruzzo (marcatura) fino a quando la soluzione albumi è stato erogato (ca. 2-5 minuti).
- Rimuovere il nebulizzatore e posizionare un tappo nel foro del contenitore di plastica. Lasciare gli insetti di stare a temperatura ambiente fino a quando la soluzione si è asciugato completamente.
- Contrassegno esterno Procedura ritenzione
- Mettere ogni trattamento degli insetti secchi in un contenitore pulito allevamento separato per evitare ulteriore esposizione al marchio.
- Aggiungere cibo e acqua ai contenitori puliti per sostenere gli insetti per tutta la durata dello studio.
- Raccogliere una coorte (n = 20) di insetti di ogni trattamento giornaliero e congelare immediatamente a -20 ° C.
- Procedura indiretta ELISA
- Posizionare gli insetti congelati singolarmente in 1,6 ml microprovette e aggiungere 1,0 ml di TBS.
- Mettere a bagno i campioni per 1 ora su un set agitatore orbitale a 120 giri al minuto.
- Aggiungere i controlli negativi e positivi come descritto al punto 1.3.5.
- Dopo l'immersione, pipettare un'aliquota di 100 microlitri di ciascun campione in uno dei 80 pozzetti del campione designati su un nuovo 96 pozzetti ELISA come mostrato in Figura 1 consentire ai campioni di incubare per 1 ora a RT (nota:. Micropiastra può anche essere incubati O / N a 4 ° C).
- Lavare i pozzetti tre volte conPBS-Tween e poi aggiungere 300 ml di tampone fosfato salino contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA PBS-) a ciascun pozzetto.
- Dopo 30 min a RT lavare due volte con PBS-Tween.
- Aggiungere 50 ml di coniglio anti-albumina d'uovo anticorpo primario diluito 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) in ogni pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e poi aggiungere 50 ml di IgG anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi diluito 1: 2000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti tre volte con PBS-Tween e aggiungere 50 ml di substrato TMB in ogni pozzetto.
- Dopo 10 min, leggere i pozzetti con uno spettrofotometro per micropiastre impostato alla lunghezza d'onda di 650 nm.
Analisi 3. Dati
- Calcolare il valore medio delle 8 insetti di controllo negativo su ogni piastra ELISA e poi calcolare la deviazione standard in base ai controlli negativi pool from tutte le piastre ELISA di un dato studio 12.
- Aggiungere sei volte la deviazione standard aggregata al medio ottenuto per ogni piastra ELISA per ottenere un valore di soglia positivo ELISA. Ogni campione insetto ottenendo un valore di assorbanza uguale o superiore a questo valore è considerato positivo per la presenza del marchio proteine.
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Representative Results
Interno marcatura:
I risultati del test di ritenzione contrassegno interno sono mostrati nella Figura 2A. Il test ELISA valore di soglia critica calcolato era 0,054. Nel complesso (tutte e quattro le date seguenti combinati), gli insetti trattati senza proteine hanno prodotto valori costantemente bassi ELISA (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Al contrario, tutti gli insetti alimentati la dieta arricchita proteina prodotto costantemente forti valori ELISA (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).
Marcatura esterna:
I risultati del test di ritenzione contrassegno esterno sono mostrati nella Figura 2B. Il test ELISA valore di soglia critico calcolato è stato 0.082. Nel complesso, gli insetti topica contrassegnati con solo acqua ha prodotto costantemente bassa ELII valori SA (X = 0,048 ± 0,007, n = 80). Al contrario, tutti gli insetti topicamente contrassegnati con la soluzione albumi ceduta costantemente forti valori ELISA (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).
