Abstract
Dendrittiske celler (DCS) er profesjonell antigen-presenterende celler som først og fremst er ansvarlig for å anskaffe, bearbeide og presentere antigener på antigen-presenterende molekyler for å igangsette T-celle-mediert immunitet. Dendrittiske celler kan deles inn i flere fenotypisk og funksjonelt heterogene undergrupper. Tre viktige undergrupper av milt dendrittiske celler er plasmacytoid, CD8a Pos og CD8a Neg celler. De plasmacytoid DC er naturlige produsenter av type I interferon og er viktig for anti-virus-T-celle immunitet. Den CD8a Neg DC undergruppe er spesialisert for MHC klasse II antigen presentasjon og er sentralt involvert i grunning CD4 T-celler. Den CD8a Pos DC er primært ansvarlig for kryss-presentasjon av eksogene antigener og CD8 T-celle-grunning. De CD8a Pos DC har vist seg å være mest effektive i presentasjonen av glykolipidlagringsforstyrrelser antigener ved CD1d molekyler til en spesialisert T cell befolkningen kjent som invariant natural killer T (INKT) celler. Administrasjon av Flight-3 ligand øker hyppigheten av migrasjon av dendrittiske celler stamfedre fra benmarg, til slutt resulterer i utvidelse av dendrittiske celler i perifere lymfoide organer i murine modeller. Vi har tilpasset denne modellen for å rense et stort antall funksjonelle dendrittiske celler for anvendelse i celleoverførings eksperimenter for å sammenligne in vivo ferdighet av forskjellige DC-undergrupper.
Introduction
Dendrittiske celler (DC) ble oppdaget nesten førti år siden som "store stel (gresk dendron) celle" funnet i lymfoide organer 1. Mange studier har vist at DC er de eneste antigenpresenterende celler som effektivt kan stimulere naive T-celler 2. En viktig funksjon av disse cellene er opptak og presentasjon av antigener og deres effektiv behandling og lasting av disse på antigenpresenterende molekyler. I mus milt, kan DC separeres i plasmacytoid og konvensjonelle undergrupper. De plasmacytoid DC er preget av lav uttrykk for CD11c og høye nivåer av B220 og Gr-1. De er også positivt for overflaten markør mPDCA1 og skiller type I interferon som svar på bompenger som reseptor 9 (TLR9) ligander. Den konvensjonelle DC er høy for CD11c og MHC klasse II uttrykk. De kan deles i tre atskilte undergrupper basert på overflaten ekspresjon av fenotypiske markører slik som CD4, CD8a, DEC205, CD11b og dendrittiske cellen hemmende reseptor 2 (DCIR2, anerkjent av 33D1 antistoff) proteiner 3,4. De CD8a Pos DC er også kjent som cDC1, er positivt for DEC205, men negativt for myeloide markører som CD11b og 33D1. Den CD8a Neg DC, også kalt cDC2, er positive for 33D1, CD11b og CD4 men mangler DEC205. Den doble negative undergruppe (dvs. negativ for både CD4 og CD8a) er relativt sjeldne, og er negativ for DEC205 og 33D1. Det er den minst karakterisert undergruppe og kan være en mindre differensiert form av CD8a Neg DC.
Fenotypiske forskjeller i de forskjellige undergrupper DC også strekke seg til deres in vivo funksjoner. Den CD8a Neg DC er meget fagocytisk og antas å presentere eksogent antigen hovedsakelig via MHC-klasse II til CD4 T-celler 3. I motsetning til dette CD8a Pos DC er spesialisert for presentasjon av oppløselig protein antigen på MHC klasse Ii en mekanisme som kalles cross-presentasjon. Utfallet av kryss-presentasjon er avhengig av aktiveringsstatusen av disse DC 5, og kan enten føre til ekspansjon av cytotoksiske T-celler (CTL) eller utvikling av regulatoriske T-celler 6 2,7. Målretting av antigen til CD8a Pos DC bruker anti-DEC205-antistoff-mediert leveringsresultater i stor grad i sletting av T-celler 8, mens presentasjon av antigener avledet fra infiserte apoptotiske celler induserer en sterk CTL respons 9.
