Abstract
Dendritiska celler (DC) är professionella antigenpresenterande celler i första hand orsakar att förvärva, bearbeta och presentera antigener på antigenpresenterande molekyler för att initiera T-cellförmedlad immunitet. Dendritiska celler kan separeras i flera fenotypiskt och funktionellt heterogena delmängder. Tre viktiga delmängder av mjälte dendritiska celler är plasmacytoid, CD8a Pos och CD8a Neg celler. De plasmacytoid DCs är naturliga producenter av typ I interferon och är viktiga för antiviral T-cellimmunitet. CD8a Neg DC delmängd är specialiserad för MHC klass II antigenpresentation och är centralt involverad i priming CD4 T-celler. CD8a Pos DC är primärt ansvariga för kors presentation av exogena antigener och CD8 T-cell priming. CD8a Pos DCs har visat sig vara mest effektiv vid presentationen av glykolipid antigener genom CD1d molekyler till en specialiserad T cell befolkning kallas invariant naturliga mördar T (inkt) celler. Administration av Flt-3 ligand ökar frekvensen av migration av dendritiska celler stamceller från benmärg, vilket slutligen resulterar i expansion av dendritiska celler i perifera lymfoida organ i musmodeller. Vi har anpassat denna modell för att rena stora mängder av funktionella dendritiska celler för användning i cellöverförings experiment för att jämföra in vivo kunskaper olika DC delmängder.
Introduction
Dendritiska celler (DC) upptäcktes nästan fyrtio år sedan som "stora stel (grekiska kvistar) cell" som finns i lymfoida organ 1. Många studier har visat att DC: er är de enda antigenpresenterande celler som effektivt kan stimulera naiva T-celler 2. En viktig funktion av dessa celler är upptaget och presentation av antigener och effektiv behandling och lastning av dessa på antigenpresenterande molekyler. I musmjälte kan DCs delas in plasmacytoid och konventionella delmängder. De plasmacytoid DC kännetecknas av lågt uttryck av CD11c och höga nivåer av B220 och Gr-1. De är också positivt för ytmarkör mPDCA1 och utsöndrar typ I interferon som svar på toll like receptor 9 (TLR9) ligander. De konventionella DC är höga för CD11c och MHC klass II uttryck. De kan delas upp i tre distinkta undergrupper baserade på ytexpression av fenotypiska markörer såsom CD4, CD8a, DEC205, CD11b och dendritiska celler hämmande receptor 2 (DCIR2, erkänts av 33D1-antikroppen) proteiner 3,4. CD8a Pos DC är också kända som CDC1, är positiva för DEC205, men negativt för myeloida markörer som CD11b och 33D1. CD8a Neg DC, även kallad cdc2, är positiva för 33D1, CD11b och CD4 men saknar DEC205. Den dubbla negativa delmängd (dvs negativ för både CD4 och CD8a) är relativt sällsynt, och är negativ för DEC205 och 33D1. Det är den minst karakteriserade delmängd och kan vara en mindre differentierad form av CD8a Neg DC.
Fenotypiska skillnader i olika DC delmängder omfattar även deras in vivo funktioner. CD8a Neg DC är mycket fagocytiska och tros presentera exogen antigen huvudsakligen via MHC klass II till CD4 T-celler 3. I motsats härtill CD8a Pos DCs är specialiserade för presentation av lösligt protein antigen på MHC klass Ii en mekanism som kallas cross-presentation. Resultatet av kors presentation beror på aktiveringsstatus av dessa DC 5, och kan antingen leda till expansion av cytotoxiska T-celler (CTL) eller utveckling av regulatoriska T-celler 6 2,7. Inriktning av antigen till CD8a Pos DC med hjälp av anti-DEC205-antikroppsmedierade leveransresultat i stort sett borttagningen av T-celler 8, medan presentation av antigener härledda från infekterade apoptotiska celler inducerar ett starkt CTL-svar 9.