Figura 2. Media (± DS) ELISA valori di densità ottica di (A) insetti contrassegnati internamente con IgY pollo e (B) insetti contrassegnati esternamente con albume d'uovo di pollo (albumina). Barre nere sono i valori medi ± DS ELISA densità ottica prodotti dai insetti non marcati. Dimensione del campione insetto per ogni trattamento proteico giornaliero è stato di 20 individui. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La procedura immunomarking proteina artropodi è stato descritto quasi un quarto di secolo fa 9. Da allora, la procedura è stato adattato per studiare i modelli di dispersione di una vasta gamma di artropodi utilizzando sia internamente che esternamente amministrati IgG / IgYs. Queste proteine sono rivelati marcatori risoluti per la grande varietà di specie di insetti testati finora. Tuttavia, come già detto, la principale limitazione per l'utilizzo di IgG / IgYs è che sono molto costosi. Di conseguenza, IgG / IgYs sono utili solo per MRR e tipo di studi indipendenti di stampa nella quale grandi lotti di insetti possono essere contrassegnati in un piccolo spazio o marchi possono essere incorporati in una dieta o esca. Qui, abbiamo fornito una semplice dimostrazione di come un marchio interna può essere somministrato per alimentare il bersaglio insetto una dieta artificiale arricchita con IgG pollo / IgY. A sua volta, l'IgG / IgY stato rilevato usando un sandwich ELISA. Questo sistema potrebbe essere particolarmente vantaggioso per i ricercatori che già utilizzano undieta che contiene uova di gallina dal momento che il test sarà naturalmente rilevare IgG / IgY trova nelle uova. Inoltre, piccole quantità di proteina IgG / IgY possono essere somministrati per via topica per insetti con nebulizzatore medico sopra descritto (Figura 3A). Un nebulizzatore fu usato per parassitoidi marchio di massa molto delicate e piccole con IgG di coniglio per il tipo MRR ricerca 3. Da allora, altri metodi sono stati utilizzati per gestire i marchi IgG / IgY per gli artropodi per la ricerca dispersione. Ad esempio, un atomizzatore del profumo è stato usato per applicare contrassegni IgG / Igy su altre specie parassitoidi 13,14. Altri hanno segnato internamente vari insetti da nutrirli (cioè, di auto-marcatura) IgG di coniglio marcato miele 14,15 o zucchero * 16 (Figura 3B). Infine, Baker et al. 7 cartone alimentato a termiti che è stato impregnato con IgG di coniglio (Figura 3C). Queste termiti facilmente auto-contrassegnati come hanno ingerito il cibo escaanimali.
Figura 3. I vari metodi utilizzati per amministrare un segno di proteine: (A) parassitoidi delicati segnalati da IgY pollo con un nebulizzatore medico, (B) un parassitoide nutrendosi di soluzione di miele IgG arricchita di coniglio, (C) termiti si nutrono di un coniglio IgG arricchito cartone esche, (D) api mellifere auto-marcatura con latte in polvere mentre si muovono attraverso un dispositivo spolvero posta all'ingresso di un alveare, (E) insetti nativi segnalati da latte in un campo di cotone con un impianto trattore spruzzo convenzionale, (F ) insetti nativi segnalati da albumi di pollo con un dispositivo di braccio e ugello montato su un ATV, (G) insetti nativi in una striscia di erba medica ed è contrassegnata con albume d'uovo di pollo con un backnebulizzatore pacco, e (H, I) insetti nativi in erba medica sono contrassegnati con albume d'uovo di pollo con applicatori aeree. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Proteine IgG / IgY non sono appena state utilizzate per studiare la dispersione degli insetti. Essi sono stati utilizzati anche per monitorare i link trofici della catena alimentare artropodi. Hagler e Durand 17 primo proposto il concetto di marcatura preda con IgG / IgY e, a sua volta, condurre un tenore di IgG / IgY-specifico intestino panino ELISA sui predatori che hanno consumato il netto preda. Questa tecnica ha recentemente guadagnato popolarità tra i ricercatori di analisi intestino perché è meno noioso e costoso di condurre specifiche preda-ELISA o reazione a catena della polimerasi (PCR) tipo di analisi di contenuto intestinale molecolari (vedi Hagler 18 e Fournier et al. 19 per le recensioni di the pro e contro delle varie tecniche di analisi intestino). Nell'ultimo decennio, la tecnica immunomarking preda è stata utilizzata per identificare l'attività di alimentazione di predatori di cotone su coniglio IgG marcato parassiti 18,20,21, trophallaxis e relazioni di alimentazione nelle colonie di termiti con un coniglio IgG-trattati fonte di cibo di carta 22, granivory di un assemblaggio artropode su invasive dente di leone semi di piante infestanti contrassegnati con coniglio IgG 23, puzza di bug tassi di predazione su hornworms pomodoro IgG segnalati raccolti in appezzamenti sottoposti a diversi trattamenti semiochimici 24, e l'attività di lavaggio predatore su IgG / IgY-marcato carogne 25.