I tillegg til erkjennelse av peptidantigener, har pattedyrimmunsystem utviklet til å gjenkjenne lipid og glykolipid-antigener. Disse antigener er presentert av CD1-molekyler, som er MHC klasse I-liknende celleoverflateproteiner som finnes i flere beslektede former i forskjellige pattedyr. I mus, en enkelt type av sterkt konservert CD1 molekyl kalt CD1d er ansvarlig for presentasjon av glykolipid-antigener 10. Majoren populasjon av T-celler som gjenkjenner CD1d / glykolipidlagringsforstyrrelser komplekser kalles invariante NKT-celler (INKT celler). Disse cellene uttrykker en semi-invariant T-celle reseptor (TCR) består av en invariant TCRα kjede som er sammenkoblet med TCRβ kjedene som har begrenset mangfold 11. I motsetning til konvensjonelle T-celler som trenger å spre og differensiere til å bli aktiverte effektor T-celler, INKT celler eksistere som en effektor befolkning og begynne å reagere raskt etter Glykolipidet administrasjon 12. Identifisering av fysiologisk relevant lipid antigenpresenterende celler, er et aktivt forskningsområde, og flere forskjellige celletyper, for eksempel B-celler, makrofager og DCS er blitt foreslått for å utføre denne funksjonen. Imidlertid ble det vist at den CD8a Pos undergruppe av DC er den primære cellen som medierer opptak og presentasjon av antigener til lipid mus INKT celler 13 og glycolipid-formidlet kryss priming av CD8 T-celler 14.
ove_content "> For å sammenligne effektiviteten av antigenpresentasjon ved forskjellige antigenpresenterende celler, er en grei måte for å overføre forskjellige typer av renset APC pulsert med ekvivalente mengder av antigen i naive verter. Cell overførings eksperimenter av denne art er ofte utført for immunologiske studier. imidlertid utfører overføringsstudier med ex vivo antigen-behandlede DC er vanskelig, siden disse cellene eksistere som sjeldne populasjoner i lymfoide organer hvor de utgjør mindre enn 2% av totale celler 15. det er derfor nødvendig å forbedre utviklingen av disse celler i donordyrene for å øke effektiviteten av isolerings protokoller.Det er kjent at den felles lymfoid og felles myeloide stamceller, som er nødvendig for generering av PDC, CD8 Pos og CD8 Neg DC undergrupper, hurtig FMS-relaterte reseptortyrosinkinasehemming 3 (Flt-3). Ved in vivo Flt-3 ligand (Flt-3L) administrasjon, utvanion av Flt-3-uttrykkende stamceller fra benmarg blir øket, noe som resulterer i økt såing av perifere lymfoide organer og utvidelse av deres modne DC avkom 16. Expression of Flight-3 er tapt under forpliktelse til B, T eller NK-celle differensiering veier. Derfor er det bare minimale endringer observert i disse cellene ved Flt-3L administrasjon. Tilsvarende utvidelse i DC-populasjonene er observert hos mus som har svulster som er generert av implantasjon av et B16-melanom-cellelinje som utskiller muse-Flt-3L, som gir en enkel og økonomisk metode for å tilveiebringe vedvarende systemiske nivåer av Flt-3L 17,18. Ved bruk av denne tilnærmingen, har vi utviklet en protokoll basert på implantasjon av B16-melanomceller som utskiller Flt-3L til å stimulere ekspansjonen av alle normale DC undergrupper i musemilt, og dermed i stor grad øke utbyttene av disse cellene som kan bli isolert for etterfølgende eksperimenter . Vi finner stadig at innen 10 - 14 dager etter subkutan implantasje av Flight-3 sekresjon svulst, mus utvikler splenomegali med markert berikelse av DC til å utgjøre 40 - 60% av totale miltceller. Fra disse milt, kan forskjellige DC undergrupper isoleres med høy renhet ved hjelp av standard kommersielt tilgjengelige celle rensing kits som benytter undergruppe spesifikke fenotypiske markører.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk er gjort i henhold til vedtatte retningslinjer fra institusjonelle Animal Care og bruk komité (IACUC). Alle prosedyrer som krever sterilitet er utført i et biosikkerhet skap.
1. Implantasjon av B16.Flt3L Melanom i Mus
- Kultur den Flt-3-uttrykkende B16 melanomcellelinjen T25 i vevskulturflasker med en tetthet på 0,5 x 10 6 celler / ml i komplett DMEM-medium med 10% CO2 ved 37 ° C. Vokse til cellene når ~ 90% samløpet (~ 20 timer).