Förutom erkännande av peptidantigener, har däggdjurs immunsystem utvecklats för att känna igen lipid och glykolipid antigener. Dessa antigener presenteras av CD 1-molekyler, vilka är MHC klass I-liknande cellytproteiner som finns i flera relaterade former i olika däggdjur. Hos möss, är ansvarig för presentation av glykolipid antigener 10 en enda typ av högkonserverade CD1 molekyl som kallas CD1d. den stora population av T-celler som känner igen CD1d / glykolipid komplex kallas invariant NKT-celler (inkt celler). Dessa celler uttrycker en halv invariant T-cellsreceptor (TCR) som består av en invariant TCRα kedja som är ihopkopplade med TCRβ kedjor som har begränsad mångfald 11. Till skillnad från konventionella T-celler som behöver föröka sig och differentiera för att bli aktiverade T-celler, existerar inkt celler som en effektor befolkningen och börja reagera snabbt efter glykolipid administration 12. Identifiering av fysiologiskt relevant lipid antigenpresenterande celler är ett aktivt forskningsområde, och flera olika celltyper såsom B-celler, makrofager och DC har föreslagits för att utföra denna funktion. Emellertid visades det att den CD8a Pos delmängd av DC: er är den primära cellen som medierar upptaget och presentation av lipid antigener mot mus inkt celler 13 och glykolipid medierad tvär primning av CD8 T-celler 14.
ove_content "> För att jämföra effektiviteten av antigenpresentation av olika antigenpresenterande celler, är en okomplicerad metod för att överföra olika typer av renade APC pulserade med ekvivalenta mängder av antigen i naiva värdar. Cell överförings experiment av denna typ är ofta utförda för immunologiska studier. Men utför överföringsstudier med ex vivo antigen behandlad DC är utmanande, eftersom dessa celler existerar som sällsynta populationer i lymfoida organ där de utgör mindre än 2% av de totala celler 15. det är därför nödvändigt att främja utvecklingen av dessa celler i donatordjur att öka effektiviteten hos isoleringsprotokoll.Det är känt att den gemensamma lymfatisk och gemensamma myeloida stamceller, som erfordras för generering av PDC CD8 Pos och CD8 Neg DC delmängder, express fms-relaterade receptor tyrosinkinas 3 (Flt-3). Vid in vivo Flt-3-ligand (Flt-3L) administration, emigration av Flt-3 uttrycker progenitorceller från benmärg ökas, vilket resulterar i ökad odling av perifera lymfoida organ och utvidgning av deras mogna DC avkomma 16. Expression av Flt-3 förloras under engagemang för B, T eller NK celldifferentiering vägar. Därför är endast minimala förändringar observerades i dessa celler vid Flt-3L administration. Liknande expansion i DC populationer har observerats i möss som bär tumörer som genereras av implantation av en B16-melanom cellinje utsöndrar murin Flt-3L, vilket ger en enkel och billig metod för att tillhandahålla ihållande systemiska nivåer av Flt-3L 17,18. Med hjälp av denna metod har vi utvecklat ett protokoll baserat på implantation av B16-melanomceller utsöndrar Flt-3L för att stimulera utbyggnaden av alla normala DC delmängder i musmjälte, vilket avsevärt ökar utbytena av dessa celler som kan isoleras för efterföljande experiment . Vi finner genomgående att inom 10 - 14 dagar efter subkutan implantering av Flt-3 utsöndrar tumör, möss utvecklar splenomegali med markant anrikning av DC utgöra 40-60% av den totala mjältceller. Från dessa mjältar kan olika DC delmängder isoleras med hög renhet genom att använda standard kommersiellt tillgängliga cell renings kit som använder delmängd specifika fenotypiska markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök görs i enlighet med godkända riktlinjer från den institutionella djurvård och användning kommitté (IACUC). Alla procedurer som kräver sterilitet utförs i en biosäkerhet skåp.