Una seconda generazione di rilevazione proteine ELISA indiretti sono stati sviluppati quasi un decennio fa. Questi test ELISA sono stati progettati specificamente per rilevare le proteine contenute nei prodotti alimentari "off-the-shelf", come proteine dell'uovo albumina nelle albume d'uovo di pollo, proteine di soia inibitore della tripsina nel latte di soia, caseina e proteinenel latte bovino. I immunomarkers proteina di seconda generazione si sono dimostrati utili per MRR, mark-capture e di auto-marchio di ricerca. Ad esempio, Irvin et al. 26 hanno dimostrato che era possibile contrassegnare topica parassitoidi delicati con queste proteine off-the-shelf. Inoltre, Hagler et al. 8,27 ha dimostrato che le api il miele può auto-marchio con bianco d'uovo e latte bovino polveri secche in uscita attraverso un dispenser proteina posta all'ingresso di un alveare (Figura 3D). Forse l'uso più creativo della proteina coinvolta marcatura di mira pacche mucca con albumi con un nebulizzatore jet 28. A loro volta, gli adulti faccia mosca acquistato un auto-marchio come uscirono dal loro stadio di pupa e uscite dal pat mucca.
La caratteristica più importante delle proteine immunomarkers seconda generazione è che sono facilmente disponibili in quantità di massa e ad una frazione del costo delle IgG / IGY proteine 11. Questa caratteristica ha revolutionized il modo in cui a livello di zona di tipo mark-cattura ricerca è condotta. In particolare, gli investigatori hanno ora un metodo affidabile per rapidamente e uniformemente tag artropodi su vaste aree nel campo usando un'ampia varietà di attrezzature convenzionali rig spruzzo (Figura 3E). Per esempio, insetti parassiti sono stati segnati direttamente nei frutteti e campi utilizzando tipo di pistola mano portatile spruzzatori 29,30, trattore guidato Airblast spruzzatori 31,32, e spruzzatori skid 33. Horton et al. 34 ha utilizzato un dispositivo di nebulizzazione elettrico montato su un fuoristrada per individuare applicazioni di albumi a insetti che occupano colture di copertura incorporati in un frutteto di pera (figura 3F). Allo stesso modo, Swezey et al. 5,35 usato uno spruzzatore zaino di applicare precise richieste degli albumi pollo alle righe di una coltura trappola erba medica (una pianta ospite preferito) incorporato in un campo di fragole coltivate con metodo biologico per segnare un parassita ei suoi nemici naturali (
Alcuni utenti della procedura di mark-capture di seconda generazione hanno modificato la procedura originale un po 'per soddisfare le loro esigenze di ricerca specifici. Il tipo e la dimensione di t corpoegli mira insetto, insieme con le sue caratteristiche comportamentali, detterà il volume e la concentrazione di marca necessari e di come il marchio è somministrato 37. Inoltre, il metodo utilizzato per recuperare insetti nel campo sarà subordinata questi fattori. Ad oggi, quasi ogni metodo utilizzato (ad esempio, le trappole adesive, reti spazzata, aspirapolvere) per raccogliere insetti è stato utilizzato con successo per raccogliere insetti marcati 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Tuttavia, a causa delle sensibilità estreme dei test ELISA di rilevamento di proteine, sottolineiamo che grande cura deve essere presa per garantire che i campioni non marcati non diventino contaminati durante la raccolta o di smistamento processi 38.
Lo studio originale 11 che ha descritto la seconda generazione di sistemi di marcatura di proteine (ad esempio, albumina d'uovo, caseina del latte, e inibitore della tripsina di soia) ha riferito fattori che incidono sulla sensibilità del test possono variare tra i tipi di marcatore. In particolare, hanno mostrato che diffonti di- acqua, additivi (tensioattivi), e anche il tipo di piastra ELISA hanno usato influenzato (positivamente o negativamente) il test. Inoltre, tale studio e successivi studi hanno dimostrato che 37,39,40 i saggi di rilevamento segno tre proteine variano in termini di efficacia. Il bianco d'uovo marcatore è stato mantenuto più a lungo il marcatore del latte, che è stato trattenuto più a lungo marcatore latte di soia. Questi risultati evidenziano l'importanza delle proteine test marchio ritenzione in un dato insetto prima di intraprendere una ricerca sul campo. Inoltre, questi ELISA indiretto seconda generazione volte mostrano un basso livello di rumore di fondo con alcuni tipi di insetti (ad esempio, erbivori) (pers. OB). Questo rumore di fondo può essere ridotta aggiungendo 100 ml di perossido di idrogeno in ciascun pozzetto della piastra ELISA per 30 minuti tra STEP 2.3.4 e 2.3.5 Passaggio nel protocollo di cui sopra (. Unpubl dati).
