Abstract
Dendritiske celler (DC'er) er professionelle antigenpræsenterende celler primært ansvarlige for at erhverve, bearbejdning og præsentation antigener på antigenpræsenterende molekyler at initiere T-cellemedieret immunitet. Dendritiske celler kan opdeles i flere fænotypisk og funktionelt heterogene delmængder. Tre vigtige undergrupper af milt dendritiske celler er -plasmacytoide, CD8a POS og CD8a Neg celler. De plasmacytoide DC'er er naturlige producenter af type I-interferon og er vigtige for antiviral T-celle-immunitet. Den CD8a Neg DC delmængde er specialiseret til MHC klasse II-antigen præsentation og er centralt involveret i priming CD4 T-celler. Den CD8a Pos DC'er er primært ansvarlige for cross-præsentation af eksogene antigener og CD8 T-celle priming. CD8a Pos DC'er har vist sig at være mest effektive ved præsentationen af glycolipid antigener ved CD1d molekyler til en specialiseret T cell befolkning kendt som invariant naturlige dræberceller T (iNKT) celler. Administration af flt-3-ligand forøger frekvensen af migration af dendritiske-stamceller fra knoglemarv, i sidste ende resulterer i udvidelse af dendritiske celler i perifere lymfoide organer i murine modeller. Vi har tilpasset denne model til at oprense store antal funktionelle dendritiske celler til anvendelse i celle transfer eksperimenter for at sammenligne in vivo sprogfærdighed forskellige DC delmængder.
Introduction
Dendritiske celler (DC) blev opdaget næsten fyrre år siden som den "store stjerneformet (græsk dendron) celle" fundet i lymfoide organer 1. Mange undersøgelser har vist, at DC'er er de eneste antigenpræsenterende celler, der effektivt kan stimulere naive T-celler 2. En væsentlig funktion af disse celler er optagelsen og præsentation af antigener og deres effektive behandling og læsning af disse på antigen-præsenterende molekyler. I musemilt, kan DC'er adskilles i plasmacytoide og konventionelle delmængder. De plasmacytoide DC'er er kendetegnet ved lav ekspression af CD11c og høje niveauer af B220 og Gr-1. De er også positive for overflademarkør mPDCA1 og udskiller type I-interferon som reaktion på toll like receptor 9 (TLR9) ligander. De konventionelle DC'er er høje for CD11c og MHC klasse II-ekspression. De kan opdeles i tre særskilte undergrupper baseret på overfladeekspression af fænotypiske markører, såsom CD4, CD8a, DEC205, CD11b og dendritiske celle hæmmende receptor 2 (DCIR2, anerkendt af 33D1 antistof) proteiner 3,4. CD8a Pos DC'er er også kendt som cDC1, er positive for DEC205, men negative for myeloide markører, såsom CD11 og 33D1. CD8a Neg DC'er, også kaldet Cdc2, er positive for 33D1, CD11b og CD4 men mangler DEC205. Den dobbelte negative delmængde (dvs. negativ for både CD4 og CD8a) er relativt sjælden, og er negativ for DEC205 og 33D1. Det er den mindste kendetegnet delmængde og kan være en mindre differentieret form for CD8a Neg DC.
Fænotypiske forskelle i de forskellige delmængder af DC'er også omfatter deres in vivo funktioner. CD8a Neg DC'er er meget fagocytiske og menes at præsentere exogent antigen hovedsageligt via MHC-klasse II til CD4 T-celler 3. I modsætning hertil CD8a Pos DC'er er specialiseret til præsentation af opløseligt protein-antigen på MHC klasse Ii en mekanisme kaldet cross-præsentation. Resultatet af cross-præsentation afhænger af aktivering status for disse DC'er 5, og kan enten føre til udvidelse af cytotoksiske T-celler (CTL'er) eller udvikling af regulatoriske T-celler 6 2,7. Målretning af antigen til CD8a Pos DCs hjælp af anti-DEC205-antistof-medieret leveringsresultater stort set i sletning af T-celler 8, mens præsentationen af antigener, der stammer fra inficerede apoptotiske celler inducerer en stærk CTL-respons 9.