1. Implantation av B16.Flt3L Melanom hos möss
- Kultur Flt-3 som uttrycker B16-melanom-cellinjen i T25 kolvar för vävnadsodling vid en densitet av 0,5 x 10 6 celler / ml i komplett DMEM-medium med 10% CO2 vid 37 ° C. Växa tills cellerna når ~ 90% konfluens (~ 20 h).
- Skörda cellerna genom trypsinbehandling matsmältningen. Aspirera cellodlingsmedia och tvätta de vidhäftande cellerna med PBS. Tillsätt 5 ml 0,05% trypsin och inkubera under 5 min vid 37 ° C. Lägga kalla 20 ml komplett DMEM-medium (4 ° C) innehållande fetalt kalvserum (FCS) för att släcka proteasspjälkning. Lyfta cellerna av genom att knacka lätt följt genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Samla upp cellerna genom centrifugering vid 300xg under 10 min vid 4 ° C. Räkna cellerna med användning av en hemocytometer eller en automatiserad cellviabilitet räknare. Återsuspendera till en densitet av 10 8 celler / ml i PBS.
- Implantat möss (C57BL / 6 eller annan histokompatibel stam) med tumörceller genom subkutan injektion såsom beskrivits av Machholz et al. 19 vid basen av halsen med 100 pl av cellsuspensionen (10 7 celler).
- Låt tumören att växa tills påtagliga eller synliga (2 - 10 mm i diameter, vanligen 7 - 12 dagar) innan offra djur för organskörd.
2. Beredning av mjälten enda cellsuspension från tumörbärande möss
- Söva möss med en överdos av isofluran (justera flödet av isofluran till> 5% och fortsätter exponeringen åtminstone två minuter efter andnings stopp). Offra Flt-3 melanomtumörbärande musen genom halsdislokation enligt institutionens riktlinjer för dödshjälp.
- disinfect huden med 70% etanol och skörd mjälte med aseptisk teknik med hjälp av steril sax 20.
- Placera mjälten i en steril petriskål för transport till biosäkerhet skåpet. Utför alla steg härifrån på under sterila förhållanden.
- Överför mjälte till en ny petriskål och tvätta med RPMI-medium. Skär mjälten i små (~ 0,2 cm 2) bitar med hjälp av en skalpell. Inkubera i 30 min vid 37 ° C med 10 ml kollagenas / DNas-lösning.
- Häll delvis smälta suspensionen av mjälten vävnad på en 70 ìm cell sil. Komprimera de återstående vävnadsfragment genom nätet av silen med hjälp av en 5 ml sprutkolv.
- Tvätta nätfiltret med 10 ml färskt medium och kassera filtret. Centrifugera suspensionen vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C för att pelletera cellerna.
- Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 2 ml lyseringsbuffert. Inkubera vid RT feller 10 min. Släck RBC lyseringsbuffert genom tillsats av 10 ml av komplett RPMI-medium.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Återsuspendera i lämplig volym för att uppnå celldensitet på 10 8 celler / ml i cellsortering buffert (t.ex. MACS) innehållande 20 | ig / ml av Fc-blocket antikropp (2.4G2).
3. Rening av Plasmacytoid DC, CD8a Pos DCs och CD8a Neg DC från mjälten Single Cell Suspension
Obs: Isolering av mjälten DC delmängder från enkelcellsuspension är ett flerstegsförfarande som visas i figur 1 Utför alla stegen med nedkylda buffert och ett isvattenbad för att hålla temperaturen vid 4-8 ° C.. Alla reagensvolymer i följande avsnitt av protokollet beräknas för en inledande inmatning av 200 pl mjälten cellsuspensionen vid 10 8 celler / ml). Detta kan skalas upp ellerner baserat på dina behov genom att ändra volymen av cellsuspensionen (alltid vid en densitet av 1 x 10 8 celler / ml) och andra reagens proportionellt i det första steget (3.1.1 och 3.2.1). Justera reagensvolymer i alla senare steg därefter. Till exempel om att starta med 100 pl av mjälten cellsuspensionen vid 1 x 10 8 / ml, använd halv angivna reagensvolymer i alla steg.