Va notato che le ELISA indiretto utilizzati per rilevare i marchi proteina seconda generazionesono molto efficaci nel rilevare la proteina di insetti imbevuti di tampone campione. Tuttavia, i test ELISA indiretti non sono efficaci come il panino ELISA a individuare segni di proteine interne o proteine preda di insetti. Studi hanno dimostrato che ELISA indiretti non sono efficienti come ELISA a sandwich a individuare proteine nei campioni omogeneizzati insetti 34,41.
Un fattore importante da considerare con qualsiasi ELISA è che la procedura mostra spesso piatto-to-plate (attribuito principalmente a giorno per giorno effetti di esecuzione di un test) la variabilità 42,43. Pertanto, è essenziale che ogni piastra ELISA comprende: (1) uno o più TBS comandi solo negativi, (2) uno o più TBS + proteina pura controlli positivi, e (3) almeno otto controlli insetti negativi (cioè individui noti non contenere un segno di proteina). Il solo TBS, TBS + proteine, e controlli negativi insetti assicurano che il buffer non è una fonte di errore, i reagenti funzionano correttamente, unnd che non ci sono proteine nel insetto che attraversano reagire con i reagenti ELISA, rispettivamente. Inoltre, i controlli negativi insetti sono essenziali per il calcolo dei valori di soglia ELISA (vedi sotto). Il design di piastra mostrata in questa dimostrazione includeva 7 fustellati TBS, 1 proteina + controllo positivo TBS (nella prima colonna) e otto controlli negativi (nell'ultima colonna) su ciascuna piastra ELISA (Figura 1).
Un altro fattore importante da considerare nella manipolazione dei dati ELISA è quello di determinare un valore di soglia per segnare un insetto per la presenza o l'assenza di un marchio di proteine. Il metodo originariamente proposto dal Stimmann 44 per aver insetti rubidio-marcato è stata definita come il livello medio di marcatore in una pozza di insetti non marcate più tre volte la deviazione standard degli individui marcati. Questo metodo è stato anche utilizzato come metodo convenzionale per aver insetti per la presenza di residui di proteine 9,17. Tuttavia, in alcuni cases, i ricercatori hanno intuitivamente selezionato più valori di soglia conservativi per ridurre la probabilità di ottenere falsi positivi. Il metodo più semplice è quello di aggiungere solo quattro a sei deviazioni standard dalla media dei controlli negativi invece di tre 18,34. Un metodo più sofisticato per ridurre ulteriormente la possibilità di ottenere falsi positivi è stato proposto da Sivakoff et al. 12. Questo metodo comporta il calcolo del valore medio delle otto insetti di controllo negativo su ogni piastra ELISA e poi calcolando la deviazione standard in base ai controlli negativi combinati di tutte le piastre ELISA di un determinato studio.
In sintesi, un metodo affidabile per etichettare artropodi è fondamentale per il successo della maggior parte degli studi di dispersione. Vari metodi sono stati utilizzati per marcare artropodi con proteine negli ultimi due decenni. Proteine immunomarking e il riconoscimento dei segni sono relativamente semplice e poco costoso e molto adattabile ad una miriade di sTUDI. Futuri utenti della tecnica immunomarking devono garantire che la loro metodologia è adeguata alle specificità delle loro ricerche. La concentrazione e il volume del marchio necessaria e come viene applicata la dipenderà da fattori come il comportamento, tipo di corpo e le dimensioni delle specie bersaglio 40.
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Disclosures
Menzione di marchi o prodotti commerciali in questa pubblicazione è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
Acknowledgments
Il finanziamento è stato fornito da USDA CRIS 5347-22620-021-00D e, in parte, dalla dell'agricoltura e dell'alimentazione iniziativa di assegno di ricerca competitiva no. 2011-67009-30141 dal National Institute USDA di alimentazione e l'agricoltura. Siamo grati per il supporto tecnico di Johanna Nassif. Ringraziamo anche Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, e Frances Sivakoff per la fornitura di alcune delle immagini usate in figura 3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH2O |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 µl in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
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