- Høste cellene med trypsin fordøyelse. Sug cellekulturmedier og vaske heft cellene med PBS. Tilsett 5 ml av 0,05% trypsin og inkuberes i 5 minutter ved 37 ° C. Legg kalde 20 ml komplett DMEM-medium (4 ° C) inneholdende føtalt kalveserum (FCS) for å stanse proteasenedbrytning. Løft cellene seg ved et lett trykk etterfulgt av forsiktig pipettering opp og ned.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 300xg i 10 minutter ved 4 ° C. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert cellelevedyktighet teller. Resuspender til en densitet på 10 8 celler / ml i PBS.
- Implantat mus (C57BL / 6 eller en annen histocompatible stamme) med tumorceller ved subkutan injeksjon som beskrevet av Machholz et al. 19 på undersiden av halsen med 100 ul av cellesuspensjonen (10 7 celler).
- Tillat svulsten å vokse inntil palpable eller synlige (2 - 10 mm i diameter, vanligvis 7 - 12 dager) før ofre dyr for å stjele organer.
2. Utarbeidelse av milt enkelt celle Suspensjon fra svulst bærende mus
- Anesthetize mus med en overdose av isofluran (justere flow rate av isofluran til> 5% og fortsette eksponering minst 2 min etter puste stopp). Ofre Flt-3 melanom svulst bærende mus ved halshugging i henhold til institusjonelle retningslinjer for aktiv dødshjelp.
- disinfect huden med 70% etanol og høste milt ved bruk av aseptisk teknikk ved hjelp av steril saks 20.
- Plasser milt i en steril petriskål for transport til biosikkerhet skapet. Utfør alle trinn fra her på under sterile forhold.
- Overfør milten til en ny petriskål og vask med RPMI medium. Skjær milt i små (~ 0,2 cm 2) biter ved hjelp av en skalpell. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C med 10 ml collagenase / DNase-løsning.
- Hell delvis fordøyd suspensjon av miltvevet på en 70 mikrometer celle sil. Å komprimere de resterende vevfragmenter gjennom maskene av silen ved hjelp av en 5 ml sprøyte stempelet.
- Vask mesh filter med 10 ml friskt medium og kast filteret. Sentrifuger suspensjonen ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C for å pelletere cellene.
- Aspirer supernatanten og cellepelleten suspenderes i 2 ml RBC lyseringsbuffer. Inkuber ved RT feller 10 min. Slukke RBC lysis buffer ved tilsetning av 10 ml komplett RPMI-medium.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Resuspender i passende mengde for å oppnå celletetthet på 10 8 celler / ml i cellesortering buffer (f.eks MACS) inneholdende 20 ug / ml Fc-blokk-antistoff (2.4G2).
3. Rensing av Plasmacytoid DC, CD8a Pos DC og CD8a Neg DC fra milt enkelt cellesuspensjon
Merk: Isolering av milt DC undergrupper fra enkeltcelle-suspensjon er en flertrinns prosedyre som illustrert i figur 1. Utfør alle trinnene ved hjelp av pre-avkjølt buffer og et isvannbad for å holde temperaturen ved 4 - 8 ° C.. Alle reagensvolumene i neste avsnitt av protokollen er beregnet for en første inngang på 200 ul miltcellesuspensjon 10 8 celler / ml). Dette kan skaleres opp ellerned basert på behov ved å endre volumet av cellesuspensjon (alltid ved en tetthet på 1 x 10 8 celler / ml) og andre reagenser proporsjonalt i det første trinn (3.1.1 og 3.2.1). Juster reagensvolumene i alle senere trinn tilsvarende. Hvis for eksempel starter med 100 mL av miltcellesuspensjonen ved 1 x 10 8 / ml ved å bruke halvparten av angitte reagensvolumene i alle trinn.
- Isolering av Plasmacytoid DC (PDC)
- Tilsett 300 pl av biotin-merket antistoff cocktail anordnet i plasmacytoid DC isolasjonskit til 200 ul av miltcellesuspensjon.
- Bland godt og inkuber på is vannbad i 15 min. Tapp røret etter 3 min for å holde celler suspendert, og for å maksimere antistoffbinding.
- Tilsett 12 ml cellesortering buffer og pelletere cellene ved sentrifugering ved 300 x g i 5 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten for å fjerne ubundne biotinylerte antistoffer.