- Isolering av Plasmacytoid DCs (PDC)
- Tillsätt 300 pl biotinmärkt antikropp cocktail ges i plasmacytoid DC isolering kit till 200 pl mjälten cellsuspensionen.
- Blanda väl och inkubera i isvattenbad under 15 min. Tryck på röret var 3 minuter för att hålla celler suspenderade, och för att maximera antikroppsbindning.
- Lägga 12 ml cellsortering buffert och pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 5 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten för att avlägsna obundna biotinylerade antikroppar.
- Resuspendera cellenpellet i 500 | il av cellsortering buffert. Tillsätt 300 ul av anti-biotin antikropp-konjugerade pärlor. Upprepa steg 3.1.2 och 3.1.3.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 2 ml cellsortering buffert. Utför alla steg från denna punkt vid RT med hjälp av förkyld buffertar.
- Placera en ny magnetisk aktiverad cellsortering LS kolumn i den magnetiska monter. Tvätta och jämvikta kolonnen med 5 ml cellsortering buffert.
- Pipettera cellsuspensionen på kolonnen, applicera den försiktigt till mitten av ytan av kolonnbädden. Samla flödet genom.
- Tvätta kolonnen med 10 ml av cellsortering buffert. Samla detta flöde genom och kombinera med flödet genom från steg 3.1.7. De pDCs anrikas i denna kolumn flödet genom (FT1).
- Pellets cellerna från FT1 genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C, återsuspendera i 2 ml cellsortering buffert och passera cellerna genom en färsk LS-kolonngenom att upprepa steg 3.1.6 - 3.1.8. Denna användning av två på varandra följande kolumner ger förbättrad renhet av isolerade celler.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C, och återsuspendera med 2 ml fullständigt RPMI. Placera på is tills det behövs.
- Isolering av CD8a Pos och CD8a Neg DC
Obs: Det första steget i detta förfarande är utarmning av B, PDC, T- och NK-celler.- Med början med hela mjältcellsuspensionen (1 ml av 10 8 celler / ml som erhållits i steg 2,8), tillsätt 100 pl av biotin-konjugerad antikropp cocktail anordnad i CD8a Pos DC-isoleringskit.
- Blanda väl och inkubera i isvattenbad under 15 min. Knacka röret försiktigt var 3 minuter för att maximera bindning av biotinmärkta antikroppar mot sina målceller.
- Lägga 12 ml cellsortering buffert och pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Aspirera supernatant att avlägsna obundna biotinylerade antikroppar.
- Tillsätt 150 pl cellsortering buffert och 100 ul anti-biotin pärlor som finns i CD8a Pos DC isolering kit. Blanda väl och inkubera i isvattenbad under 15 min.
- Tillsätt 10 ml cellsortering buffert och pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Resuspendera celler i en ml cellsortering buffert och passera över en ny LS kolonn enligt proceduren i steg 3.1.6 till 3.1.8.
- Samla omärkta flödet genom två (FT2) och kassera kolumnen retentatet. Detta omärkta fraktion anrikad på CD8a Pos och CD8a Neg DC.
- Pellets cellerna i FT2 genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Resuspendera cellerna i 1 ml cellsortering buffert och tillsätt 200 pl anti-CD8a konjugerade magnetiska pärlor som finns i CD8a Pos DC isolering kit.
- Repäta steg 3.2.2 genom 3.2.6. Flödet genom av kolonnen är berikad för CD8a Neg DCs och utarmat för CD8a Pos DC: er. Detta är märkt flöde genom tre (FT3).