Udover anerkendelse af peptidantigener, er det mammale immunsystem udviklet sig til at genkende lipid og glycolipid-antigener. Disse antigener præsenteres af CD1-molekyler, som MHC klasse I-lignende celleoverfladeproteiner, der findes i multiple relaterede former i forskellige pattedyr. Hos mus, en enkelt type stærkt bevaret CD1 molekyle kaldet CD1d er ansvarlig for præsentation af glycolipid-antigener 10. den største population af T-celler, der genkender CD1d / glycolipid komplekser kaldes invariante NKT-celler (iNKT celler). Disse celler udtrykker en semi-invariant T-cellereceptor (TCR) bestående af et invariant TCRα kæde, der er parret med TCRβ kæder, der har begrænset mangfoldighed 11. I modsætning til konventionelle T-celler, der skal formering og differentiering til at blive aktiverede effektor T-celler, der findes iNKT celler som en effektor befolkning og begynde at reagere hurtigt, efter glycolipid administration 12. Identifikation af fysiologisk relevante lipid antigenpræsenterende celler er et aktivt forskningsområde, og flere forskellige celletyper, såsom B-celler, makrofager og DC'er er blevet foreslået at udføre denne funktion. Det blev dog påvist, at CD8a Pos delmængde af udviklingslandene er den primære celle medierer optagelse og præsentation af lipid-antigener til mus iNKT celler 13 og glycolipid medieret krydspriming af CD8 T-celler 14.
ove_content "> For at sammenligne effektiviteten af antigenpræsentation ved forskellige antigenpræsenterende celler, en enkel tilgang er at overføre forskellige typer af oprensede APC'er pulseret med ækvivalente mængder af antigen i naive værter. celleoverførsel eksperimenter af denne type er ofte udføres for immunologiske undersøgelser. Men der udfører transfer studier med ex vivo antigen behandlet udviklingslandene er udfordrende, da der findes disse celler som sjældne populationer i lymfoide organer, hvor de udgør mindre end 2% af de samlede celler 15. det er derfor nødvendigt at styrke udviklingen af disse celler i donordyr at øge effektiviteten af isolation protokoller.Det er kendt, at den fælles lymfoide og fælles myeloide stamceller, som er nødvendige til frembringelse af PDC CD8 Pos og CD8 Neg DC delmængder, hurtig fms-beslægtede receptortyrosinkinase 3 (Flt-3). Ved in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) administration, emigration of Flt-3 udtrykkende progenitorceller fra knoglemarv forøges, hvilket resulterer i øget podning af perifere lymfoide organer og udvidelsen af deres modne DC afkom 16. Ekspression af Flt-3 går tabt under engagement til B, T eller NK-celle differentieringsveje. Derfor er kun minimale ændringer observeret i disse celler efter Flt-3L administration. Tilsvarende ekspansion i DC-populationer er observeret i mus, der bærer tumorer, der genereres af implantation af en B16-melanom-cellelinie udskillende murine Flt-3L, som giver en enkel og økonomisk fremgangsmåde til tilvejebringelse vedvarende systemiske niveauer af Flt-3L 17,18. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, har vi udviklet en protokol baseret på implantation af B16-melanomceller secernerende Flt-3L at stimulere ekspansion af alle normale DC delmængder i musemilt, hvilket i høj grad øger udbytterne af disse celler, som kan isoleres til efterfølgende eksperimenter . Vi finder konsekvent at inden for 10 - 14 dage efter subkutan imbeplantning af de Flt-3 secernerende tumor, udvikler mus splenomegali med markant berigelse af DC'er at udgøre i 40 - 60% af de samlede miltceller. Fra disse milte, kan forskellige DC delmængder isoleres med høj renhed under anvendelse af standard kommercielt tilgængelige celle rensning kits, der anvender subset-specifikke fænotypiske markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg er færdig i overensstemmelse med godkendte retningslinjer fra den institutionelle dyr behandling og brug udvalg (IACUC). Alle procedurer, der kræver sterilitet udføres i et biosikkerhed skab.
1. Implantation af B16.Flt3L melanom i mus
- Kultur flt-3 udtrykkende B16 melanom cellelinie i T25 vævsdyrkningskolber ved en densitet på 0,5 x 10 6 celler / ml i komplet DMEM-medium med 10% CO2 ved 37 ° C. Vokse, indtil cellerne når ~ 90% sammenflydning (~ 20 timer).