- Resuspender cellenpellet i 500 mL av celle sortering buffer. Tilsett 300 ul anti-biotin antistoff-konjugerte perler. Gjenta trinn 3.1.2 og 3.1.3.
- Fjern supernatant og cellepelleten suspenderes i 2 ml cellesortering buffer. Utfør alle trinn fra dette punktet på ved RT bruker forhåndskjølt buffere.
- Plasser en ny magnetisk aktivert cellesortering LS kolonne i det magnetiske stativet. Vask og ekvilibreres kolonnen med 5 ml av cellesortering buffer.
- Pipetter cellesuspensjonen på kolonnen, å anvende den forsiktig til midten av overflaten av kolonnelaget. Samle strømningen gjennom.
- Vask kolonnen med 10 ml av cellesortering buffer. Samle denne flyten gjennom og kombinere med strømmen gjennom fra trinn 3.1.7. De PDCs er beriket i denne kolonnen strømmen gjennom (FT1).
- Pellet cellene fra FT1 ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, resuspendert i 2 ml buffer cellesortering og passerer cellene gjennom en frisk LS kolonneved å gjenta trinn 3.1.6 - 3.1.8. Denne anvendelse av to påfølgende kolonner gir forbedret renhet av isolerte celler.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og resuspender med 2 ml komplett RPMI. Plasser på is inntil nødvendig.
- Isolering av CD8a Pos og CD8a Neg DC
Merk: Det første trinnet i denne prosedyren er uttømming av B, PDC, T- og NK-celler.- Fra og med hele miltcellesuspensjon (1 ml av 10 8 celler / ml oppnådd i trinn 2.8), tilsett 100 pl av biotin-konjugert antistoff cocktail anordnet i CD8a Pos DC isolasjonskit.
- Bland godt og inkuber på is vannbad i 15 min. Trykk røret forsiktig hver 3 min å maksimere binding av biotin-merket antistoffer til sine målceller.
- Tilsett 12 ml cellesortering buffer og pelletere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Sug superliggende væske for å fjerne ubundne biotinylerte antistoffer.
- Tilsett 150 ul av cellesortering buffer og 100 ul av anti-biotin-perler som er gitt i CD8a Pos DC isolasjonskit. Bland godt og inkuber på is vannbad i 15 min.
- Tilsett 10 ml cellesortering buffer og pelletere cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender celler i en ml cellesortering buffer og passerer over en fersk LS kolonne i henhold til prosedyren i trinn 3.1.6 via 3.1.8.
- Samle umerkede strømmen gjennom to (FT2) og kast kolonnen retentat. Dette umerket brøkdel er beriket for CD8a Pos og CD8a Neg DC.
- Pellet cellene i FT2 ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellene i 1 ml cellesortering buffer og tilsett 200 ul av anti-CD8a konjugerte magnetiske kuler anordnet i CD8a Pos DC isolasjonskit.
- Repspise trinn 3.2.2 via 3.2.6. Strømningen gjennom av kolonnen anriket for CD8a Neg DCS og utarmet for CD8a Pos DCS. Dette er merket strømmen gjennom tre (FT3).
- For å eluere CD8a Pos DC holdes tilbake i kolonnen, fjerne kolonnen fra magneten, tilsett 5 ml av cellesortering buffer og rense kolonnen matrise ved hjelp av stempelet er forsynt med LS kolonne.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten og resuspender i 1 ml cellesortering buffer. For å øke renheten, kjøre eluert cellene igjen gjennom en ny LS-kolonne ved å gjenta trinn 3.1.6 til 3.1.8, unntatt forkaste flyten gjennom og samle tilbakeholdt celler som i 3.2.11.
- For å rense CD8a Neg DC fra FT3 suspensjon, pelletere FT3 ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspendert i 300 ul av cellesortering buffer.
- Tilsett 100 ul anti-CD11c magmagnetiske perler. Bland godt og inkuber på is vannbad i 15 min.
- Tilsett 10 ml cellesortering buffer og pellets celler ved sentrifugering ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Gjenta trinn 3.1.5 via 3.1.8. Den CD8a Neg DC er positivt valgt med CD11c perler og er bundet til kolonnen. Strømmen gjennom kan kastes.
- Eluere cellene holdes tilbake i kolonnen som beskrevet i trinn 3.2.11 for å samle det rensede CD8a Neg DC.
4. Pulserende APC med antigener og Cell Transfer
- Telle levende celler etter rensing ved hjelp av trypanblått eksklusjon 21 å skille levende og døde celler.