- Att eluera CD8a Pos DC kvar i kolonnen, ta bort kolumnen från magneten, tillsätt 5 ml cellsortering buffert och rensa kolonnmatrisen med hjälp av kolven försedd med LS kolumnen.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 ml cellsortering buffert. För att öka renheten, kör de eluerade cellerna igen genom en ny LS kolumn genom att upprepa steg 3.1.6 till 3.1.8, utom kasta flödet genom och samla balanserade celler som i 3.2.11.
- Att rena CD8a Neg DCs från FT3 suspensionen, pelletera FT3 genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera i 300 pl cellsortering buffert.
- Tillsätt 100 pl av anti-CD11c magnetiska pärlor. Blanda väl och inkubera i isvattenbad under 15 min.
- Tillsätt 10 ml cellsorteringsbuffert och pelletceller genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Upprepa steg 3.1.5 till 3.1.8. CD8a Neg DCs är positivt väljs med CD11c pärlor och binds till kolonnen. Flödet genom kan kasseras.
- Eluera cellerna kvarhållna i kolonnen såsom beskrivs i steg 3.2.11 för att samla in den renade CD8a Neg DCs.
4. Pulserande APC med antigener och Cell Transfer
- Räkna levande celler efter rening med användning av trypanblått uteslutning 21 för att skilja levande och döda celler.
- Inkubera cellerna med antigenet av val. Använd analoger av glykolipid antigen som kallas alfa-galaktosyl ceramid (αGalCer) vid 100 nM koncentration 13. Vanligtvis plattan 10 6 livskraftiga celler / brunn i komplett RPMI-medium med hjälp av extremt låg attachment U-bottnade plattor med 96 brunnar för att minimera cellvidhäftning. Inkubera cellerna i en 5% CO2 atmosfär vid 37 ° C under 1-4 h.
- Harvest celler genom att försiktigt pipettera flera gånger. Använd breda hålet pipettspetsar för att minimera cellskada från skjuvkrafter. Tvätta brunnarna med PBS och pool dessa tvättar för att maximera cellskörd.
- Pelletera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera till önskad densitet i PBS. Typiskt injicera 1 miljon celler i 200 | j, l per mottagardjuret. Håll celler på is för att maximera lönsamheten före administrering till värddjur.
- Injicera celler intravenöst i möss antingen genom lateral svan förgäves eller retro-orbital venös plexus 19. Använd en 27 G-nål på en 1 ml spruta, och injicera en maximal volym av 0,1 ml per mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatet av detta förfarande är beroende på utbyggnaden av DC delmängder av murin Flt-3L uttrycktes av de implanterade melanomceller. Den B16.Flt3L tumör erhölls från en C57BL / 6 mus, och bör implanteras i djur med denna stam bakgrund för att undvika fel i tumören att etablera på grund av avslag. I vissa fall kan det vara önskvärt att använda genetiskt modifierade möss för att härleda DC: er med kända defekter i signalvägar eller receptorer av intresse. Det är viktigt att komma ihåg att tumören kan utvecklas med olika kinetik i sådana djur, så det är viktigt att följa tumörtillväxt baserat på utseende och palpation vid ympning platsen. I vår erfarenhet, när tumören är påtaglig, den B16.Flt3L tumörbärande möss visar genomgående en markant ökning i mjälten cellularitet som korrelerar med expansionen av alla DC delmängder (Figur 2A). Vi ser vanligtvis en 2- till 3-faldiga increase i det totala antalet splenocyter erhållna från B16.Flt3L melanombärande möss jämfört med naiva djur. Ökningen av antalet DC delvis bidrar till den skenbara minskning av frekvensen av B-celler, medan det finns liten eller ingen förändring i det absoluta antalet B-celler. Intressant, medan en stor expansion (~ 15- till 20-faldig ökning i absoluta tal) observeras för konventionella DC i dessa möss, det finns bara en blygsam ökning (cirka 4-faldig) observerades i plasmacytoid DC delmängd.