- Cellerne høstes ved trypsin fordøjelse. Aspirer celledyrkningsmedier og vask adhærente celler med PBS. Der tilsættes 5 ml 0,05% trypsin og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Tilføj kolde 20 ml komplet DMEM-medium (4 ° C) indeholdende føtalt kalveserum (FCS) til standsning af proteasefordøjelse. Løft cellerne fra ved at trykke let fulgt ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Opsaml cellerne ved centrifugering ved 300xg i 10 min ved 4 ° C. Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer eller en automatiseret levedygtighed celletæller. Resuspender til en densitet på 10 8 celler / ml i PBS.
- Implant mus (C57BL / 6 eller en anden histokompatible stamme) med tumorceller ved subkutan injektion som beskrevet af Machholz et al. 19 ved bunden af halsen med 100 pi cellesuspension (10 7 celler).
- Tillad tumoren at vokse, indtil palpable eller synlige (2 - 10 mm i diameter, sædvanligvis 7 - 12 dage) før at ofre dyr til høstning organer.
2. Udarbejdelse af Milt Single Cell Suspension fra tumorbærende mus
- Bedøver mus med en overdosis af isofluran (justere flow på isofluran til> 5% og fortsætter eksponering på mindst 2 minutter efter vejrtrækning stopper). Ofre Flt-3 melanom tumor bærende mus ved cervikal dislokation efter institutionelle retningslinjer for eutanasi.
- Disinfect huden med 70% ethanol og høst milt hjælp af aseptisk teknik ved hjælp af steril saks 20.
- Placer milten i en steril petriskål til transport til den biosikkerhed kabinet. Udfør alle trin fra her på under sterile forhold.
- Overfør milt til en frisk petriskål og vask med RPMI-medium. Skær milten i små (~ 0,2 cm 2) stykker med en skalpel. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C med 10 ml collagenase / DNase-opløsning.
- Hæld delvist fordøjet suspension af milt væv på en 70 um cellefilter. Komprimere de resterende vævsfragmenter gennem masken af sien anvendelse af en 5 ml sprøjte stemplet.
- Vask mesh filter med 10 ml frisk medium og kassere filteret. Centrifugeres suspensionen ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at pelletere cellerne.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 2 ml RBC lysebuffer. Inkuber ved RT feller 10 min. Stands RBC lysepuffer ved tilsætning af 10 ml komplet RPMI-medium.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender i passende volumen til opnåelse celledensitet på 10 8 celler / ml i cellesortering puffer (f.eks MACS) indeholdende 20 ug / ml Fc-blok-antistof (2.4G2).
3. Oprensning af Plasmacytoide DC'er, CD8a Pos DCs og CD8a Neg DCs fra Milt Single Cell Suspension
Bemærk: Isolering af de milt DC delmængder fra enkelt cellesuspension er en multi-trins procedure som vist i figur 1 Udfør alle trin under anvendelse af præ-afkølet puffer og et isvandbad for at opretholde temperaturen ved 4 - 8 ° C.. Alle reagens mængder i det følgende afsnit af protokollen er beregnet for en indledende input på 200 ul milt cellesuspension på 10 8 celler / ml). Dette kan skaleres op ellerned baseret på dine behov ved at ændre mængden af celle suspension (altid med en tæthed på 1 x 10 8 celler / ml) og andre reagenser forholdsmæssigt i det første skridt (3.1.1 og 3.2.1). Juster reagentmængder i alle senere derefter. For eksempel, hvis startende med 100 pi milt cellesuspension ved 1 x 10 8 / ml, bruge halvdelen af de opstillede reagens mængder i alle trin.
- Isolering af Plasmacytoide DC'er (PDC)
- Der tilsættes 300 pi biotin-mærket antistof cocktail tilvejebragt i plasmacytoide DC isolation kit til 200 pi af milt cellesuspension.
- Bland grundigt og inkuberes i is vandbad i 15 min. Tap røret hver 3 min for at holde celler suspenderet, og for at maksimere antistofbinding.
- Tilsættes 12 ml cellesortering puffer og pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten for at fjerne ubundne biotinylerede antistoffer.
- Resuspender cellenpellet i 500 pi cellesortering puffer. Der tilsættes 300 pi anti-biotin antistof-konjugerede perler. Gentag trin 3.1.2 og 3.1.3.
- Supernatanten kasseres og resuspender cellepelleten i 2 ml cellesortering puffer. Udfør alle trin fra dette punkt på ved RT bruger præ-afkølede buffere.