- Inkuber cellene med antigenet av valget. Bruk analoger av glykolipid antigen kalt alfa-galaktosyl ceramid (αGalCer) ved 100 nM konsentrasjon 13. Vanligvis plate 10 6 levedyktige celler / brønn i fullstendig RPMI medium ved hjelp av ultra-lav Attachment U-bunn 96-brønners plater for å redusere cellefesting. Cellene inkuberes i en 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C, 1 - 4 timer.
- Harvests celler ved forsiktig pipettere flere ganger. Bruk brede boringen pipetter for å redusere celleskader fra skjærkrefter. Vask brønner med PBS og basseng disse vasker å maksimere celle innhøsting.
- Pellet cellene ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C og resuspendere til ønsket tetthet i PBS. Vanligvis injiserer 1 million celler i 200 mL per mottaker dyr. Hold cellene på is for å maksimere levedyktighet før administrering til vertsdyr.
- Injisere cellene intravenøst i mus enten via lateral halen forgjeves eller retro-orbital venøs plexus 19. Bruk en 27 G nål på en 1 ml sprøyte og injisere maksimalt volum på 0,1 ml per mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utfallet av denne prosedyren er avhengig av utvidelse av DC undergrupper av muse Flt-3L uttrykt av de implanterte melanomceller. Den B16.Flt3L tumor ble avledet fra en C57BL / 6 mus, og bør implanteres i dyr med at stamme bakgrunn for å unngå svikt i svulsten til å etablere seg på grunn av avvisning. I noen tilfeller kan det være ønskelig å anvende genetisk modifiserte mus for å utlede DC med kjente feil i signalveier eller reseptorer av interesse. Det er viktig å huske på at svulsten kan utvikle med ulike kinetikk i slike dyr, så det er viktig å overvåke tumorvekst basert på utseende og palpasjon ved inokulasjon området. I vår erfaring, når svulsten er håndgripelig, det B16.Flt3L svulst bærende mus konsekvent viser en markert økning i milt cellularity som korrelerer med utvidelse av alle DC undergrupper (Figur 2A). Vi vanligvis se en 2- til 3-fold increase i antall totale splenocytes hentet fra B16.Flt3L melanom-bærende mus sammenlignet med naive dyr. Økningen i antallet DC delvis bidrar til den tilsynelatende reduksjon i hyppigheten av B-celler, mens det er liten eller ingen endring i de absolutte antall av B-celler. Interessant, mens en stor utvidelse (~ 15- til 20-gangers økning i den absolutte tall) observeres for konvensjonelle DC i disse mus, er det bare en beskjeden økning (ca. 4 ganger) ble observert i plasmacytoid DC delsettet.
Den gating strategi for å identifisere forskjellige DC undergrupper er vist i figur 2A, og er basert på ekspresjonen av B220, CD11b, CD11c og CD8a som undergruppespesifikke fenotypiske markører (figur 2B). Vi undersøkte også DEC205, CD11b og mPDCA1 ekspresjon på følgende undergrupper som vist i figur 2B. Dette viser den forventede mønster, med mPDCA bare på PDC undergruppe, mens desember 205 er uttrykt sterkt på CD8a Pos DC og CD11b oppdages mest fremtredende på CD8a Neg DC. Vi analyserte også endringer i celle-frekvensene for hver av undermengdene renset ved hvert trinn av den protokoll som er beskrevet her (oppsummert i figur 2C, med detaljerte eksempler på de strømningscytometriske dataene på figur 3). Isolering av milt DC undergrupper som er beskrevet i denne fremgangsmåte er en flertrinns prosedyre (figur 1). Rensing av plasmacytoid DC er avhengig av negativ seleksjon for å berike disse cellene etter uttømming av alle uønskede populasjoner som B, T, NK-celler og konvensjonelle DC. Rensing av CD8a Pos DC, og CD8a Neg DC utføres ved positiv seleksjon av disse cellene etter uttømming av T-, B- og NK-celler. Den høye renhet av hver av DC-delmengdene oppnådd ved anvendelse av denne fremgangsmåten (typisk ~ 95%) er også illustrert i figur 3.
ve_content. "fo: holde-together.within-siden =" en "> Avhengig av eksperimentene som skal utføres, kan disse cellene bli pulset med et ønsket antigen og overført til histocompatible murine verter for immunologiske studier I tillegg er disse cellene kan også brukes til in vivo studier av stimulerende eller regulatoriske aktiviteter fysiologiske DC undergrupper. cellen avkastning for de rensede DC undergrupper per 2 x 10 7 totale splenocytes er rundt én million PDCs, 2.000.000 CD8a Pos DC og 4.000.000 CD8a Neg DC.