Grindningsstrategi för att identifiera olika DC delmängder visas i fig 2A och är baserad på uttrycket av B220, CD11b, CD11c och CD8a som subset specifika fenotypiska markörer (figur 2b). Vi undersökte också DEC205, CD11b och mPDCA1 uttryck på dessa delmängder som visas i figur 2B. Detta visar det förväntade mönstret, med mPDCA endast på PDC delmängd, medan december 205 uttrycks starkt på CD8a Pos DC och CD11b upptäcks mest framträdande på CD8a Neg DC. Vi analyserade även de förändringar i cell frekvenser för var och en av de undergrupper renade vid varje steg av det protokoll som beskrivs här (sammanfattade i figur 2C, med detaljerade exempel på de flödescytometriska data i Figur 3). Isoleringen av mjält-DC delmängder beskrivs i denna metod är ett förfarande i flera steg (Figur 1). Rening av plasmacytoid DC bygger på negativ selektion för att berika dessa celler efter utarmning av alla oönskade populationer som B, T, NK-celler och konventionella DC. Rening av CD8a Pos DCS- och CD8a Neg DCs utförs genom positiv selektion av dessa celler efter utarmning av T, B och NK-celler. Den höga renheten av vardera av de DC-delmängder erhållits med användning av denna procedur (typiskt ~ 95%) visas också i figur 3.
ve_content. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Beroende på experiment som ska utföras, kan dessa celler vara pulsad med en önskad antigen och överfördes till histokompatibla murina värdar för immunologiska studier Dessutom är dessa celler kan också användas för in vivo-studier av stimulerande eller tillsynsverksamhet fysiologiska DC delmängder. cell~~POS=TRUNC avkastning för de renade DC delmängder per 2 x 10 7 totalt splenocyter är cirka en miljon pDCs, 2.000.000 CD8a Pos DC och 4.000.000 CD8a Neg DC.
Figur 1. Isolering av DC. En schematisk illustrerar de olika stegen i protokollet för isolering av olika undergrupper av DC. Klicka här för att se en större version av denna siffra. >
Figur 2. Analys av Mjält DC delmängder i möss med B16.Flt3L tumörer. A) gating strategi illustreras att identifiera de cellpopulationer som motsvarar pDCs (R1), CD8a Pos DCS (R5) och CD8a Neg DCS (R6). B) Uttryck av mPDCA1, 33D1, DEC205 och CD11b på olika undergrupper. De celler som ingår i grinden R4 (en underuppsättning av lymfocyter, som är negativa för B220, CD11c, CD11b) används som en kontrollpopulation som saknar uttrycket av dessa markörer C) Relativ anrikning av DC och lymfocytundergrupper som isolerats från mjältarna hos möss vid dag. 14 efter ympning av B16.Flt3L melanomceller visas i den vänstra tomt som svarta fält, medan frekvensen av dessa cellpopulationer i naiva möss visas som vita staplar. Rätt tomten visar samma data som cellantal.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53824/53824fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av Mjält DC delmängder Under anrikning protokollet. A) Anrikning av plasmacytoid DCs (B220 Höga och CD11c låg, R1) från 10% i utgångspopulation av splenocyter från B16.Flt3L tumörbärande möss till ~ 95% renhet i kolumn flöda genom 1. Notera att retentatvätskeflöden celler eluerades från denna kolonn utarmas av denna population. B) Anrikning av konventionella DC (i CD11c hög, blandning av CD8a positiv och negativ) från ~ 33% i mjälten hos B16.Flt3L melanom bärande möss på dag 10 efter tumörimplantation till ~ 78% i flödet genom två fraktionen. I kolumnen retentatet 2 tomter, de CD11c positiva populationer verkar vara partiallierad uttömda, vilket motsvarar avlägsnandet av ett stort antal DC under negativ selektion att tömma T, B och NK-celler. Ytterligare fraktionering av flödet genom två suspension med användning av positiv selektion med avseende på anti-CD8-bindande utbyten> 95% renhetsgrad CD8a Pos DCs. Flödet genom från detta utsattes sedan för positiv selektion för bindning av anti-CD11c, vilket gav en population av> 95% ren CD8a Neg DC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendritiska celler är accepterade