- Placer en frisk magnetisk cellesortering LS kolonne i magnetiske stativ. Vask og tempereres søjlen med 5 ml cellesortering puffer.
- Pipetteres cellesuspensionen på søjlen, anvender den forsigtigt til midten af overfladen af søjlen sengen. Saml gennemstrømningen.
- Kolonnen udvaskes med 10 ml cellesortering puffer. Saml dette flow igennem og kombinere med strømmen igennem fra trin 3.1.7. PdCs er beriget i denne kolonne gennemstrømningen (FT1).
- Pelletere cellerne fra FT1 ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, resuspenderes i 2 ml cellesortering puffer og passere cellerne gennem en frisk LS-søjleved at gentage trin 3.1.6 - 3.1.8. Denne anvendelse af to sekventielle kolonner giver forøget renhed af isolerede celler.
- Udpelleter cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og resuspender med 2 ml komplet RPMI. Anbring på is indtil brug.
- Isolering af CD8a Pos og CD8a Neg DCs
Bemærk: Det første skridt i denne procedure er udtømning af B, PDC, T og NK-celler.- Startende med hele miltcellesuspensionen (1 ml 10 8 celler / ml opnået i trin 2.8), tilsættes 100 pi biotin-konjugeret antistof cocktail tilvejebragt i CD8a Pos DC isolation kit.
- Bland godt og inkuber i isvandbad i 15 minutter. Tap røret forsigtigt hver 3 min at maksimere binding af biotin-mærkede antistoffer til deres målceller.
- Tilsættes 12 ml cellesortering puffer og pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatant at fjerne ubundne biotinylerede antistoffer.
- Tilføj 150 pi cellesortering puffer og 100 pi anti-biotin perler tilvejebragt i CD8a Pos DC isolation kit. Bland godt og inkuber i isvandbad i 15 minutter.
- Tilsæt 10 ml cellesortering puffer og pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender celler i 1 ml cellesortering puffer og passere over en frisk LS søjle ifølge fremgangsmåden i trin 3.1.6 gennem 3.1.8.
- Saml den umærkede flow gennem 2 (FT2), og kassér kolonnen retentatet. Denne umærkede fraktion beriget for CD8a Pos og CD8a Neg DCs.
- Pelletere cellerne i FT2 ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellerne i 1 ml cellesortering buffer, og der tilsættes 200 pi anti-CD8a konjugerede magnetiske perler tilvejebragt i CD8a Pos DC isolation kit.
- Repspiser trin 3.2.2 gennem 3.2.6. Strømmen gennem af kolonnen er beriget for CD8a Neg udviklingslandene og forarmet for CD8a Pos udviklingslandene. Dette er mærket strømning gennem 3 (FT3).
- Til eluering af CD8a Pos DC'er bibeholdt i kolonnen, fjern kolonnen fra magneten, tilsættes 5 ml cellesortering buffer og rense kolonnen matrix ved hjælp af stemplet forsynet med LS-søjle.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender i 1 ml cellesortering puffer. For at øge renheden, køre de eluerede celler igen gennem en frisk LS kolonne ved at gentage trin 3.1.6 til 3.1.8, undtagen kassere gennemstrømningen og indsamle tilbageholdte celler som i 3.2.11.
- At oprense CD8a Neg DC'er fra FT3 suspensionen, pelletere FT3 ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspenderes i 300 pi cellesortering puffer.
- Tilsæt 100 pi anti-CD11c magnetiske perler. Bland godt og inkuber i isvandbad i 15 minutter.
- Tilsæt 10 ml cellesortering buffer- og pellet cellerne ved centrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Gentag trin 3.1.5 gennem 3.1.8. Den CD8a Neg udviklingslandene er positivt vælges med CD11c perler og er bundet til kolonnen. Gennemstrømningen kan kasseres.
- Elueres cellerne tilbageholdt i kolonnen som beskrevet i trin 3.2.11 at indsamle de rensede CD8a Neg DC'er.
4. Pulserende APC'erne med antigener og Cell Transfer
- Tæl levende celler efter oprensning ved hjælp af trypanblåteksklusion 21 at skelne levende og døde celler.