Figur 1. Isolering av DC. En skjematisk illustrerer de ulike trinnene i protokollen for isolering av ulike undergrupper av DC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. >
Figur 2. Analyse av Spleniske DC Delsett i mus med B16.Flt3L Svulster. A) Gating strategi er illustrert til å identifisere cellepopulasjoner som tilsvarer PDCs (R1), CD8a Pos DC (R5) og CD8a Neg DC (R6). B) Uttrykk for mPDCA1, 33D1, DEC205 og CD11b på ulike undergrupper. Cellene inneholdt i gate R4 (en undergruppe av lymfocytter, negative for B220, CD11c, CD11b) blir anvendt som en kontrollpopulasjon som mangler ekspresjon av disse markørene C) Relativ berikelse av DC og lymfocytt-undergrupper isolert fra milten hos mus ved dag. 14 etter inokulering av B16.Flt3L melanomceller er vist i den venstre tomten som svarte striper, mens hyppigheten av disse cellepopulasjoner i naive mus er vist som hvite striper. Retten plottet viser de samme dataene som celle tall.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Analyse av Spleniske DC Delsett Under berikelse protokollen. A) Anriking av plasmacytoid DC (B220 Høye og CD11c Low, R1) fra 10% i start befolkningen i splenocytes fra B16.Flt3L svulst bærende mus til ~ 95% renhet i kolonne strømme gjennom 1. Merk at retentat celler eluert fra denne kolonnen er brukt i denne populasjonen. B) Anriking av konvensjonelle DC (i CD11c High, blanding av CD8a positive og negative) fra ~ 33% i milten av B16.Flt3L melanom-bærende mus på dag 10 etter tumor implantasjon til ~ 78% i strømningen gjennom to fraksjon. I kolonnen retentat 2 tomter, de CD11c positive bestander synes å være partially oppbrukt, svarende til fjerning av betydelige mengder DC i løpet av negativ seleksjon å utarme T-, B- og NK-celler. Ytterligere fraksjonering av strømmen gjennom to suspensjonen med positiv utvelgelse for anti-CD8 bindende gir> 95% renhet av CD8a Pos DC. Flyten gjennom fra dette ble deretter utsatt for positiv utvelgelse for binding av anti-CD11c, noe som gir en befolkning på> 95% ren CD8a Neg DC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendrittiske celler er akseptert å være den viktigste profesjonell antigen-presenterende celler som er involvert i priming av T-celle-responser. Deres viktigste funksjon er å kartlegge vevet mikromiljøet ved å ta opp og behandle antigener for presentasjon til T-celler. For å studere funksjonen av spesifikke DC undergrupper, må disse isoleres i tilstrekkelig antall ved hjelp av en fremgangsmåte som opprettholder sin normal fenotype og funksjoner. De fleste protokoller er avhengige av isoleringen av spesifikke undersett DC fra naive mus. Siden disse cellene er sjeldne, er isoleringsprosedyrer er ikke effektive, og gir lavt antall celler. For eksempel vil en milt gi bare ca 0,5 til 1.000.000 CD8 pos DC, mens de fleste eksperimenter utført med overføringsstudier bruke minst dette antall celler per dyr. Således, en vesentlig begrensning av de eksisterende metoder er den manglende evne til å isolere tilstrekkelig antall celler uten å bruke meget store mengder av donor-mus og betydelige mengderav reagenser. Vår fremgangsmåte hovedsakelig overvinner disse problemene ved hjelp av mus implantert med en Flt-3L utskillende tumor som utvider DCS, slik at rensingen av mye større antall av tre godt anerkjent DC delsettet ved hjelp av en serie av immunomagnetiske rensetrinn. Protokollen er beskrevet her gir derfor en stor forbedring i forhold til eksisterende metoder i form av utbytter ved minst flere ganger.