för att vara den stora professionella antigenpresenterande celler som är involverade i primning av T-cellssvar. Deras huvudsakliga funktion är att kartlägga vävnaden mikro genom att ta upp och bearbeta antigener för presentation till T-celler. För att studera funktionen av specifika DC delmängder, dessa måste isoleras i tillräckligt antal med hjälp av en metod som bibehåller sin normala fenotyp och funktioner. De flesta protokoll förlitar sig på isolering av specifika DC delmängd från naiva möss. Eftersom dessa celler är sällsynta, de isoleringsförfaranden är inte effektiva och ger lågt antal celler. Till exempel kommer en mjälte ge endast ca 0,5 till 1000000 CD8 pos DC: er, medan de flesta experiment utförda med överförings studier använder åtminstone detta antal celler per djur. Således är en stor begränsning av de befintliga metoderna oförmågan att isolera tillräckligt cellantal utan att använda ett mycket stort antal av donatormöss och betydande volymerav reagens. Vår metod väsentligt övervinner dessa problem genom att använda möss implanterade med en Flt-3L utsöndrar tumör att kraftigt expandera DC, tillåter rening av mycket större antal av de tre välkänd DC delmängd med hjälp av en serie av immunomagnetiska reningssteg. Protokollet som beskrivs här tillhandahåller därför en stor förbättring jämfört med existerande metoder i termer av utbyten av åtminstone flera gånger.
Några varningar finns för isolering protokoll som beskrivs här. Den viktigaste begränsningen är att det förfarande som används för isolering av dessa celler kan oavsiktligt ändra deras fenotyp. DCs är utomordentligt känsliga för föroreningar endotoxin och mekaniska stimuli som kan leda till förändringar i deras fenotyp och funktion. En annan begränsning med denna teknik är beroendet av Flt-3L sekre att expandera DC delmängder. Detta resulterar i avsaknaden av expansion i vävnads bosatta DC delmängder som inte uttrycker den Flt-3-receptorn.
DeProtokollet som beskrivs här bygger på cell berikning med kommersiellt tillgängliga reagens. Satsen för isolering av cellrening kommer med ett protokoll som innehåller de rekommenderade mängder reagens som skall användas. Cellkomposition av tumörbärande möss skiljer sig dramatiskt från den för naiva möss (figur 2C), och därför har vi modifierat beloppen för reagens som används i vår teknik för att uppnå optimal cell renhet. DCS är vidhäftande celler och kan binda till kolonnmatrisen ospecifikt. Ekvilibrering av kolonnen sängen med buffert innehållande EDTA minimerar cellvidhäftning, och användningen av seriepassage över två på varandra följande kolumner förbättrar cell renhet ytterligare.
DC är mycket vidhäftande celler och in vivo är i allmänhet nära förknippad med den extracellulära vävnadsmatrisen. I syfte att öka utbytet, är det mycket viktigt att smälta mjälten vävnaden med kollagenas och DNas under tillräcklig time för att extrahera ett maximalt antal av dessa celler. Det är också viktigt att vara säker på att mjälten vävnadsfragment är helt nedsänkt i kollagenas / DNas I lösning under pågående matsmältningen. En annan viktig funktion av DC isolering är att upprätthålla strikt sterilitet och endotoxin fria förhållanden under isoleringsförfarandet, eftersom dessa celler är mycket endotoxin lyhörd. Använd nyberedda reagenser från endotoxinfritt lager och filter sterilisera alla reagenser före användning. Alla cellisolerings buffertar och medier bör kompletteras med FCS som är godkänt för att vara fri från detekterbar endotoxin. Dessa celler är också mycket känsliga för mekanisk stimuli och upprepad mekanisk stimulering kan förändra mognadstillståndet hos dessa celler. Det krävs en del mekanisk kraft för att tvinga vävnaden genom en cell sil efter kollagenas matsmältning, bör detta ske så försiktigt som möjligt. Dessutom bör kraftig pipettering av cellerna skall undvikas så mycket som possible, och bred urborrning pipettspetsar bör användas för att minimera skjuvkrafter.