- Inkubér cellerne med antigenet af valg. Brug analoger af glycolipid antigen kaldet alfa-galactosyl ceramid (αGalCer) ved 100 nM koncentration 13. Typisk pladen 10 6 levedygtige celler / brønd i komplet RPMI medium ved anvendelse af ultra-low attachment U-bundede 96-brønds plader for at minimere cellevedhæftning. Inkubér cellerne i en 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i 1 - 4 timer.
- Harvest celler ved forsigtigt at pipettere flere gange. Brug brede boring pipettespidser at minimere celleskader fra forskydningskræfter. Vask brøndene med PBS og samle disse vaske for at maksimere celle høst.
- Pelletere cellerne ved 300 x g i 5 min ved 4 ° C og resuspenderes til den ønskede densitet i PBS. Typisk injiceres 1 million celler i 200 pi pr modtagende dyr. Hold cellerne på is for at maksimere rentabiliteten før indgivelse til værtsdyr.
- Injicere celler intravenøst i mus enten via den laterale hale forgæves eller retroorbitale veneplexus 19. Brug en 27 G nål på en 1 ml sprøjte og injiceres et maksimalt volumen på 0,1 ml per mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet af denne procedure er afhængig af udvidelsen af DC delmængder af murine Flt-3L udtrykt af de implanterede melanom celler. Den B16.Flt3L tumor blev afledt af en C57BL / 6 mus, og bør implanteret i dyr med denne stamme baggrund for at undgå svigt af tumoren at etablere grundet afvisning. I nogle tilfælde kan det være ønskeligt at anvende genetisk modificerede mus til at udlede DC'er med kendte defekter i signalveje eller receptorer af interesse. Det er vigtigt at huske på, at tumoren kan udvikle med forskellige kinetik i sådanne dyr, så det er vigtigt at overvåge tumor vækst baseret på udseende og palpering på podningsstedet. Det er vores erfaring, når tumoren er håndgribelige, den B16.Flt3L tumorbærende mus viser konsekvent en tydelig stigning i milten cellularitet, der korrelerer med udvidelse af alle DC delmængder (figur 2A). Vi ser typisk en 2- til 3-fold i stigendee i antallet af totale splenocytter opnået fra B16.Flt3L melanom-bærende mus sammenlignet med naive dyr. Stigningen i antallet af DC delvis bidrager til den tilsyneladende reduktion i frekvensen af B-celler, mens der er lidt at ingen ændring i det absolutte antal af B-celler. Interessant, mens en stor ekspansion (~ 15- til 20-fold forøgelse af absolutte tal) observeres for konventionelle DC'er i disse mus, er der kun en beskeden stigning (ca. 4 gange) observeret i plasmacytoide DC delmængde.
Gating strategi til at identificere forskellige DC delmængder er vist i figur 2A og er baseret på ekspressionen af B220, CD11b, CD11c og CD8a som subset-specifikke fænotypiske markører (figur 2B). Vi undersøgte også DEC205, CD11b og mPDCA1 udtryk på disse undergrupper, som vist i figur 2B. Dette viser det forventede mønster, med mPDCA kun på pDC delmængde, mens december 205 udtrykkes stærkt på CD8a Pos DC'er og CD11b opdages mest fremtrædende plads på CD8a Neg DC'er. Vi analyserede også ændringerne i celle frekvenser for hver af delmængderne oprenset på hvert trin i protokollen beskrevet her (opsummeret i figur 2C, med detaljerede eksempler på de flowcytometriske data i figur 3). Isoleringen af de milt DC delmængder beskrevet i denne metode er en multi-trins procedure (figur 1). Rensning af plasmacytoide DC'er er afhængig af negativ selektion til at berige disse celler efter udtømning af alle uønskede befolkningsgrupper som B, T, NK-celler og konventionelle DC'er. Oprensning af CD8a Pos DC'er, og CD8a Neg DC'er udføres ved positiv selektion af disse celler efter udtømning af T, B og NK celler. Den høje renhed af hver af DC delmængder opnået under anvendelse af denne procedure (typisk ~ 95%) er også illustreret i figur 3.
ve_content. "FO: keep-together.within-side =" 1 "> Afhængigt af de eksperimenter, der skal udføres, kan disse celler være pulset med en ønsket antigen og overført til histokompatible murine værter for immunologiske undersøgelser Desuden kan også disse celler bruges til in vivo undersøgelser af stimulerende eller lovgivningsmæssige aktiviteter fysiologiske DC delmængder. cellen udbytter for de rensede DC delmængder pr 2 x 10 7 totale splenocytter er cirka en million pdCs, 2 millioner CD8a Pos DCs og 4 millioner CD8a Neg DC'er.