Noen advarsler eksisterer for isolering protokollen beskrevet her. Den største begrensningen er at fremgangsmåten som brukes for å isolere disse cellene ved en feil kan forandre deres fenotype. DC er utsøkt sensitive for endotoksin forurensning og mekaniske stimuli som kan føre til endringer i fenotype og funksjon. En annen begrensning ved denne teknikken er avhengigheten av Flt-3L sekresjon å utvide DC undergrupper. Dette resulterer i mangel på ekspansjon i vev bosatt DC undergrupper som ikke uttrykker den Flt-3 reseptoren.
DeProtokollen er beskrevet her er avhengig av celle berikelse bruke kommersielt tilgjengelige reagenser. Settet for isolering av celle rensning kommer med en protokoll som inneholder de anbefalte mengder av reagenser som skal brukes. Cellen Sammensetningen av tumorbærende mus er dramatisk forskjellig fra den til naive mus (figur 2C), og vi har derfor modifisert mengdene av reagenser som brukes i vår teknikk for å oppnå optimal celle renhet. DCS er festede celler og kan knytte til kolonnematrise ikke-spesifikt. Ekvilibrering av kolonnen seng med EDTA-holdig buffer minimerer celle tilslutning, og bruken av serie føring over to påfølgende kolonner forbedrer celle renhet ytterligere.
DC er svært heftende celler og in vivo er vanligvis nært knyttet til den ekstracellulære vev matrix. For å øke utbyttet, er det meget viktig å fordøye miltvevet med collagenase og DNase for tilstrekkelig time for å trekke ut et maksimalt antall av disse cellene. Det er også viktig å være sikker på at milt vevsfragmentene blir fullstendig neddykket i collagenase / DNase I-løsningen, mens under fordøyelse. Et annet kritisk trekk DC isolasjon er å opprettholde streng sterilitet og endotoksin-frie betingelser under isolasjonsprosedyren, siden disse cellene er sterkt responsive endotoksin. Bruk nylagede reagenser fra endotoksin-frie aksjer, og filter sterilisere alle reagenser før bruk. Alle celleisolasjons buffere og media bør suppleres med FCS som er sertifisert til å være fri for detekterbare endotoksin. Disse cellene er også meget følsomme for mekaniske stimuli og gjentatt mekanisk stimulering kan endre tilstanden modningen av disse cellene. Selv om noen mekanisk kraft er nødvendig for å tvinge vev gjennom en celle sil etter collagenase fordøyelsen, bør dette gjøres så skånsomt som mulig. I tillegg bør kraftig pipettering av cellene unngås så mye som possible, og utenfor boringen pipettespissene bør brukes for å redusere skjærkrefter.
Adoptiv overføring modellen er nyttig for undersøkelse av antigen presentasjon og T-celle priming av bestemte undergrupper av DC. Imidlertid har det blitt demonstrert i andre studier som overfører av antigen kan oppstå fra antigen-pulset DC til endogene DC. Således kan den adaptive immunrespons konstruert av antigenpresenterende celler pulsert reflektere presentasjon av endogene DC presentere de "fanget" antigen og ikke som overføres APC. Denne typen overføring eksponentielt økes hvis de isolerte DC preparatene inneholde døde eller døende celler. Det er derfor viktig å utføre DC isolasjon og overføringsprotokoll så hurtig som mulig, ved å bruke sterile betingelser med forhåndsavkjølt buffere for å forbedre celleoverlevelse. Vi har valgt en forholdsvis kort antigen pulsing periode på 4 timer på grunn av dette, med inkubering i svakt bindende cellekulturplater for å redusere cellefesting i løpet avdette trinnet. I tillegg kan utvides kulturen tilstand endrer status modningen av dyrkede DC, og kan påvirke utfallet av adoptive overføringsforsøk 22.
Oppsummert er dendrittiske cellebiologi et meget aktivt forskningsområde, og utvikling av en pålitelig metode for å generere DC som trofast reflekterer deres in vivo fenotypiske og funksjonelle avvik gir en enorm mulighet til å studere disse cellene. Dette blir spesielt viktig for studier med kjemikalier som kan modulerer DC-funksjoner, men kan ikke administreres systemisk inn i dyremodeller. Behandling av de isolerte DC undergrupper av interesse ex vivo med disse kjemikaliene er en praktisk og gjennomførbar tilnærming som kan bidra til å belyse de mekanistiske detaljer antigen presentasjon trasé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIAID stipend AI45889 til SAP Flowcytometri studier ble utført ved hjelp av FACS kjernefasiliteter som støttes av Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) og Senter for AIDS forskning (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