Adoptiv överföringsmodell är användbar för undersökning av antigenpresentation och T-cell priming av specifika delmängder av DC. Emellertid har det visats i andra studier att överföringen av antigen kan uppstå från antigen pulsad DC till endogena DC. Således kan det adaptiva immunsvaret initieras av antigenpulserade celler reflekterar presentation av endogena DC presenterar den "infångade" antigen och inte det av överförd APC. Denna typ av överföring exponentiellt ökas om de isolerade DC preparat innehåller döda eller döende celler. Det är därför viktigt att utföra DC isolering och överföringsprotokollet så snabbt som möjligt, med användning av sterila betingelser med i förväg kyld buffertar för att öka cellöverlevnad. Vi valde en relativt kort antigenpulsningsperiod av 4 h av denna anledning, med inkubation i låga bindningscellodlingsplattor för att minimera cellvidhäftning underdetta steg. Dessutom kan förlängas odlingsbetingelser förändra mognadsstatus odlade DC, och kan påverka resultatet av adoptiv överföring experiment 22.
Sammanfattningsvis är dendritiska cellbiologi ett mycket aktivt forskningsområde, och utveckling av en tillförlitlig metod för att generera DC som troget speglar deras in vivo fenotypiska och funktionella skillnader ger en enorm möjlighet att studera dessa celler. Detta blir särskilt viktigt för studier med kemikalier som kan modulera DC funktioner men kan inte administreras systemiskt i djurmodeller. Behandla de isolerade DC delmängder av intresse ex vivo med dessa kemikalier är en praktisk och möjlig lösning som kan hjälpa belysa mekanistiska detaljerna i antigenpresentation vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NIAID bidrag AI45889 till SAP Flödescytometri studier genomfördes med hjälp av FACS kärnanläggningar som stöds av Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) och Centrum för AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (dry powder) | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof ethanol | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Used to prepare 70% ethanol |
| RBC lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| DMEM medium with L-glutamine | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM non-essential amino acids | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM essential amino acids | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution | Life Technologies | 15575-020 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fetal calf serum | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (dry powder) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0.08% with PBS |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8αPos mouse DC isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml syringes | BD | 26048 | |
| 23 G1 needle | BD | 305145 | |
| 100 mm Petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| Surgical instruments | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| Cell strainer (70 µm) | BD | 352350 | |
| Large Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm)) | Corning | 431097 | |
| LS columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Magnetic stand MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μl pipette tips | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning ultra-low attachment 96-well plates | Corning | CLS3474-24EA | |
| 6-8 week old female C57BL/6 mice | Jackson Research Laboratories, Jax | ||
| Murine B16.Flt3L melanoma cell line | described by Mach et al., 2000 | ||
| Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M) |
Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system. | ||
| Complete RPMI and DMEM media | Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media. | ||
| MACS buffer | Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody). | ||
| FACS staining buffer | Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer | ||
| 10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml. |
This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use. |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Dudziak, D., et al. Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo. Science. 315 (5808), 107-111 (2007).
- Belz, G. T., Nutt, S. L. Transcriptional programming of the dendritic cell network. Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).
- den Haan, J. M., Bevan, M. J. Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo. J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).
- Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).
- Yamazaki, S., et al. CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).
- Mukherjee, G., et al. DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1. Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).
- Melief, C. J. Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming. Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Benlagha, K., Bendelac, A. CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity. Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Arora, P., et al. A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens. Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).
- Semmling, V., et al. Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs. Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).
- Duriancik, D. M., Hoag, K. A. The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis. Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).
- Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).
- Mach, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).
- Vremec, D., Segura, E. The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen. Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Vremec, D., et al. Maintaining dendritic cell viability in culture. Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).