Figur 1. Isolering af udviklingslandenes. En skematisk illustrerer de forskellige trin i protokollen til isolering af forskellige delgrupper i udviklingslandene. Klik her for at se en større version af dette tal. >
Figur 2. Analyse af Milt DC Undergrupper i mus med B16.Flt3L tumorer. A) gating-strategi er illustreret for at identificere de cellepopulationer svarer til pdCs (R1), CD8a Pos DC'er (R5) og CD8a Neg DC'er (R6). B) Ekspression af mPDCA1, 33D1, DEC205 og CD11 på forskellige undersæt. Cellerne indeholdt i gate R4 (en undergruppe af lymfocytter, der er negative for B220, CD11c, CD11) er anvendt som en kontrol population mangler ekspressionen af disse markører C) Relativ berigelse af DC og lymfocytundergrupper isoleret fra miltene fra mus på dag. 14 efter podning med B16.Flt3L melanomceller er vist i den venstre plot som sorte bjælker, mens hyppigheden af disse cellepopulationer i naive mus er vist som hvide søjler. Den rigtige plot viser de samme data som celle numre.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af Milt DC Undergrupper I Enrichment protokol. A) Berigelse af plasmacytoide DC'er (B220 Høje og CD11c Lav, R1) fra 10% i start befolkning af splenocytter fra B16.Flt3L tumorbærende mus til ~ 95% renhed i kolonne flyde gennem 1. Bemærk, at retentat celler elueres fra denne søjle er udtømt for denne population. B) Berigelse af konventionelle DCs (i CD11c høj, blanding af CD8a positive og negative) fra ~ 33% i milt fra B16.Flt3L melanom-bærende mus på dag 10 efter tumor implantering til ~ 78% i gennemstrømningen 2 fraktion. I kolonne retentat 2 parceller, de CD11c positive befolkninger synes at være partiallierede forarmet, svarende til fjernelsen af et betydeligt antal DC'er under negativ selektion at depletere T, B og NK celler. Yderligere fraktionering af gennemstrømningen 2 suspensionen op positiv selektion for anti-CD8-bindende udbytter> 95% renhed af CD8a Pos DC'er. Gennemstrømningen fra dette blev derefter udsat for positiv selektion for binding af anti-CD11 c, hvilket giver en befolkning på> 95% ren CD8a Neg udviklingslandene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendritiske celler accepteres at være den væsentligste professionelle antigen-præsenterende celler involveret i priming af T-celle responser. Deres vigtigste funktion er at kortlægge vævet mikromiljø ved at optage og behandle antigener til præsentation for T-celler. For at studere funktionen af specifikke delmængder af DC'er, disse skal isoleres i tilstrækkeligt antal under anvendelse af en fremgangsmåde der bevarer deres normale fænotype og funktioner. De fleste protokoller stole på isolering af specifikke DC delmængde fra naive mus. Da disse celler er sjældne, de isolationsprocedurer ikke er effektive og give et lavt antal celler. For eksempel vil en milt udbytte kun ca. 0,5 - 1 mio CD8 POS DC'er, mens de fleste eksperimenter udført med overførsel studier anvende mindst dette antal celler pr dyr. Således er en stor begrænsning af de eksisterende metoder er den manglende evne til at isolere tilstrækkeligt celleantal uden at bruge meget stort antal af donor mus og betydelige mængderaf reagenser. Vores fremgangsmåde i alt væsentligt overvinder disse problemer ved anvendelse af mus implanteret med en Flt-3L udskillende tumor i høj grad at udvide DC'er, hvilket tillader oprensning af et langt større antal af tre velkendt DC delmængde anvendelse af en række immunomagnetiske oprensningstrin. Den her beskrevne protokol giver derfor en væsentlig forbedring i forhold til eksisterende metoder i form af udbytter ved mindst flere gange.
Et par forbehold findes for den her beskrevne isolation protokol. Den største begrænsning er, at den anvendte procedure til isolering af disse celler kan uforvarende ændre deres fænotype. DC'er er stærkt følsomt overfor endotoksin kontaminering og mekaniske stimuli, der kan føre til ændringer i deres fænotype og funktion. En anden begrænsning ved denne teknik er afhængigheden af Flt-3L sekretion at udvide DC delmængder. Dette resulterer i manglende ekspansion i væv hjemmehørende DC delmængder, der ikke udtrykker Flt-3 receptoren.
Detbeskrevne protokol her afhængig af celle berigelse ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser. Kittet til isolering af celle oprensning leveres med en protokol, der indeholder vejledende mængder reagenser, som skal anvendes. Cellen ifølge tumorbærende mus er markant forskellig fra naive mus (figur 2C), og derfor har vi modificeret beløbene for reagenser, der anvendes i vores teknik for at opnå optimal celle renhed. De udviklingslandene er vedhæftende celler og kan knytte til kolonnen matrix ikke-specifikt. Ligevægt af søjlen seng med puffer indeholdende EDTA minimerer celleadhærens, og anvendelsen af serielle passage over to på hinanden følgende kolonner forbedrer celle renhed yderligere.
DC'er er meget vedhæftende celler og in vivo er generelt tæt forbundet med den ekstracellulære vævsmatrix. For at øge udbyttet, er det meget vigtigt at fordøje milt væv med collagenase og DNase tilstrækkelig time at udtrække en maksimale antal af disse celler. Det er også vigtigt at være sikker på, at de milt vævsfragmenter er fuldstændigt neddykket i collagenase / DNase I-opløsningen mens undergår fordøjelsen. Et andet kritisk træk DC isolation er at opretholde streng sterilitet og endotoxin-fri betingelser under isolationsproceduren, eftersom disse celler er meget endotoksin responsive. Der benyttes frisk fremstillede reagenser fra endotoxin-fri lagre, og filter sterilisere alle reagenser før brug. Alle celle isolation buffere og medier bør suppleres med FCS, der er certificeret til at være fri for påviselig endotoxin. Disse celler er også meget følsomme over for mekaniske stimuli og gentagen mekanisk stimulering kan ændre modning tilstand af disse celler. Selv om nogle mekanisk kraft er nødvendig for at tvinge vævet gennem en cellesigte efter collagenase fordøjelse, bør dette ske så skånsomt som muligt. Desuden bør kraftig pipettering af cellerne undgås så meget som possible, og bred boring pipettespidser bør anvendes til at minimere forskydningskræfter.
Den adoptiv overførsel model er anvendelig til undersøgelse af antigenpræsentation og T-celle-priming af specifikke delmængder af DC'er. Imidlertid er det blevet påvist i andre undersøgelser, der overfører af antigen kan forekomme fra antigen pulserende DCs til endogene DC'er. Således kan den adaptive immunrespons på initiativ af antigen-pulsede celler afspejle præsentation af endogene udviklingslandene udgør den "fanget" antigen og ikke af overført APC. Denne form for overførsel eksponentielt forøges, hvis de isolerede DC præparater indeholder døde eller døende celler. Det er derfor vigtigt at udføre DC isolation og transfer protocol så hurtigt som muligt, under anvendelse af sterile betingelser med forafkølet buffere kan forbedre celleoverlevelse. Vi valgte en relativt kort antigen pulserende periode på 4 timer af denne grund, med inkubering i lave bindende cellekulturplader at minimere fastgørelsen cellen underdette trin. Derudover kan forlænges dyrkningsbetingelser ændre modning status af dyrkede DC'er og kan påvirke resultatet af adoptiv overførsel eksperimenter 22.
Sammenfattende dendritiske cellebiologi er et meget aktivt område af forskning, og udvikling af en pålidelig metode til at generere DC'er der trofast afspejler deres in vivo fænotypiske og funktionel divergens giver en enorm mulighed for at studere disse celler. Dette bliver især vigtigt for undersøgelser med kemikalier, der kan modulere DC funktioner, men kan ikke administreres systemisk i dyremodeller. Behandling af isolerede DC delmængder af interesse ex vivo med disse kemikalier er en praktisk og praktisk gennemførlig fremgangsmåde, der kan hjælpe belyse de mekanistiske detaljer i antigenpræsentation pathways.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH / NIAID tilskud AI45889 til SAP Flow cytometri blev udført ved hjælp af FACS core faciliteter understøttes af Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) og Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
